生化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、生化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)生化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)人員： 趙樂(lè)，王康華，王凱，孔景浩,許瑤，王軒，王碩最熟悉 而又最而又最陌生陌生 血紅蛋白血紅蛋白的分離、純化，鑒定的分離、純化，鑒定和定量和定量試驗(yàn)報(bào)告單試驗(yàn)報(bào)告單實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果臨床意義實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?，掌握自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的步驟與方法；，掌握自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的步驟與方法；2,血紅蛋白的分離、純化、鑒定和定量的血紅蛋白的分離、純化、鑒定和定量的方法；方法；3,熟悉血紅蛋白分離提純的原理。熟悉血紅蛋白分離提純的原理。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理血紅蛋白概況血紅蛋白概況 血紅蛋白是紅細(xì)胞的主要成分，在血紅蛋白是紅細(xì)胞的主要成分，在正常情況下，每個(gè)紅細(xì)胞均

2、含有正常情況下，每個(gè)紅細(xì)胞均含有一定量的血紅蛋白。血紅蛋白是一定量的血紅蛋白。血紅蛋白是由珠蛋白和亞鐵血紅素組成的結(jié)由珠蛋白和亞鐵血紅素組成的結(jié)合蛋白質(zhì)。血紅蛋白除能與氧結(jié)合蛋白質(zhì)。血紅蛋白除能與氧結(jié)合形成氧合血紅蛋白外，還能與合形成氧合血紅蛋白外，還能與某些物質(zhì)作用形成多種血紅蛋白某些物質(zhì)作用形成多種血紅蛋白衍生物。它們具有特定的色澤和衍生物。它們具有特定的色澤和吸光譜，在臨床上，可用以診斷吸光譜，在臨床上，可用以診斷某些變性血紅蛋白血癥和血紅蛋某些變性血紅蛋白血癥和血紅蛋白的定量測(cè)定。白的定量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理基本原理基本原理 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、形狀、大小、

3、電荷性質(zhì)和多少、吸附性質(zhì)、親和力、溶解度等等，可以用來(lái)分離不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)試驗(yàn)原理試驗(yàn)原理不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不一樣，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不一樣。凝膠電泳法原理凝膠色譜法原理透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留袋內(nèi)，以達(dá)到清除小分子雜質(zhì)的目的。透析法原理當(dāng)不同蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠的內(nèi)部通道，而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入內(nèi)部通道只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。標(biāo)準(zhǔn)比色法原理在一定量的血液中，在一定量的血液中，血紅蛋白經(jīng)少量的鹽

4、血紅蛋白經(jīng)少量的鹽酸的作用，使亞鐵血酸的作用，使亞鐵血紅素變成高鐵血紅素。紅素變成高鐵血紅素。呈現(xiàn)較穩(wěn)定的棕色，呈現(xiàn)較穩(wěn)定的棕色，用水稀釋后與標(biāo)準(zhǔn)色用水稀釋后與標(biāo)準(zhǔn)色比較，即可得出每比較，即可得出每100ml100ml血液中的含量血液中的含量實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑1、0.9%的氯化鈉溶液2、蒸餾水 3、有機(jī)溶劑（甲苯）4、磷酸緩沖液 5、檸檬酸鈉 6、凝膠色譜柱實(shí)驗(yàn)所需用品凝膠色譜柱實(shí)驗(yàn)所需用品7、SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)所需用品8、血紅蛋白計(jì)、0.1mol/L鹽酸溶液、載玻片、刺血針實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟樣品處理樣品處理a、洗滌紅細(xì)胞：在采血容器、洗滌紅細(xì)胞：在采血容器中加入適量中加入適量檸檬酸鈉檸檬酸鈉，

5、取血后，取血后，進(jìn)行低速短時(shí)間離心，將離心進(jìn)行低速短時(shí)間離心，將離心后的血液靜置片刻，待分層明后的血液靜置片刻，待分層明顯后，用膠頭吸管吸出上層黃顯后，用膠頭吸管吸出上層黃色透明血漿，然后用五倍體積色透明血漿，然后用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉的氯化鈉溶液洗滌，低速短時(shí)間離心，溶液洗滌，低速短時(shí)間離心，重復(fù)重復(fù)4-5次，直至上清液中沒(méi)次，直至上清液中沒(méi)有黃色，表明已洗凈。有黃色，表明已洗凈。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟樣品處理樣品處理 b、血紅蛋白的、血紅蛋白的釋放：加蒸餾水釋放：加蒸餾水到原血液體積，到原血液體積，再加再加40%體積的體積的甲苯甲苯，置于磁力，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚁?/p>

