藥理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概述

1、藥理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概述聯(lián)系效果美國藥典收載有復(fù)方阿司匹林膠囊，由阿司匹林、可待因和咖啡因組成，其中的阿司匹林和磷酸可待因的比例為25：1，臨床用于各種疼痛和發(fā)燒，療效較好。相同鎮(zhèn)痛效果降低兩藥的使用劑量減輕了兩藥的副作用背景鄭惠玲鄭惠玲、是美國政府對藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢定方法作出的技術(shù)規(guī)定，也是藥品生產(chǎn)、使用、管理、檢驗(yàn)的法律依據(jù)。NF收載了美國藥典(USP)尚未收入的新藥和新制劑。美國藥典正文藥品名錄分別按法定藥名字母順序排列，各藥品條目大都列有藥名、結(jié)構(gòu)式、分子式、CAS登記號、成分和含量說明、包裝和貯藏規(guī)格、鑒定方法、干燥失重、熾灼殘?jiān)?、檢測方法等常規(guī)項(xiàng)目，正文之后還有對各種藥品進(jìn)行測試的方法和要

2、求的通用章節(jié)及對各種藥物的一般要求的通則。美國藥典一個(gè)國家記載藥品標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)格的法典，一般由國家藥品監(jiān)督管理局主持編纂、頒布實(shí)施，國際性藥典則由公認(rèn)的國際組織或有關(guān)國家協(xié)商編訂。藥典由國家藥品監(jiān)督管理局主持編纂、頒布實(shí)施，國際性藥典則由公認(rèn)的國際組織或有關(guān)國家協(xié)商訂。制定藥典是從本草學(xué)、藥物學(xué)以及處方集的編著演化而來。藥典的重要特點(diǎn)是它的法定性和體例的規(guī)范化。特點(diǎn)我們根據(jù)國外上市品種的處方比例設(shè)計(jì)了復(fù)方阿司匹林片，并通過幾種動物模型對阿司匹林與磷酸可待困的鎮(zhèn)痛協(xié)同作用進(jìn)行了研究。阿司匹林可待因7阿司匹林的鎮(zhèn)痛機(jī)制阿司匹林的鎮(zhèn)痛機(jī)制唐廣博唐廣博 阿司匹林主要是通過抑制前列腺素及其他能使痛覺對機(jī)械性

3、或化學(xué)性刺激敏感的物質(zhì)(如緩激肽、組胺)的合成，屬于外周性鎮(zhèn)痛藥。PG是一族含有一個(gè)五碳環(huán)和兩條側(cè)鏈的二十碳不飽和脂肪酸，多種細(xì)胞都可合成。 細(xì)胞中的花生四烯酸以磷脂的形式存在于細(xì)胞膜中。多種刺激因素可激活磷脂酶A，使花生四烯酸從膜磷脂中釋放出來。 游離的花生四烯酸經(jīng)細(xì)胞微粒體內(nèi)環(huán)氧酶（COX)的催化生成各種PG，其中PGE2主要參與疼痛的調(diào)節(jié)。 COX是前列腺素類化合物生物合成的關(guān)鍵酶，在體內(nèi)有兩種同工酶：COX-1與COX-2，COX-1是結(jié)構(gòu)酶，正常生理情況下即存在，主要介導(dǎo)生理性前列腺素類物質(zhì)形成。COX-2是誘導(dǎo)酶，在生理狀態(tài)下基本不表達(dá)，在炎性刺激（如發(fā)熱）的刺激下大量生成，介導(dǎo)花

4、生四烯酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的PGE2和PGI2，具有很強(qiáng)的制痛作用?？纱虻逆?zhèn)痛機(jī)制可待因的鎮(zhèn)痛機(jī)制 在體內(nèi)存在有“抗痛系統(tǒng)”，它由腦啡肽神經(jīng)元、腦啡肽及阿片受體共同組成。去極化或刺激腦啡肽神經(jīng)通路可引起腦啡肽釋放，并依賴于鈣離子。在正常情況下約有20%30%的阿片受體與腦啡肽結(jié)合，起著疼痛感覺的調(diào)控作用，維持正常痛閾，發(fā)揮生理性止痛機(jī)能，可待因的作用是激動阿片受體，激活了腦內(nèi)“抗痛系統(tǒng)”，阻斷痛覺傳導(dǎo)，產(chǎn)生中樞性鎮(zhèn)痛作用。 脊髓水平上的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、丘腦、大腦皮層等均參與疼痛的調(diào)節(jié)機(jī)制，其通路復(fù)雜，也需要多種神經(jīng)遞質(zhì)傳遞信號，在這些部位，阿片受體極為豐富，是可待因參與調(diào)節(jié)疼痛的重要基礎(chǔ)。熱板致痛原理熱板致

