實(shí)驗(yàn)九DNA的粗提取與鑒定

1、【實(shí)驗(yàn)九】DNA的粗提取與鑒定 陳小珺（江西省贛州市第三中學(xué) 341000）1 教學(xué)建議在本實(shí)驗(yàn)的教學(xué)中，教師應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。1.1 實(shí)驗(yàn)材料必須準(zhǔn)備充足。本實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)材料是雞血細(xì)胞液,由活雞的鮮血經(jīng)沉淀后獲得。每組(2個(gè)學(xué)生)需用5 mL 雞血細(xì)胞液,則每班(50人)至少需要130 mL,而雞血細(xì)胞液與雞血的體積比為1:3,這樣每班至少需要390 mL 雞血細(xì)胞液。宰殺1只中等大小的活雞,一般可得120 mL 左右的鮮血,因此,1個(gè)班實(shí)驗(yàn)需要買4只活雞。也可以到市場(chǎng)售活雞處去索取雞血,但所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑。（每100ml雞血加入3g檸檬酸鈉）1.2 盛放雞血細(xì)胞液的容器,最好是

2、塑料容器。因?yàn)殡u血細(xì)胞破碎后釋放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來(lái)就比較少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就會(huì)更少。 1.3 獲取較純凈的DNA的關(guān)鍵步驟。1.3.1 充分?jǐn)嚢桦u血細(xì)胞液：將雞血細(xì)胞液與蒸餾水混合以后,必須用玻璃棒沿一個(gè)方向快速攪拌,使雞血細(xì)胞加速破裂,并釋放出DNA。1.3.2沉淀DNA時(shí)必須用冷酒精：體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精在冰箱中至少存放24 h。1.3.3正確攪拌含有懸浮物的溶液實(shí)驗(yàn)步驟3、5、7,都需要用玻璃棒攪拌。教師應(yīng)提醒學(xué)生注意,在進(jìn)行步驟3、5時(shí),玻璃棒不要直插燒杯底部,而且攪拌要輕緩,以便獲得較完整的DNA分子。進(jìn)行步驟7時(shí),

3、要將玻璃棒插入燒杯中溶液的中間,用手緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)5 min。2 實(shí)驗(yàn)原理的補(bǔ)充介紹2.1 DNA的釋放本實(shí)驗(yàn)用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個(gè)原因。一是因?yàn)殡u血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破。DNA位于雞血細(xì)胞的細(xì)胞核中,正常情況下不會(huì)釋放出來(lái)。為了使DNA從細(xì)胞核中釋放出來(lái),實(shí)驗(yàn)中采用了向雞血細(xì)胞液中加入蒸餾水并且攪拌的方法。蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō),是一種低滲液體,水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi),使血細(xì)胞破裂。同時(shí),再加上攪拌的機(jī)械作用,就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂),于是釋放出DNA,當(dāng)然也有RNA。但是,釋放出來(lái)的大量DNA和RNA往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。2.2

4、將DNA與蛋白質(zhì)分離根據(jù)二者的特性,即在濃度較高的氯化鈉溶液(物質(zhì)的量濃度為2 moL/L )中,核蛋白容易解聚,游離出DNA。而DNA在濃度較高的氯化鈉溶液中的溶解度很高,Na+與帶負(fù)電的DNA結(jié)合成DNA鈉鹽。這時(shí)DNA在溶液中呈溶解狀態(tài)。2.3 DNA的析出與獲取利用DNA在濃度較低的氯化鈉溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的濃度較高的氯化鈉溶液中加入大量(300 mL )蒸餾水,稀釋氯化鈉溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白質(zhì)的溶解度增高(這就是蛋白質(zhì)的鹽溶現(xiàn)象),從而使二者分離。這時(shí),加上不停地?cái)嚢?溶解度下降的DNA逐漸呈絲狀物。再通過(guò)過(guò)濾,濾去蛋白質(zhì),就可以獲取DNA的黏稠物了。如

