第三章酶的分離純化

1、Chapter 3 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme酶的分離純化酶的分離純化制作：鄭穗平Contents of chapter 31、酶的提取與分離純化技術路線2、細胞破碎3、酶的提取4、酶的分離方法GoGoGoGo5、酶的組合分離純化策略Go6、酶的濃縮、干燥與結晶Go細胞結構與酶分布3.1 3.1 酶的提取、分離純化技術路線酶的提取、分離純化技術路線細胞破碎細胞破碎酶提取酶提取酶分離純化酶分離純化酶濃縮酶濃縮酶貯存酶貯存動物、植物或微生物細胞動物、植物或微生物細胞發(fā)酵液發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離心分離，過濾分

2、離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結晶分離等。取分離，結晶分離等。酶酶的純化過程，約可分為的純化過程，約可分為三三個階段個階段：(1) (1) 粗粗蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) (crude (crude protein): protein): 采樣采樣 均均質(zhì)質(zhì)打破細胞打破細胞 抽出全蛋白，抽出全蛋白，多使用多使用 鹽鹽析析沉淀沉淀法法；可；可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。物質(zhì)。(2) (2) 部分純化部分純化 (partially purified): (partially purified): 初步的純化，使用各鐘初步的純化，使用各鐘 柱柱層層析法

3、析法。(3) (3) 均均質(zhì)酶質(zhì)酶 (homogeneous): (homogeneous): 目標酶目標酶的的進進一步精制純化，可用一步精制純化，可用制備制備式式電泳電泳 或或 HPLCHPLC。酶分離純化不同階段本章目錄3.2 細胞破碎細胞破碎許多酶存在于細胞內(nèi)。許多酶存在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細胞進行破首先需要對細胞進行破碎處理。碎處理。1）機械破碎）機械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化學破碎）化學破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超聲波超聲波細胞粉碎機細胞粉碎機細胞破碎珠細胞破碎珠高壓細胞破碎機高壓細胞破碎機DY89-I型型 電動玻璃勻漿

4、機電動玻璃勻漿機機械破碎搗碎法研磨法勻漿法 物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法 化學破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產(chǎn)生的剪切通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎。力，使組織、細胞破碎。通過各種物理因素的作用，通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結構破使組織、細胞的外層結構破壞，而使細胞破碎。壞，而使細胞破碎。通過各種化學試劑對細胞通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使加酶制劑的催化作用，使細胞外層結構受

5、到破壞，細胞外層結構受到破壞，而達到細胞破碎而達到細胞破碎細胞破碎方法及其原理細胞破碎方法及其原理本章目錄l酶的提取是指在一定的條件下，用適當?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。l酶提取時首先應根據(jù)酶的結構和溶解性質(zhì)，選擇適當?shù)娜軇┟傅慕Y構和溶解性質(zhì)，選擇適當?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。l酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進行提取水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質(zhì)結合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。 3.3 3

6、.3 酶的提取酶的提取提高溫度，降低溶液粘度、增加擴散面積、縮短擴散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴散速度，從而增大提取效果。 為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。酶的主要提取方法酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.020.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結合牢固或含有較多非極性基團的酶大多數(shù)

7、蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象鹽溶現(xiàn)象。 本章目錄3.4 酶的分離方法酶的分離方法1、沉淀分離2、離心分離3、過濾與膜分離4、層析分離GoGoGoGo5、電泳分離Go6、萃取分離Go本章目錄1 1、沉淀分離、沉淀分離沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度溶解度降低降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術過程。沉淀分離方法分離原理 鹽析沉淀法鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點沉淀法等電點沉淀法利用兩

8、性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離在鹽濃度達到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象鹽析現(xiàn)象。 在一定的溫度和pH值條件下（為常數(shù)），通過改變離子強度使不同的酶或蛋白

9、質(zhì)分離的方法稱為KsKs分段鹽析分段鹽析；而在一定的鹽和離子強度的條件下（KsI為常數(shù)），通過改變溫度和pH值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法，稱為分段鹽析分段鹽析。 在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。然而用硫酸銨進行鹽析時，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時也用其它中性鹽進行鹽析。在鹽析時，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度飽和度表示。 有機溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機溶劑的存在會使溶液