5、痛原理于帆于帆痛反應(yīng)閾值：又稱痛閾值，是疼痛刺激引起應(yīng)激組織反應(yīng)的最低值，為臨界值的意思。也就是刺激生物體系時(shí)，雖然對小刺激不反應(yīng)，但當(dāng)超過某限度時(shí)就會激烈反應(yīng)的界限值。是機(jī)體對外力刺激最大的承受能力，痛閾值越高，承受疼痛的能力越強(qiáng)，反之越弱。間接測量痛閾值提高是身體的正常調(diào)節(jié)機(jī)制，是合理的、有益的調(diào)節(jié)。痛閾值的提高，并不表示刺激也要相應(yīng)增強(qiáng)。如果刺激量超出了正常范圍，但尚未達(dá)到痛閾值，很有可能會在感覺不痛的情況下受傷。不可盲目用藥將小鼠置于一定溫度的熱板上，熱刺激小鼠足部產(chǎn)生痛反應(yīng)，即舔足反應(yīng)。以小鼠出現(xiàn)舔足的時(shí)間作用為痛反應(yīng)指標(biāo)，判斷藥物鎮(zhèn)痛作用好壞。熱板致痛法控溫精確控溫精確計(jì)時(shí)精確計(jì)時(shí)

6、精確發(fā)熱均勻發(fā)熱均勻選取生長狀況相近且適于實(shí)驗(yàn)的小鼠并分組測定給藥前各組動物的痛反應(yīng)閾值分別給予不同劑量的阿司匹林、磷酸可待因和復(fù)方混合物熱板測痛儀測其用藥后痛閾值（指標(biāo)）記錄并分析思路實(shí)驗(yàn)動物、器材和藥品實(shí)驗(yàn)動物、器材和藥品肖健林肖健林實(shí)驗(yàn)動物：實(shí)驗(yàn)動物：雌性昆明小鼠雌性昆明小鼠（18g22g)一般實(shí)驗(yàn)選擇小鼠的原因：一般實(shí)驗(yàn)選擇小鼠的原因：1.哺乳動物，解剖和生理結(jié)構(gòu)與人較相似2.體型小，飼養(yǎng)管理方便3.生長期短，成熟早，繁殖力強(qiáng)4.性情溫順，膽小怕驚，對環(huán)境變化敏感5.種系純，容易作比較，可以排除不同種系的干擾因素 選擇昆明小鼠選擇昆明小鼠（Kunming mice，KM小鼠）的原因：的

7、原因：來源：來源：1926年美國Rockfeller研究所從瑞士引入白化小鼠培育成Swiss小鼠 。1944年3月17日由湯飛凡教授湯飛凡教授從印度Hoffkine研究所引進(jìn)Swiss小鼠，飼養(yǎng)在昆明中央防疫處。由于該小鼠起初引入地是昆明，故稱之為昆明小鼠。解放后中央防疫處遷回北京天壇，更名為衛(wèi)生部生物制品研究所。1950年小鼠隨之引到北京天壇（檢定所現(xiàn)址），當(dāng)時(shí)保種9對。1953年10月移至北京東郊，1954年擴(kuò)種，相繼引到其他單位，現(xiàn)已遍布全國各地。主要特性：主要特性：KM小鼠是我國生產(chǎn)量、使用量最大的遠(yuǎn)交群小鼠?；驇齑?，基因雜合率高，我國學(xué)者已從KM小鼠遠(yuǎn)交群中先后培育出不少近交系小鼠