5、果采用離心法則更好,用4 000 r/min 的旋轉(zhuǎn)頻率,離心15 min ,除去上清液(含有蛋白質(zhì)),留下的沉淀物中含DNA。2.4 DNA的再溶解再用較高濃度的氯化鈉溶液去溶解DNA黏稠物。2.5 DNA的沉淀和濃縮除去了蛋白質(zhì)的核酸溶液,必須再進(jìn)一步沉淀和濃縮。最常用的方法是酒精沉淀法。就是將含有Na+的DNA溶液,加入到相當(dāng)于其兩倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%冷酒精溶液中（實(shí)驗(yàn)一般要求采用預(yù)冷的95的乙醇，但對(duì)比結(jié)果顯示，常溫下的乙醇溶液也可產(chǎn)生明顯效果。從理論上分析，預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點(diǎn)。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加D

6、NA分子柔韌性，減少斷裂。）,混勻以后可以使DNA沉淀、濃縮,形成含雜質(zhì)較少的DNA絲狀物,懸浮于溶液中。如果出現(xiàn)的絲狀物較少,可以將此混合液再放入冰箱中冷卻幾分。濃縮后的DNA絲狀物,可以用緩緩旋轉(zhuǎn)玻璃棒的方法卷起(因?yàn)椴ＡО粲形紻NA的作用)。2.6 DNA的鑒定本實(shí)驗(yàn)中鑒定DNA的方法為二苯胺法。二苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成-羥基-酮基戊醛,它再和二苯胺作用而顯現(xiàn)藍(lán)色(溶液呈淺藍(lán)色)。鑒定時(shí)溶液藍(lán)色的深淺,與溶液中DNA含量的多少有關(guān)。3 幾種新材料的DNA粗提取與鑒定介紹3.1新鮮菜花(或蒜黃、菠菜)DNA粗提取與鑒定一.材料用具新鮮菜花(或蒜黃、菠菜)。

7、塑料燒杯,量筒,玻璃棒,尼龍紗布,陶瓷研缽,試管,試管架,試管夾,漏斗,酒精燈,石棉網(wǎng),三角架,火柴,刀片,天平。研磨液,體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液,二苯胺試劑,蒸餾水。 二.方法步驟(1)DNA的粗提取準(zhǔn)備材料 將新鮮菜花和體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液放入冰箱冷凍室,至少24 h。取材 稱取30 g菜花,去梗取花,切碎。研磨 將碎菜花放入研缽中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min 。過(guò)濾 在漏斗中墊上尼龍紗布,將菜花研磨液濾入燒杯中(有條件的學(xué)?？蓪V液倒入塑料離心管中進(jìn)行離心,用1 000r/min的旋轉(zhuǎn)頻率,離心25 min,取上清液放入燒杯中)。在4S冰箱中放置幾分后,再取上清液

8、。加冷酒精 將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精溶液中,并用玻璃棒緩緩地輕輕攪拌溶液(玻璃棒不要直插燒杯底部)。沉淀35 min后,可見(jiàn)白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩旋轉(zhuǎn),絮狀物會(huì)纏在玻璃棒上。(2)DNA的鑒定配制二苯胺試 劑取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混勻。鑒定 取4 mL DNA提取液放入試管中,加入4 mL 二苯胺試劑,混勻后觀察溶液顏色(不變藍(lán))。用沸水浴(100 )加熱10 min 。在加熱過(guò)程中,隨時(shí)注意試管中溶液顏色的變化(逐漸出現(xiàn)淺藍(lán)色)。3.2洋蔥DNA粗提取實(shí)驗(yàn)與鑒定（值得推介，它取材容易，操作簡(jiǎn)便，效果明顯。）一、實(shí)驗(yàn)原理洗

9、滌劑等去污劑可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞壁，破壞細(xì)胞膜，同時(shí)也能使蛋白質(zhì)變性。當(dāng)細(xì)胞壁破壞后，細(xì)胞釋放出核酸與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物核糖核蛋白(RNP)和脫氧核糖核蛋白(DNP)，這兩種復(fù)合物在不同電解質(zhì)溶液中的溶解度有較大差異。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到0.14molL時(shí)，DNP溶解度約為純水中溶解度的1，但RNP則不一樣，在0.14molL NaCl溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相當(dāng)大，因此在制備DNA時(shí)，利用0.14molL稀鹽溶液使DNP與RNP分開(kāi)。 去除蛋白質(zhì)后的核酸鹽溶液，再利用其不溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)，但細(xì)胞中的其他物質(zhì)則可以溶于有機(jī)溶劑，應(yīng)用適當(dāng)濃度的有機(jī)溶劑 (如乙醇)使DNA呈絮狀

