細(xì)胞工程復(fù)習(xí)重點

1、第1章 細(xì)胞培養(yǎng)1、細(xì)胞系：原代培養(yǎng)經(jīng)首次傳代成功后即成細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。2、細(xì)胞株：通過選擇法或克隆形成法，從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。細(xì)胞株的這種特定性或標(biāo)志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。3、傳代：體外培養(yǎng)細(xì)胞生長增殖達到一定密度后，需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液（培養(yǎng)基），這一過程叫傳代。4、基本條件：無菌無毒、營養(yǎng)需要、生長環(huán)境（pH值、溫度、滲透壓）5、設(shè)備：環(huán)境（無菌實驗室、凈化工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、CO2罐） 儲存（液氮儲存罐、液氮運輸罐、超低溫冰箱） 處理（倒置顯微鏡、離心機、高壓蒸汽消毒器、干燥箱、高溫烤箱）6、培養(yǎng)基

2、必須具備的基本條件： 營養(yǎng)物質(zhì)、緩沖能力、等滲性、無菌7、 生長狀態(tài)指標(biāo)： 細(xì)胞生長曲線&生長倍數(shù)、細(xì)胞分裂指數(shù)、細(xì)胞接種存活率、克隆形成率8、 細(xì)胞生長曲線：接種培養(yǎng)計數(shù)制圖； 曲線近似“S”形，潛伏期對數(shù)生長期平臺期； 生長曲線反映的是某一特定培養(yǎng)條件下的細(xì)胞增殖規(guī)律。第2章 腫瘤細(xì)胞1、 癌基因的產(chǎn)物：原癌基因的產(chǎn)物主要包括：生長因子，如sis，生長因子受體，如fms、erbB，蛋白激酶及其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分，如src、ras、raf，細(xì)胞周期蛋白，如bcl-1，細(xì)胞凋亡調(diào)控因子，如bcl-2，轉(zhuǎn)錄因子，如myc、fos、jun。2、 原癌基因的描述判斷：原癌基因是細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因

3、，是維持機體正常生命活動所必須的，在進化上高等保守。當(dāng)原癌基因的結(jié)構(gòu)或調(diào)控區(qū)發(fā)生變異，基因產(chǎn)物增多或活性增強時，使細(xì)胞過度增殖，從而形成腫瘤。3、 P53基因描述：轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；使癌細(xì)胞凋亡，防止癌變；還具有幫助細(xì)胞基因修復(fù)缺陷的功能。4、 腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性： 形態(tài)和性狀（形態(tài)不規(guī)則，界限清晰，伸展較差，核膜、核仁輪廓明顯，核仁多、核漿豐富|折光性強，表面微絨毛多） 生物特性（營養(yǎng)要求不高，自分泌促增長因子，生長方向性消失、失去接觸抑制，細(xì)胞倍增周期短） 永生性、侵潤性、異質(zhì)性、細(xì)胞遺傳性。第3章 污染控制、冷凍保存1、 細(xì)菌、真菌污染的控制：過濾除菌（0.22 m）、抗生素（預(yù)防

4、用藥：雙抗生素-青霉素，鏈霉素，真菌：兩性霉素B；污染后清除用藥（在污染早期可能有效）：需采用大于常用量5-10倍的沖洗法，于加藥后作用24-48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。）2、支原體污染的用藥控制：抗生素（Cip，BM-1+BM-2，M-plasmocin）方便經(jīng)濟有效、加溫處理、支原體特異的抗血清3、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的方法步驟：凍存：常規(guī)技術(shù)消化并收集細(xì)胞于離心管中離心；去上清，逐滴加入4預(yù)冷的凍存液，輕輕重懸細(xì)胞后，均勻分裝于凍存管中，做好標(biāo)記；盡快將凍存管裝于紗布袋中，懸于液氮液面上方或低溫冰箱（-70）過夜；次日轉(zhuǎn)入液氮中。復(fù)蘇：從液氮罐中取出凍存管迅速放入38 水浴中，并不時搖動，在1分