8、。經(jīng)50多年的選育，現(xiàn)在KM小鼠腫瘤自發(fā)率極低。不同地飼養(yǎng)的昆明小鼠封閉群的生長發(fā)育與繁殖性能存在一定差異，但其共同特點(diǎn)是抗病力和適應(yīng)力很強(qiáng)，繁殖率和成活率高。它在我國生物醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中約為小鼠總用量的70%。選擇雌性小鼠的一般原因選擇雌性小鼠的一般原因1.雌鼠性情溫順，公鼠易打斗2.雌鼠免疫反應(yīng)強(qiáng)本實(shí)驗(yàn)選擇雌性小鼠的原因是？本實(shí)驗(yàn)選擇雌性小鼠的原因是？實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)器材YLS-6B智能熱板儀、1mL注射器、12號灌胃針頭三個(gè)關(guān)鍵三個(gè)關(guān)鍵 1.表面的導(dǎo)熱性和光潔度表面的導(dǎo)熱性和光潔度 2.溫度溫度控制控制 3.計(jì)時(shí)的準(zhǔn)確程度計(jì)時(shí)的準(zhǔn)確程度藥品藥品配制75mg/mL阿司匹林溶液、3mg/mL磷酸可

9、待因溶液，兩者按1：1 體積比配制混合溶液（25:1）、生理鹽水實(shí)驗(yàn)步驟與分組實(shí)驗(yàn)步驟與分組宋毅涵宋毅涵實(shí)驗(yàn)步驟與分組實(shí)驗(yàn)步驟與分組1 1）先先測定給藥前各組動物測定給藥前各組動物的痛的痛反應(yīng)反應(yīng)閾值閾值，選取選取體重在體重在18g18g一一22 g22 g，痛閾痛閾值在值在5 530 s30 s的雌性小鼠，隨機(jī)分成的雌性小鼠，隨機(jī)分成1515組組, ,并編號并編號120120，每，每組組2020只小鼠只小鼠。實(shí)驗(yàn)室溫度控制。實(shí)驗(yàn)室溫度控制在在20202525。2 2）1-51-5組、組、5-105-10組、組、11-1511-15組、組、15-2015-20組分別注射組分別注射0.10mL0

10、.10mL 、0.20mL0.20mL 、0.30mL0.30mL、0.40mL0.40mL 、0.50mL0.50mL的阿司匹林溶液的阿司匹林溶液（50mg/mL50mg/mL）、）、 磷酸磷酸可待因可待因溶液（溶液（2mg/mL 2mg/mL ） 、混合溶液混合溶液（2525：1 1）和生理鹽水）和生理鹽水3 3）于于給藥后給藥后1 1 h h分別分別將各組小鼠置于將各組小鼠置于55550 055的熱板的熱板測痛儀的測痛儀的金屬金屬板上，以舔后足作為痛反應(yīng)指標(biāo)，記錄小板上，以舔后足作為痛反應(yīng)指標(biāo)，記錄小鼠投入熱板至舔鼠投入熱板至舔后足后足的時(shí)間作為痛反廟閨值，以痛反應(yīng)閾的時(shí)間作為痛反廟閨值

11、，以痛反應(yīng)閾值超過值超過60 S60 S作為作為有效指標(biāo)有效指標(biāo)，計(jì)數(shù)痛反應(yīng)時(shí)間超過，計(jì)數(shù)痛反應(yīng)時(shí)間超過60 s60 s的動的動物數(shù)，物數(shù)，小鼠捉拿小鼠捉拿從籠盒內(nèi)將小鼠尾部捉住并提起，放在籠蓋從籠盒內(nèi)將小鼠尾部捉住并提起，放在籠蓋( (或表面粗糙或表面粗糙的物體的物體) )上，輕輕向后拉鼠尾，在小鼠向前掙脫時(shí)，用左手上，輕輕向后拉鼠尾，在小鼠向前掙脫時(shí)，用左手( (熟練者也可用同一只手熟練者也可用同一只手) )拇指和食指抓住兩耳和頸部皮膚，拇指和食指抓住兩耳和頸部皮膚，無名指，小指和手掌心夾住背部皮膚和尾部，并調(diào)整好動物無名指，小指和手掌心夾住背部皮膚和尾部，并調(diào)整好動物在手中的姿勢。在手中

12、的姿勢。 小鼠灌胃小鼠灌胃 1. 準(zhǔn)備灌胃針頭。一般可以從市場上面買到，實(shí)在沒有的話，可以用12號的針頭，剪去針尖，用砂紙將頭端磨平，也可以用。但是買的灌胃針頭的頭端用錫或者適宜的方法處理了針頭的銳口，自己用砂紙不可能將所有的銳口都磨掉，用這樣的針頭灌胃，損失小鼠食道的可能性比較大。 2. 抓住小鼠，使其頭、頸和身體呈一直線。抓小鼠的動作很簡單，左手的小指和無名指抓住小鼠的尾巴，另外三個(gè)手指抓住小鼠的頸部即可。因?yàn)樾∈笫冀K在活動中，若一次抓的感覺不是很順手，要放開重新抓，不要逞強(qiáng)進(jìn)行下一步操作。 3. 抓好小鼠就可以灌胃了，一般用1 ml的注射器配灌胃針頭。灌胃針頭從小鼠的嘴角進(jìn)入，壓住舌頭，