10、沉淀析出（本實(shí)驗(yàn)加入酒精后使食鹽濃度接近0.14mol/L）。在溶液中，DNA鏈略帶負(fù)電荷，而鹽離子可被吸引到DNA的負(fù)電荷上，中和這些負(fù)電荷，因此就能夠使DNA片段聚合在一起，形成絮狀粘稠物質(zhì)。利用這一原理，就可以用酒精萃取DNA。 DNA與二苯胺作用生成藍(lán)色沉淀用來(lái)鑒定 DNA。二. 材料：洋蔥、洗潔精、食鹽、95酒精、蒸餾水、0.015 molL的NaCl溶液：稱取0.88g NaCl，投入1000ml容量瓶中，加水到所需體積的刻度線上，溶解后成0.015 molL氯化鈉溶液。二苯胺試劑：1 g重結(jié)晶的二苯胺溶于100ml冰乙酸（A.R.）中，再加10ml過(guò)氯酸，臨用前加入1.0ml 1

11、6%的乙醛，試劑應(yīng)為無(wú)色，三.器具：勻漿機(jī)或研缽、紗布、漏斗、燒杯、玻璃棒、量筒、滴管、試管、天平。四.方法步驟 稱取100 g洋蔥，切碎，放進(jìn)攪拌機(jī)或研缽中 加入100ml洗潔精充分?jǐn)嚢杌蜓心⒀心ヒ河寐┒泛蛢蓪蛹啿歼^(guò)濾到燒杯中加入1g食鹽，攪拌均勻量取上述澄清的洋蔥液50ml加入70ml的95酒精輕輕搖動(dòng)或用玻璃棒輕輕攪拌白色纖維狀粘稠物質(zhì)析出，即DNA用玻璃棒可將其輕輕卷起，放入1號(hào)試管攪拌溶解后，加入4ml二苯胺試劑混合均勻，在沸水浴中加熱 38min，觀察顏色的變化。五. 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1)材料必須充分勻漿或研磨，否則洋蔥細(xì)胞沒(méi)有完全破碎，影響實(shí)驗(yàn)效果；2)加入酒精后搖動(dòng)或攪拌時(shí)一定要

12、輕緩，否則會(huì)破壞DNA，以至于看不到；3)DNA鑒定時(shí)，二苯胺最好現(xiàn)配現(xiàn)用，否則二苯胺會(huì)變成淺藍(lán)色或綠色，則不能使用。4 幾種新材料的DNA粗提取介紹4.1 細(xì)菌DNA提取方法（尤其對(duì)有莢膜的細(xì)菌）方法一1種子加入2ml盛有4預(yù)冷的抽提緩沖液（8M LiCl，2% b-巰基乙醇僅針對(duì)RNA）離心管中，4過(guò)夜； 2離心4s，轉(zhuǎn)移上清到2ml新管中（針對(duì)植物）； 3離心，12,000rpm，30min，4（僅針對(duì)RNA）； 4棄上清液，用70乙醇洗沉淀，風(fēng)干； 5溶解上述沉淀于緩沖液（5%SDS，10mMNaCl，25mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH7.6，2巰基乙醇）中； 6加入

13、等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）7離心12,000rpm，10min，轉(zhuǎn)移上清到新管中. 8加入等體積氯仿/異戊醇(24：1) 9離心12,000rpm，10min，轉(zhuǎn)移上清到新管中10分裝至兩支1.5ml離心管中，各加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），200C沉淀； 11離心12,000rpm，10min； 12. 棄上清，70乙醇洗，也可以再用100乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。方法二1試劑：抽提緩沖液、2% CTAB (W/V)、 2% PVP K25 (w/v) （去色素）、100mM Tris-HCl (pH8.0)、 25mM