5、鐘內(nèi)使細(xì)胞完全融化無菌條件下逐滴轉(zhuǎn)移至加有適量培養(yǎng)液的離心管中根據(jù)細(xì)胞的要求離心，棄上清加入適量培養(yǎng)液，輕輕重懸細(xì)胞，接種培養(yǎng)過夜（接種濃度一般106/ml）次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，并觀察生長情況。第4、 五章 1、 病毒感染細(xì)胞測定方法：檢驗標(biāo)本殺滅雜菌（青、鏈霉素）檢測病毒的存在：接種易感的動物出現(xiàn)病狀； 雞胚病變或死亡； 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞病變鑒定病毒種型（血清學(xué)方法）。 繁殖指征 （1）細(xì)胞致病作用（Cytopathic effect, CPE） （2）紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象（Hemadsorption phenomenon） （3）干擾現(xiàn)象（Interference phenomenon） （4

6、）包涵體（Inclusion body）形成（5）代謝生長抑制（Growth inhibition）（6）細(xì)胞轉(zhuǎn)化、出現(xiàn)“轉(zhuǎn)化灶”（Transformation）二、免疫酶染色法1、 病毒感染細(xì)胞的檢測方法：免疫酶染色法：鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)（SABC法）；靈敏性高，對比度佳。2、免疫酶染色法原理Step 1：特異性第一抗體+組織細(xì)胞標(biāo)本共孵育；Step 2：通過生物素化第二抗體與第一抗體結(jié)合；Step 3：借助親和素與生物素的天然親和性，將多個生物素化辣根過氧化酶連接為一個ABC復(fù)合物；Step 4：復(fù)合物中親和素結(jié)合二抗上的生物素，介導(dǎo)ABC復(fù)合物結(jié)合到抗原抗體復(fù)合物上

7、。加入顯色底物后，通過酶促反應(yīng)，顯示組織細(xì)胞相應(yīng)的抗原。3、 免疫酶染色法主要材料： （1）磷酸鹽緩沖液洗滌 （2）Tris-HCl緩沖液-配制底物溶液 （3）底物溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）-顯色 （4） ABC試劑盒（二抗+ABC復(fù)合物）-包含所需的專用試劑 （5）抗體（一抗）-結(jié)合標(biāo)本中特定的抗原 （6）器材4、 基本步驟：細(xì)胞準(zhǔn)備與固定過氧化氫處理PBS振洗封閉一抗標(biāo)記振洗+二抗標(biāo)記振洗+ABC復(fù)合物振洗細(xì)胞核襯染逐級脫水透明封片5、 注意事項：對照設(shè)置、DAB顯色、封片與脫水二、傳代細(xì)胞生長過程的分期：游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）三、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征及檢測方法1、特征：遺傳性狀改變

8、2、檢測方法：四氮唑鹽（MTT）比色法（細(xì)胞活性）、流式細(xì)胞術(shù)（測定DNA合成）、3H-TdR摻入法、PCR、細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測定法（考馬斯亮藍測定法）、細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的3H-亮氨酸摻入實驗第6、 七章 細(xì)胞調(diào)亡、大規(guī)模培養(yǎng)1、 細(xì)胞壞死概念：細(xì)胞非正常死亡，由于細(xì)胞內(nèi)含物釋放到細(xì)胞外，導(dǎo)致炎癥。細(xì)胞壞死被認(rèn)為是因病理而產(chǎn)生的被動死亡。壞死細(xì)胞的膜通透性增高，致使細(xì)胞腫脹，細(xì)胞器變形或腫大，早期核無明顯形態(tài)學(xué)變化，最后細(xì)胞破裂。2、 細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)需要控制的要素： （1）動物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境：溫度、pH值；（2）營養(yǎng)成分；（3）溶解氧；（4）滲透壓等其他因素 天然培養(yǎng)基：優(yōu)點是營養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效