6、拌器上充分?jǐn)嚢璋?0分鐘。分鐘。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟樣品處理樣品處理 c、離心：將攪拌好的混合液、離心：將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心的速度離心10分鐘，分鐘，試管中的溶液會(huì)分為四層：最試管中的溶液會(huì)分為四層：最上層為無(wú)色透明的甲苯層；中上層為無(wú)色透明的甲苯層；中上層為白色薄層固體的脂溶性上層為白色薄層固體的脂溶性物質(zhì)的沉淀層；中下層為紅色物質(zhì)的沉淀層；中下層為紅色透明的血紅蛋白的水溶液層；透明的血紅蛋白的水溶液層；最下層為暗紅色其他雜質(zhì)的沉最下層為暗紅色其他雜質(zhì)的沉淀層。淀層。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟樣品處理樣品處理 d、分離血紅蛋白溶、分離血紅蛋白溶液

7、：用濾紙過(guò)濾，液：用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，除去脂溶性沉淀層，在分液漏斗中靜置在分液漏斗中靜置片刻后片刻后，分離出分離出下層紅色透明液下層紅色透明液體。體。粗分離粗分離 取取1ml的血紅蛋白溶液裝的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入透析袋中，將透析袋放入盛有入盛有300ml的物質(zhì)的量的物質(zhì)的量濃度為濃度為20mmol/L的的磷酸緩磷酸緩沖液沖液中，中，pH為為7.0，透析，透析12小時(shí)，目的是除去樣品小時(shí)，目的是除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)或用中分子量較小的雜質(zhì)或用于更換樣品中的緩沖液。于更換樣品中的緩沖液。透析袋一般用硝酸纖維素透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱(chēng)玻璃紙。制成，又稱(chēng)玻璃紙。

8、純化純化a、凝膠色譜柱的制作：取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。（注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。）組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。 b、凝膠色譜柱的裝填 凝膠的選擇：材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。 凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱(chēng)取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。 凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜

9、柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。 注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。c、樣品加入與洗脫：調(diào)節(jié)緩沖液面：打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。樣品滲入凝膠床：加樣后打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。洗脫：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的

10、磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫。收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功）注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。鑒定鑒定（SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳） 1，安裝垂直板，安裝垂直板電泳裝置電泳裝置鑒定鑒定（SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳）2，制膠：，制膠：（分離膠和濃縮膠）（分離膠和濃縮膠）3，樣品預(yù)處理，樣品預(yù)處理上樣上樣鑒定鑒定（SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳）

11、4，電泳 + 染色 + 脫色鑒定鑒定（SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳） 5，分析，分析marker蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物的遷移率血紅蛋白含量的測(cè)定血紅蛋白含量的測(cè)定用滴管加0.1mol/L HCl于血紅蛋白稀釋管內(nèi)，到刻度10處。用刺血針刺破指尖采血，血滴宜大些。用血紅蛋白吸管的尖端接觸血滴，吸血至刻度20ul處（0.02ml）。用濾紙片或棉球擦凈吸管口周?chē)难海瑢⑽懿迦胙t蛋白稀釋管的鹽酸內(nèi)，輕輕吹出血液至管底部，反復(fù)吸入并吹出稀釋管內(nèi)上層的鹽酸，洗滌吸管多次，使吸管內(nèi)的血液完全洗入稀釋管內(nèi)。搖勻或用小玻璃棒攪勻后，放置10min，使鹽酸與血紅蛋白充分作用

12、。 把稀釋管插入標(biāo)準(zhǔn)比色架兩色柱中央的空格中，使無(wú)刻度的兩側(cè)面位于空格的前后方，便于透光和比色。 用滴管向稀釋管內(nèi)逐滴加入蒸用滴管向稀釋管內(nèi)逐滴加入蒸餾水，邊滴邊攪拌邊觀察顏色，餾水，邊滴邊攪拌邊觀察顏色，直至顏色與標(biāo)準(zhǔn)玻璃色柱相同直至顏色與標(biāo)準(zhǔn)玻璃色柱相同為止。稀釋管上液面的刻度讀為止。稀釋管上液面的刻度讀數(shù)即為每數(shù)即為每100ml血液血紅蛋白血液血紅蛋白的克數(shù)。的克數(shù)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 血紅蛋白參考值 成年男性：成年男性：1.31.5g/L；成年女性：成年女性：1.11.4g/L ；兒童：（依年齡而異）兒童：（依年齡而異）1.21.4g/L。臨床意義臨床意義 一般來(lái)說(shuō)，在疾病狀況下，血紅蛋白的增減是與紅細(xì)胞的改變相平行的，即引起紅細(xì)胞增多的疾病，也會(huì)使血紅蛋白含量增加。使紅細(xì)胞減少的疾病，也使血紅蛋白含量減少。在貧血時(shí)，血液中的紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白濃度都有不同程度的下降，但不一定按相同的比例變化。有時(shí)紅細(xì)胞數(shù)量可以減少很多，而血紅蛋白的濃度的降