14、EDTA (pH8.0)、 2.0M NaClbM.、 2.10M LiClr+1、3. 2M LiCl, DEPC-water（抑制RNA酶活性）、 3M NaAc (pH5.2) 、96% 乙醇、 70% 乙醇2步驟：1）抽提緩沖液65預(yù)熱；2） 加菌體到已經(jīng)預(yù)熱的緩沖液（700ul）中混勻，65，10min；; 3）加酚、氯仿、異戊醇（25：24：1），振蕩，離心12,000rpm，10min；4）取上清，加氯仿、異戊醇（24：1）振蕩，離心12,000rpm，10min； 5）取上清，重復(fù)4步驟；6）加10M LiCl 1/4體積到上清液；7）4過(guò)夜，沉淀DNA；8）離心（12,000

15、rpm，10min），棄上清；9）70乙醇洗，再用100乙醇洗，風(fēng)干；10） 加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），200C沉淀；11）離心12,000rpm，10min；12）棄上清，70乙醇洗，也可以再用100乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。 4.2 從動(dòng)物組織提取DNA的方法： 一、材料：哺乳動(dòng)物新鮮組織。 二、設(shè)備： 移液管、高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋。 三、試劑 1、分離緩沖液：10mmol/L TrisCl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。 2、其它試劑：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/

16、ml或粉劑)，乙醚，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無(wú)水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。 四、操作步驟:1. 切取組織5g左右,剔除結(jié)締組織,吸水紙吸干血液,剪碎放入研缽(越細(xì)越好)。 2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分離緩沖液。 3. 加1ml 10% SDS, 混勻,此時(shí)樣品變得很粘稠。 4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37保溫1-2小時(shí), 直到組織完全解體。 5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混勻,5000rpm離心數(shù)秒鐘。 6.取上清液于新離心管，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。待分層后,3000rpm離心

17、 5分鐘。7. 取上層水相至干凈離心管, 加2倍體積乙醚抽提(在通風(fēng)情況下操作)。 8. 移去上層乙醚,保留下層水相。 9. 加1/10 體積3mol/L NaAc, 及2倍體積無(wú)水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10-20分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。 10. 用玻棒鉤出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水紙上吸干,溶解于1ml TE中,-20保存。 11. 如果DNA溶液中有不溶解顆粒,可在5000rpm短暫離心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5l RNaseA(10g/l), 37保溫30分鐘, 用酚抽提后, 按步驟9-10重沉淀DNA。4.3 大豆DNA的提取將新鮮大豆葉片

18、保存在冰箱，用時(shí)取出。1、稱取大豆葉片2克左右，放入研磨缽中，倒入液氮，將其研碎成粉末。2、將粉末裝入50ml離心管中；同時(shí)將CTAB提取液放入水浴鍋中，加溫至65度。3、吸取10ml的CTAB提取液和200ul的巰基乙醇放入裝有葉片粉末的離心管中。4、充分振蕩后，放入65度的水浴鍋中，大約40分鐘；其間，每隔10分鐘輕輕的搖晃離心管，使溶液和粉末充分混合。5、40分鐘后，取出冷卻至室溫，加入等體積的氯仿異戊醇（24：1），充分混勻。6、然后將離心管放入離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速12000rpm，時(shí)間大概15分鐘，即可。7、取上清液至另一離心管中，再吸取等體積的氯仿異戊醇，混勻離心，重復(fù)上述步驟。8、

19、再一次吸取上清液，加入2倍于該上清液體積的冰無(wú)水乙醇，輕輕混勻（因?yàn)榇藭r(shí)DNA已有少許絮狀沉淀，避免DNA斷裂），放入4度冰箱中，大概1小時(shí)左右。9、將DNA沉淀用玻璃器皿將其挑到1.5ml的離心管中，用70%的酒精清洗兩遍，放置室溫中，待其酒精味揮發(fā)完之后（用鼻子聞聞），加入TE溶液即可，這就是DNA原液，放入-20度冰箱保存即可。4.4 植物DNA的SDS（十二烷基硫酸鈉）提取法：取2-3g新鮮葉片，在液氮中研磨成粉狀（防止溶化）后轉(zhuǎn)入15ml離心管中。加入5ml于65預(yù)熱的提取緩沖液，65水浴保溫30min（搖動(dòng)數(shù)次），使提取液與樣品充分混合。加入2ml 5mol/L Kac，劇烈振蕩，