9、果良好；缺點是成分復(fù)雜、個體差異大、來源有限。 合成培養(yǎng)基：既能提供一個近擬于體內(nèi)的生存環(huán)境，又便于控制和提供標(biāo)準(zhǔn)化體外生存環(huán)境。 第8章 細(xì)胞融合1、 細(xì)胞融合劑： （1）仙臺病毒：凝血活性和唾液酸苷酶活性 優(yōu)點：適用范圍廣，病毒易培養(yǎng)。 缺點：制備困難、操作復(fù)雜、滅活病毒的效價差異大、實驗的重復(fù)性差、融合率低、病毒對細(xì)胞的生命活動產(chǎn)生干擾。 適用于動物細(xì)胞融合，用于實驗室研究。 （2）聚乙二醇：PEG分子具有輕微的負(fù)極性，與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，在質(zhì)膜之間形成分子橋，使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連,進而促使質(zhì)膜的融合。PEG能增加類脂膜的流動性。 優(yōu)點：融合成本低，勿需特殊

10、設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。 缺點：融合過程繁瑣，PEG可能對細(xì)胞有毒害。 （3）電融合法的優(yōu)點： 融合率高、重復(fù)性強、對細(xì)胞傷害小。 裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程。 免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強。2、 細(xì)胞融合的具體步驟：（1）細(xì)胞準(zhǔn)備：貼壁細(xì)胞，兩親本細(xì)胞混合培養(yǎng)；懸浮細(xì)胞，制成一定濃度的細(xì)胞懸浮液。（2）細(xì)胞融合：加融合劑于待融合細(xì)胞中，誘導(dǎo)融合。（3）雜種細(xì)胞選擇：利用選擇性培養(yǎng)基等，使親本細(xì)胞死亡，雜種細(xì)胞存活。（4）雜種細(xì)胞克?。簩x出的雜種細(xì)胞進行克隆，培養(yǎng)出所需要的無性繁殖系。3、細(xì)胞融合的意義：任何細(xì)胞都有可能

11、通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源，從而對物種資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。4、單克隆抗體的定義：由一個識別單一抗原決定簇（表位）的B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)與功能完全相同的同源抗體。優(yōu)點：以標(biāo)記抗體為特點的免疫學(xué)方法缺點：不能進行沉淀和凝集反應(yīng)免疫反應(yīng)：多抗優(yōu)于單抗；抗原鑒定,特異診斷：單抗優(yōu)于多抗5、 制備單克隆抗體的技術(shù)和過程：

12、 技術(shù)：細(xì)胞融合技術(shù)、融合細(xì)胞篩選技術(shù)、 過程：融合前的準(zhǔn)備工作 細(xì)胞融合 雜交瘤細(xì)胞的篩選 雜交瘤細(xì)胞的擴增、凍存和克隆化 單克隆抗體的大量制備 第9章 核移植，動物克隆第十章 轉(zhuǎn)基因動物與生物反應(yīng)器1、 轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器：2、 轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法：電穿孔法（簡單、效率較高）、顯微注射法（隨機，基因重排、易位、缺失或定點突變）、裸露DNA直接注射、磷酸鈣DNA共沉淀法（轉(zhuǎn)移效率低）、脂質(zhì)載體包埋法（效率高）、病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法3、 培育轉(zhuǎn)基因動物的方法：基因的顯微注射法、胚胎干細(xì)胞方法、反轉(zhuǎn)錄病毒法4、 乳腺生物反應(yīng)器：制備：（1）表達載體的構(gòu)建：啟動子調(diào)控元件選用動物乳蛋白基因啟動子元件

13、；（2）目的基因的選擇；（3）體外重組；（4）基因轉(zhuǎn)導(dǎo)；（5）胚胎移植；（6）鑒定優(yōu)點：產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、產(chǎn)品成本低、研制開發(fā)周期短、無污染、經(jīng)濟效益顯著問題：（1）外源基因在動物體內(nèi)的位點整合問題（2）乳蛋白基因表達組織特異性問題（3）目的蛋白的翻譯后修飾問題（4）轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物的分離和純化問題（5）轉(zhuǎn)基因的技術(shù)與方法問題 （6）倫理道德問題 第十一章 胚胎工程1、xy差別性別控制原理和依據(jù)： 原始生殖細(xì)胞 (Primordial germ cells，PGCs) :就是指能發(fā)育為精子或卵子的祖先細(xì)胞。在遷移過程中PGCs不斷分裂增殖，隨胎齡增長，性別發(fā)生分化，在雄性，生殖嵴演變?yōu)椴G丸，PGCs