13、抵住上顎，輕輕向內(nèi)推進(jìn)，進(jìn)入食管后會有一個(gè)刺空感，進(jìn)入食道后就可以推注藥液了。 4. 灌胃容積一般是0.10.2 ml/10 g，最大0.35 ml/10 g，每只小鼠的灌胃最大容積不超過0.8 ml。結(jié)果分析結(jié)果分析張敏潔張敏潔結(jié)果分析生理鹽水（生理鹽水（mg/kg）痛反應(yīng)時(shí)間超過痛反應(yīng)時(shí)間超過60S的動物數(shù)（只）的動物數(shù)（只）鎮(zhèn)痛有效率（鎮(zhèn)痛有效率（%）表表1.生理鹽水灌胃小鼠熱板致痛反應(yīng)（生理鹽水灌胃小鼠熱板致痛反應(yīng)（n=20）結(jié)果分析阿司匹林（阿司匹林（mg/kg）痛反應(yīng)時(shí)間超過痛反應(yīng)時(shí)間超過60S的動物數(shù)（只）的動物數(shù)（只）鎮(zhèn)痛有效率（鎮(zhèn)痛有效率（%）表表2.阿司匹林對小鼠熱板致痛反

14、應(yīng)的鎮(zhèn)痛作用（阿司匹林對小鼠熱板致痛反應(yīng)的鎮(zhèn)痛作用（n=20）結(jié)果分析磷酸可待因磷酸可待因（mg/kg）痛反應(yīng)時(shí)間超過痛反應(yīng)時(shí)間超過60S的動物數(shù)（只）的動物數(shù)（只）鎮(zhèn)痛有效率（鎮(zhèn)痛有效率（%）表表3.磷酸可待因?qū)π∈鬅岚逯峦捶磻?yīng)的鎮(zhèn)痛作用（磷酸可待因?qū)π∈鬅岚逯峦捶磻?yīng)的鎮(zhèn)痛作用（n=20）結(jié)果分析復(fù)方混合物（復(fù)方混合物（阿司阿司匹林匹林：磷酸可待因：磷酸可待因=25：1）（）（mg/kg）痛反應(yīng)時(shí)間超過痛反應(yīng)時(shí)間超過60S的動物數(shù)（只）的動物數(shù)（只）鎮(zhèn)痛有效率（鎮(zhèn)痛有效率（%）表表4.復(fù)方混合物對小鼠熱板致痛反應(yīng)的鎮(zhèn)痛作用復(fù)方混合物對小鼠熱板致痛反應(yīng)的鎮(zhèn)痛作用（n=20）對比對比表表1. 表

15、表2.&表表3.若復(fù)方混合物的鎮(zhèn)痛有效率大于阿司匹林、磷酸可待因的鎮(zhèn)痛有效率，則兩種藥物之間具有協(xié)同鎮(zhèn)痛作用。若復(fù)方混合物的鎮(zhèn)痛有效率小于阿司匹林、磷酸可待因的鎮(zhèn)痛有效率，則兩種藥物之間具有拮抗鎮(zhèn)痛作用。若復(fù)方混合物的鎮(zhèn)痛有效率等于阿司匹林、磷酸可待因的鎮(zhèn)痛有效率，則兩種藥物之間無相互作用。 在對應(yīng) 藥物劑量 比條件下， 比較鎮(zhèn)痛 有效率。結(jié)果分析受試藥品名受試藥品名ED50（mg/kg）95%可倍限可倍限（mg/kg）阿司匹林磷酸可待因復(fù)方混合物生理鹽水表表5.阿司匹林、磷酸可待因以及兩者的復(fù)方對阿司匹林、磷酸可待因以及兩者的復(fù)方對小鼠熱板致痛反應(yīng)的鎮(zhèn)痛小鼠熱板致痛反應(yīng)的鎮(zhèn)痛ED50