20、冰浴保溫20 min以上。2700轉(zhuǎn)離心20min，將上清液倒入新的15ml離心管中，（若提取DNA用于Southern等實(shí)驗(yàn)，一般在轉(zhuǎn)移上清時(shí)加濾膜，防止樣品殘?jiān)烊耄杀ＷCDNA純度）。加入4ml氯仿/異戊醇（241），搖勻，平衡，2700轉(zhuǎn)離心15 min。在另一新的15ml離心管中加入5ml預(yù)冷的異丙醇，將上清液用移液槍轉(zhuǎn)入此管，在20冷卻30 min以上。2700轉(zhuǎn)離心10 min，棄去上清液，用4ml 70%乙醇洗滌，室溫保持10 min。2700轉(zhuǎn)離心3 min，倒去上清液。重復(fù)步驟7，用4ml 70%乙醇洗滌，室溫保持10 min。2700轉(zhuǎn)離心3min，倒去上清液。超凈工作臺(tái)

21、內(nèi)吹干（3h左右）。加1ml TE緩沖液中溶解，加10l RNase （10mg/ml），在37恒溫箱中溫育20min。再加100l 3 mol/L NaAc和2ml無(wú)水乙醇，2700轉(zhuǎn)離心3min，倒去上清液。超凈工作臺(tái)內(nèi)吹干（3h左右）。將DNA沉淀溶于150l TE中，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)（3h左右）。將TE溶液轉(zhuǎn)入已滅菌的15ml eppendorf管中,20保存?zhèn)溆谩?.5 植物DNA的“一管法”提取方法：稱取100mg新鮮植物組織，剪碎置于15ml離心管中，可加入少許無(wú)菌石英砂，加入3滴提取緩沖液，用帶玻璃鉆頭的電鉆充分研磨勻漿。加入400l提取緩沖液，混勻后置于90水浴中，不時(shí)顛倒搖

22、勻。溫育20min后，置于冰浴中5min，使組織和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）沉淀，置于4下保存?zhèn)溆谩?.6 適用于PCR研究的快速提取法：田間剪取植株新鮮葉片510mg（約2cm長(zhǎng)）左右，新鮮葉片放于15ml離心管中，存于冰盒中，根據(jù)樣品號(hào)貼上相應(yīng)的標(biāo)簽。用剪刀將葉片組織剪細(xì)（約0.5cm長(zhǎng)）放在點(diǎn)穴式研板中。加入400l DNA提取緩沖液，用玻棒將葉組織研細(xì)，直到液體變成深綠色即可。再加400l DNA提取緩沖液，混合均勻，轉(zhuǎn)入一新的15ml離心管（貼上相應(yīng)的編號(hào)）。加400l氯仿，混合均勻后，2400轉(zhuǎn)離心30s，將上清液轉(zhuǎn)入一支新的15ml離心管（貼上相應(yīng)的編號(hào)）。加800l無(wú)水乙醇，

23、混勻，2400轉(zhuǎn)離心3min。棄上清。70%乙醇沖洗，風(fēng)干。用50l TE緩沖液溶解，存于20。取1l用于PCR分析。4.7 棉花等酚類、多糖類物質(zhì)較多的植物DNA提取法：取2g新鮮幼嫩的葉片放入研缽中，加入液氮后快速、充分研磨，待成極細(xì)的粉末狀時(shí)迅速轉(zhuǎn)入到50ml離心管中。在50ml離心管中加入10ml冰預(yù)冷的提取緩沖液，在渦懸振蕩器上充分混勻。于4，2700轉(zhuǎn)離心20min，倒去上清液在沉淀中加入5ml裂解緩沖液，在渦旋振蕩器上充分混勻。于65水浴鍋中溫育30min。加入5ml氯仿/異戊醇（24/1），并上下翻轉(zhuǎn)以充分混合。于4，2700轉(zhuǎn)離心5min。轉(zhuǎn)移上層水相至一新的50ml離心管中