14、形成精原干細(xì)胞，而后附著在生精細(xì)胞上皮進入精子發(fā)生過程；在雌性，生殖嵴演變?yōu)槁殉?，PGCs分裂形成卵母細(xì)胞 。生殖細(xì)胞經(jīng)過增殖期、生長期和成熟期,最終形成精子和卵子。睪丸的發(fā)生：若胚胎細(xì)胞的性染色體為XY時，Y染色體短臂上有睪丸決定因子，此因子使未分化性腺向睪丸發(fā)育卵巢的發(fā)生：若胚胎細(xì)胞的性染色體為XX時，則未分化性腺自然向卵巢方向分化2、 皮質(zhì)反應(yīng)與透明帶反應(yīng)：精卵融合時，誘導(dǎo)卵膜特性發(fā)生改變，可阻止第二個精子進入卵內(nèi)，這一機制稱為卵膜封閉。同時，激活后的卵胞漿排出的皮質(zhì)顆?？赏ㄟ^誘導(dǎo)透明帶反應(yīng)，也可以拒絕其他精子的通過。 皮質(zhì)顆粒胞吐，顆粒內(nèi)容物擴散至細(xì)胞表面和透明帶，阻止多精受精。3、體

15、外受精：體外受精是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)。它的基本原理是人工模擬體內(nèi)環(huán)境，包括營養(yǎng)、溫度、濕度、氣體、滲透壓、PH等，使卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的初級卵母細(xì)胞成熟，同時使精子獲能，完成受精。 過程： 1、卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng) （1）卵母細(xì)胞的采集 （2）卵母細(xì)胞的選擇 （3）卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)2、精子的獲能處理第一階段是脫出精子表面的抗原物質(zhì)和去能因子，增強了膜通透性。第二階段是精子細(xì)胞膜蛋白變化，即發(fā)生頂體反應(yīng)。方法：自然交配法、雌性生殖道、人工配制3、 體外受精常規(guī)體外受精技術(shù)、與分離精子相結(jié)合的體外受精技術(shù)（預(yù)選性別）、顯微受精技術(shù)4、受精卵的體外培

16、養(yǎng)發(fā)育阻滯：體外受精的早期胚胎在體外發(fā)育過程中，往往會停滯在某一階段不再發(fā)育，此現(xiàn)象稱之為發(fā)育阻滯。克服發(fā)育阻滯現(xiàn)象：一是改進培養(yǎng)液成分，二是利用體細(xì)胞共同培養(yǎng)體系5、 胚胎移植4、胚胎分割：將一枚胚胎用顯微手術(shù)的方法分割成兩份、四份，甚至八份，經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)，然后移植于受體中，以得到同卵雙生或同卵多生后代的技術(shù)特點:后代具有相同的遺傳物質(zhì)“克隆”胚胎:發(fā)育良好的,形態(tài)正常的桑椹胚或囊胚儀器：實體顯微鏡和顯微操作儀原理：根據(jù)卵裂球具有發(fā)育成為一個個體的全能性的特點注意事項：對囊胚階段的胚胎進行分割時，要將內(nèi)細(xì)胞團均等分割。胚胎分割的份數(shù)越多，操作的難度會越大，移植的成功率也越低。5、胚胎移植