10、的介電常數(shù)降低。例如，20時水的介電常數(shù)為80，而82乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時，對于具有水膜間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時，對于具有水膜的分子來說，有機溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破的分子來說，有機溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分離的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等常用于酶的沉淀分離的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等 本節(jié)目錄2 2、離心分離、離心分離 離心分離是借助

11、于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術過程。 在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。常速離心機又稱為低速離心機常速離心機又稱為低速離心機, 其最大轉(zhuǎn)速在8000 r/min以內(nèi)，相對離心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。也用于酶的結晶等較大顆粒的分離。 高速離心機高速離心機的最大轉(zhuǎn)速為（12.5）104 r/min ，相對離心力達到 11041105 g ，在酶的分離中主要用于沉淀、細胞碎片和細胞器等的分離。為了防止高速離心過程中

12、,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速有些高速離心機裝設有冷凍裝置離心機裝設有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機。謂之高速冷凍離心機。超速離心機超速離心機的最大轉(zhuǎn)速達 (2.512)104 r/min，相對離心力可以高達 5105 g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。超速離心機按照其用途可以分為制備制備用超速離心機用超速離心機、分析用超速離心機分析用超速離心機和分析分析- -制備兩用超速離心機制備兩用超速離心機3種 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子在分子在離心離心時，時，其其 分子量、分子密度分子量、分子密度、組

13、成組成、形形狀狀 等，均等，均會會影響影響其沉降速率，其沉降速率，沉降沉降係係系數(shù)系數(shù) 即用來描述此沉即用來描述此沉降降性質(zhì)性質(zhì)； 其其單位為單位為 S (Svedberg unit)。每一每一種種的沉降的沉降系數(shù)與系數(shù)與其其分子密度或分子量成正分子密度或分子量成正比。比。 不同沉降不同沉降系數(shù)系數(shù)的的蛋蛋白質(zhì)白質(zhì)，可利用超高速，可利用超高速離離心心法，在密度梯度中作法，在密度梯度中作分離。分離。本節(jié)目錄3 3、過濾與膜分離、過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術過程。過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)

14、需要選用。過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì) 膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì)膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì) 過濾的分類及其特性過濾的分類及其特性( (根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同 ) ) 類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾粗濾 2m酵母、霉菌、動物細胞、植物細胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結金屬等微濾微濾0.22m細菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾超濾200.2m病毒、生物大分子等超濾膜反滲透反滲透20 (40,000) 壓力差，100kPa 篩分 超濾UF 120 (10

15、,000-40,000) 壓力差，100kPa 篩分 納濾NF 1 (1001000) 壓力差，100) 壓力差，1000kPa 優(yōu)先吸附、溶解擴散 四種常用膜分離技術的基本特征四種常用膜分離技術的基本特征 四種常用膜分離過程的截留特性四種常用膜分離過程的截留特性本節(jié)目錄4 4、層析分離、層析分離層析技術，亦稱色譜技術，是一種物理的分離方法。它是利利用混合物中各組分的物理化學性質(zhì)的差別，使各組分以不同用混合物中各組分的物理化學性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的( (稱為固定相稱為固定相) )，另一個相則流過此固定相另一個相則流

16、過此固定相( (稱為流動相稱為流動相) )并使各組分以不同速并使各組分以不同速度移動，從而達到分離度移動，從而達到分離。層析分離方法層析分離方法 層析方法分離依據(jù)吸附層析吸附層析利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力親和力不同而達到分離目的凝膠層析凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離親和層析親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的專一而又可逆的親

17、和力親和力，使生物分子分離純化層析聚焦層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性等電點特性與離子交換層析的特性結合在一起，實現(xiàn)組分分離吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術中應用最早的技術。吸附劑來源豐富、價格低廉、可再生，吸附設備簡單。吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱吸附層析柱。層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當樣品液全部進入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸在洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。附、再解吸、再吸附的過程。 溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫

18、法 分配層析分配層析分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。分配系數(shù)分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質(zhì)在兩項溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為流動相流動相。當某溶質(zhì)在流動相的帶動流經(jīng)固定相時，該溶質(zhì)在兩相之間進行連續(xù)的動態(tài)分配。 紙上層析紙上層析分配薄層層析分配薄層層析分配氣相層析分配氣相層析 離子交換層析是利用離子交換劑上

19、的可解離基團（活性基團）對可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分各種離子的親和力不同而達到分離離目的的一種層析分離方法。離子交換劑離子交換劑是含有若干活性基團的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團（活性基團）而制成。按活性基團的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑陽離子交換劑和陰陰離子交換劑離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進行酶的分離純化。 凝膠層析又稱為凝膠過濾凝膠過濾，分子排阻層分子排阻層析析，分子篩層析分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)

20、分離的一種層析技術。凝膠層析柱中裝有多孔凝膠多孔凝膠，當含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進出于一個個顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小小分子物質(zhì)向下移動的速度比大分子的速分子物質(zhì)向下移動的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層對分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的析柱，而達到分離的目的。常用的凝膠：葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺

21、凝膠聚丙烯酰胺凝膠 親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術。酶與底物酶與底物,酶與競爭性抑制劑酶與競爭性抑制劑,酶與輔酶與輔助因子助因子,抗原與抗體抗原與抗體，酶酶RNARNA與互補的與互補的RNARNA分子或片段分子或片段,RNARNA與互補的與互補的DNADNA分子分子或片段或片段等之間等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對。故此,親和層析在酶的分離純化中有重要應用.親和層析的四個要素親和層析的四個要素常用的親和介質(zhì)及專一性配體根據(jù)欲分離組分與配基的結合特性,親和層析可以分為：共價親和層析共價親和層析疏水層析疏水層析金屬離子親和層析

22、金屬離子親和層析免疫親和層析免疫親和層析染料親和層析染料親和層析凝集素親和層析凝集素親和層析 疏水層析與反相層析的基本原理疏水層析與反相層析的基本原理本節(jié)目錄5 5、電泳分離、電泳分離帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。動的過程稱為電泳。電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為： 紙電泳紙電泳 薄層電泳薄層電泳 薄膜電泳薄膜電泳 凝膠電泳凝膠電泳 自由電泳自由電泳 等電聚焦電泳等電聚焦電泳 顆粒在電場中的移動速度主要決定于其本身本身所帶的凈電荷量所帶的凈電荷量，同時受顆粒形狀顆粒形狀和顆粒大顆粒大小小的影響。此外，還

23、受到電場強度電場強度、溶液溶液pH值值、離子強度離子強度及支持體的特性支持體的特性等外界條件的影響。 制備式電泳通常以不含制備式電泳通常以不含 SDS SDS 的原態(tài)的原態(tài) disc-PAGEdisc-PAGE 進行，以便回收進行，以便回收具有活性的蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)樣本要先經(jīng)過部分純化，否則效果不具有活性的蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)樣本要先經(jīng)過部分純化，否則效果不佳，并先以分析式電泳確定所要色帶的位置。佳，并先以分析式電泳確定所要色帶的位置。本節(jié)目錄6 6、萃取分離、萃取分離萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個液相。有時也可采用其它流體。按照兩相的組成

24、不同，萃取可以分為：有機溶劑萃取有機溶劑萃取雙水相萃取雙水相萃取超臨界萃取超臨界萃取反膠束萃取反膠束萃取 各種雙水相系統(tǒng)各種雙水相系統(tǒng)聚合物P 聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉某些超臨界流體的超臨界點和超臨界密度某些超臨界流體的超臨界點和超臨界密度流體名稱臨界溫度()臨界壓力(Mpa)臨界密度（g/ml）乙烷C2H632.34.880.203丙烷C3H896.94.260.220丁烷C4H10152.03.800.228戊烷C5H12296.73.280.232乙烯C2H49.95.120.227氨NH3132.411.280.236二氧化碳 CO231.17.380.46二氧化硫 SO2157.67.880.525水H2O374.322.