24、。重復(fù)步驟79一次。加入2/3體積的冰預(yù)冷的異丙醇，并上下翻轉(zhuǎn)以充分混合，至20 2h。于4，1200轉(zhuǎn)離心10min。在一新管中加入20ml含80%乙醇15m mol/L NaAc溶液，用玻棒將DNA轉(zhuǎn)入該管（如不能直接用玻棒纏出，可離心后倒出上清，再在其中加入20ml含80%乙醇15m mol/L NaAc溶液），放置20min后稍許離心，移走上清并吸出殘存乙醇，室溫干燥。加入1 0ml TE（10 m mol/L Tris-HCl pH=8.0、1 m mol/L EDTA）并加入終濃度為20g/L的RnaseA，過(guò)夜。風(fēng)干，用50l TE緩沖液溶解，存于20備用。 4.8 植物DNA的

25、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）提取法：稱取新鮮葉片2-3g，剪碎放入研缽中，在液氮中研磨成粉末。將粉末轉(zhuǎn)移到的加有7ml經(jīng)預(yù)熱的15CTAB提取緩沖液15ml離心管中，迅速混勻后置于65水浴中，溫育30min。取出離心管,冷卻至室溫，加入氯仿、異戊醇(24:1)，充分混勻，室溫下2300轉(zhuǎn)離心20min。將上清轉(zhuǎn)移至另一新的15ml離心管中，加入1/10體積10%的CTAB和等體積的氯仿/異戊醇。充分混勻，2300轉(zhuǎn)離心20min。轉(zhuǎn)移上清至另一新的15ml離心管中，加入等體積1%的CTAB沉淀緩沖液，輕輕搖晃至形成DNA絮狀沉淀。1000轉(zhuǎn)離心10min，使DNA沉淀于管底。加入1.5-2

26、ml的1mol/L NaCl及5l RNase置于56水浴中過(guò)夜。待DNA完全溶解后，加2-3ml 4預(yù)冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml離心管中。用70%乙醇清洗30min，用離心機(jī)甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超凈工作臺(tái)上吹干。將風(fēng)干的DNA直接在4保存?zhèn)溆没蛉苡?00l TE溶液中于-20保存。5 二苯胺試劑的配制A液：15 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL濃硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈結(jié)晶狀態(tài),則需加溫后待其熔化,再使用。B液：乙醛的體積分?jǐn)?shù)為0.2%的溶液。將0.1 mL B液加入到10 mLA液中,現(xiàn)

27、配現(xiàn)用。6 研磨液的配制方法Tris（三羥甲基氨基甲烷）：10.1 g(相對(duì)分子質(zhì)量為121.14),先加50 mL 蒸餾水溶解,用物質(zhì)的量濃度為2 moL/L 的鹽酸調(diào)至pH8.0,再加下述藥品。NaCl：8.76 g(相對(duì)分子質(zhì)量58.44)EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）：37.2 g(相對(duì)分子質(zhì)量372.24)SDS(十二烷基磺酸鈉)：20 g(相對(duì)分子質(zhì)量288.3)待上述藥品全部溶解后,再用蒸餾水定容至1 000 mL。若在室溫低于20 時(shí)配制藥液,SDS呈沉淀析出,此時(shí)需要加溫,才能將SDS溶解。如果提前配制的研磨液出現(xiàn)了沉淀,則應(yīng)加溫使沉淀溶解后再使用。7 研磨液中幾種藥品的作用S