17、（embryo transfer）也稱受精卵移植，是指一頭母畜（稱為“供體”）發(fā)情排卵并經(jīng)過配種后，在一定時間內(nèi)從其生殖道（輸卵管或子宮角）取出受精卵或胚胎，然后把它們移植到另外一頭與供體同時發(fā)情排卵、但未經(jīng)配種的母畜（稱為“受體”）的輸卵管或子宮角。這個來自供體的胚胎能夠在受體的子宮著床，并繼續(xù)生長和發(fā)育，最后產(chǎn)下供體的后代。胚胎移植的基本原則1.胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性n 供體和受體在分類學(xué)上的相同屬性n 動物生理上的一致性：受體和供體在發(fā)情時間上的同期性n 動物解剖位置上的一致性：空間環(huán)境的一致性2.胚胎的發(fā)育期限：必須處于周期黃體期內(nèi) 3.胚胎的質(zhì)量：胚胎必須是正常的，并在處理過

18、程中不受不良因素的影響胚胎移植的技術(shù)程序1.供體、受體的選擇2.超數(shù)排卵（促性腺激素）3 同步發(fā)情（前列腺素處理法：有溶黃體作用；孕激素處理法：造成人為黃體期；促性腺釋放激素和促性腺激素類）4.人工受精5.胚胎采集（胚胎沖洗液的配制：PBS、SOF；手術(shù)法收集胚胎：輸卵管沖胚：順向沖胚、逆向沖胚 子宮角沖胚，非手術(shù)法收集胚胎：二路法、三路法）6.胚胎的檢查與鑒定7.胚胎移植（手術(shù)法移植非手術(shù)法移植） 手術(shù)法移植（可綁定的動物）：輸卵管移植、子宮移植 對象：移植卵裂早期的胚胎 非手術(shù)法移植（牛胚胎移植）：用人工受精管，通過子宮頸進入子宮體，胚胎移植槍插入子宮角深部注入胚胎 胚泡階段：發(fā)情6-9天

19、8. 供體和受體的術(shù)后觀察及處理6、 胚胎冷凍 方法：常規(guī)冷凍法（2h內(nèi)）、一步冷凍法（脫水）、玻璃化法 冷凍劑：細(xì)胞內(nèi)液抗凍保護劑:常用低分子量可滲物質(zhì)，如甲醇、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(GLY)、二甲基亞砜(DMSO)等; 細(xì)胞外液抗凍保護劑:常用低相對分子質(zhì)量不可滲物質(zhì)，如半乳糖、蔗糖、海藻糖、聚蔗糖等。7、動物的性別控制是指通過人為干預(yù)，使動物按人們的愿望繁衍所需性別后代的技術(shù)。是指通過人為干預(yù)，使動物按人們的愿望繁衍所需性別后代的技術(shù)。 性別控制技術(shù)將成為胚胎工程中的一項配套技術(shù)，對各項生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用都具有重要的促進作用。 三種性別決定方法：1.性染色體與性別決定a

20、 雄性異配子型；b 雌性異配子型;c 雄性單倍性型。(1)雄性異配子型雄性異配子型中，雌性動物只產(chǎn)生一種類型的配子，雄性動物則產(chǎn)生兩種不同類型的配子，主要包括XY型和XO型。(2)雌性異配子型與雄性異配子型正好相反，其雄性動物只產(chǎn)生一種類型的配子，而雌性動物則產(chǎn)生兩種不同類型的配子，主要包括ZO型和ZW型。(3)雄性單倍性型動物沒有性染色體由卵細(xì)胞受精與否決定其性別。卵細(xì)胞不經(jīng)受精而行孤雌生殖直接發(fā)育的個體為雄性，卵細(xì)胞經(jīng)受精后發(fā)育而成的個體為雌性。 2. Y染色體性別決定區(qū)基因SRY 哺乳動物的Y染色體上有一個性別的遺傳控制因子，稱為睪丸決定因子 睪丸決定因子（TDF)是哺乳動物的染色體上的一個性別的遺傳控制因子。Y染色體性別決定區(qū)基因（SRY）性別決定是涉及多個基因的級聯(lián)調(diào)控過程3.環(huán)境對性別的影響第十二章 干細(xì)胞與組織工程1、定義：干細(xì)胞是具有自我更新和多項分化潛能的原始細(xì)胞，是機體的起源細(xì)胞，