16、EDED5050：半數(shù)有效量。在量反應(yīng)中指能引起：半數(shù)有效量。在量反應(yīng)中指能引起50%50%最大反應(yīng)強(qiáng)度的藥量，最大反應(yīng)強(qiáng)度的藥量，在質(zhì)反應(yīng)中指引起在質(zhì)反應(yīng)中指引起50%50%實(shí)驗(yàn)對象出現(xiàn)陽性反應(yīng)時(shí)的藥量。實(shí)驗(yàn)對象出現(xiàn)陽性反應(yīng)時(shí)的藥量。LDLD5050：半數(shù)驚厥量或半數(shù)致死量。：半數(shù)驚厥量或半數(shù)致死量。（藥物的（藥物的ED50ED50越小，越小， LD50 LD50越大說明藥物越安全。）越大說明藥物越安全。）95%95%可倍限：在此劑量范圍內(nèi)可倍限：在此劑量范圍內(nèi)95%95%的實(shí)驗(yàn)對象出現(xiàn)陽性反應(yīng)。的實(shí)驗(yàn)對象出現(xiàn)陽性反應(yīng)。注意事項(xiàng)選擇雌性小鼠以避免雄性小鼠陰囊與Woolfe 熱板接觸而影響實(shí)驗(yàn)

17、結(jié)果為盡量減少個(gè)體差異，應(yīng)事先篩選痛閾小于30秒的小鼠作為實(shí)驗(yàn)鼠實(shí)驗(yàn)室室溫應(yīng)在15左右，Woolfe熱板溫度55左右；痛閾超過60秒的小鼠應(yīng)立即取出以免燙傷各組給藥后觀察痛閾的時(shí)間要一致吳紫薇吳紫薇可行性分析可行性分析羅欣然羅欣然1.本實(shí)驗(yàn)操作簡單，不需要過多的專業(yè)操作技術(shù)；通過舔后足、扭體反應(yīng)和痛反應(yīng)時(shí)間作為效應(yīng)指標(biāo)，直觀、易測；2.熱板測痛儀能較精確地調(diào)定溫度，且溫度較恒定，不會因?yàn)闇囟冗^高而使小鼠提前死亡，同時(shí)能較少實(shí)驗(yàn)誤差；3.阿司匹林和可待因有較好的鎮(zhèn)痛作用，效果明顯，而且有明顯的濃度梯度差異，在本實(shí)驗(yàn)中能在較短時(shí)間內(nèi)觀察到隨著濃度變化而變化的鎮(zhèn)痛有效率。技術(shù)可行性技術(shù)可行性1.本實(shí)

18、驗(yàn)用的昆明種小鼠和Wistar大鼠容易購得、繁殖能力強(qiáng)，個(gè)體差異相對較小，適合用于本實(shí)驗(yàn)；2.阿司匹林和可待因是常用鎮(zhèn)痛藥，價(jià)格低廉，容易獲得，可購置充足藥品用于實(shí)驗(yàn)；經(jīng)濟(jì)可行性經(jīng)濟(jì)可行性討論討論&小結(jié)小結(jié)閆睿閆睿 熱板致痛模型主要用于篩選中樞性鎮(zhèn)痛熱板致痛模型主要用于篩選中樞性鎮(zhèn)痛藥，對于解熱鎮(zhèn)痛藥的篩選可使用化學(xué)性藥，對于解熱鎮(zhèn)痛藥的篩選可使用化學(xué)性致痛模型致痛模型-扭體反應(yīng)模型。扭體反應(yīng)模型。 扭體反應(yīng) 將某些化學(xué)物質(zhì)，如強(qiáng)酸、將某些化學(xué)物質(zhì)，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、鉀離子、緩激肽等，強(qiáng)堿、鉀離子、緩激肽等，涂布于動物的的某些敏感涂布于動物的的某些敏感部位或腹腔注射。部位或腹腔注射。 腹腔注射損傷物質(zhì)引起受腹腔注射損傷物質(zhì)引起受試動物腹痛，動物表現(xiàn)出試動物腹痛，動物表現(xiàn)出“扭體反應(yīng)扭體反應(yīng)”（即腹部內(nèi)（即腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張、臀凹、軀干與后肢伸張、臀部高起）部高起）選取體重在1822 g的小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成15組，每組20只動物。同上一實(shí)驗(yàn)方法給藥，給藥后30 min腹腔注射0.6的醋酸溶液 0.2 ml只，記錄15 min內(nèi)小鼠的扭體反應(yīng)，以15 mi