28、DS(十二烷基磺酸鈉):可使蛋白質(zhì)變性,與DNA分離。 EDTA(乙二胺四乙酸二鈉):為DNA酶的抑制劑,可以防止細(xì)胞破碎后DNA酶降解DNA。物質(zhì)的量濃度為0.15 moL/L的氯化鈉溶液：能很好地溶解DNA。Tris/HCl：提供緩沖體系,DNA在此緩沖體系中呈穩(wěn)定狀態(tài)。(Tris為三羥甲基氨基甲烷)8鑒定DNA的其他方法用紫外燈照射法鑒定DNA效果很好。具體鑒定方法如下。 1.配制染色劑。用蒸餾水配制萬(wàn)分之五的溴化乙錠(EB)溶液。2.將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹于蠟紙上,再滴1滴EB溶液染色。3.將蠟紙放在紫外燈(260 nm)下照射(暗室中),可見(jiàn)橙紅色的螢光(DNA的紫外吸收高峰在

29、280 nm處)。9 淺談DNA的粗提取和鑒定實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路遵循實(shí)驗(yàn)步驟提取和鑒定DNA，從而掌握“怎樣做”的方法十分重要。但親身體驗(yàn)科學(xué)過(guò)程，培養(yǎng)“為什么要這樣做”的思維習(xí)慣，使學(xué)生改變學(xué)習(xí)方式而主動(dòng)學(xué)習(xí)就更為重要。下面就談一談該實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路。一、問(wèn)題來(lái)源及連鎖目標(biāo)粗提取并進(jìn)一步提純DNA，從而單獨(dú)地、直接地去觀察DNA的作用，對(duì)于驗(yàn)證DNA是遺傳物質(zhì)十分關(guān)鍵。同時(shí)，能使學(xué)生在對(duì)提取出的DNA進(jìn)行物理觀察的過(guò)程中直觀認(rèn)識(shí)DNA絮狀聚集物。二、問(wèn)題延伸及子問(wèn)題展現(xiàn)要提取DNA并鑒定提取物是DNA，遞次出現(xiàn)的問(wèn)題有：DNA主要存在于細(xì)胞核中，如何選取具核的生物組織作為實(shí)驗(yàn)材料。如何除去核外的核

30、膜和質(zhì)膜，對(duì)于植物細(xì)胞又如何破壁。細(xì)胞核中除DNA外，還有RNA，且DNA以核蛋白體DNP的形式存在。那么，如何使DNA和RNA分開(kāi)，又如何使DNA和蛋白質(zhì)分開(kāi)。如何去除雜質(zhì)物質(zhì)使DNA更加純化。如何驗(yàn)證提取物主要是DNA成分。三、問(wèn)題分析及處理方案對(duì)以上子問(wèn)題進(jìn)行相應(yīng)的分析和處理：取雞血細(xì)胞液（其紅細(xì)胞橢圓具核，除駱駝外，豬、羊、狗等哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞無(wú)核）當(dāng)然，在提取出的DNA中也含有一定量的胞質(zhì)DNA，即線粒體DNA和葉綠體DNA。使紅細(xì)胞溶血破膜。在低滲溶液中，如加蒸餾水使血細(xì)胞過(guò)度滲透吸水直至破裂，同時(shí)用玻棒加速血細(xì)胞及核破裂，經(jīng)一級(jí)過(guò)濾后濾出液為DNA核蛋白和RNA核蛋白。利用DNA和

31、RNA溶解度的不同析出DNA。在濃氯化鈉溶液（2 mol/L）中，DNA核蛋白的溶解度很大，而RNA核蛋白的溶解度很小。在稀氯化鈉溶液（0.14molL）中DNA的溶解度最低，蛋白質(zhì)的溶解度很高而出現(xiàn)鹽溶現(xiàn)象，經(jīng)二級(jí)過(guò)濾后濾出液主要為DNA粗制品。DNA不溶于酒精，經(jīng)三級(jí)過(guò)濾后，再利用乙醇沉淀法使其他物質(zhì)溶于酒精而進(jìn)一步純化DNA。二苯胺鑒定法即DNA遇二苯胺（沸水浴）被染成藍(lán)色，且顏色的深淺與DNA純化程度有關(guān)。在此過(guò)程中設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)中二苯胺對(duì)DNA專一性顯色結(jié)果的可信度。四、評(píng)價(jià)總結(jié)及批判性研究就DNA粗提取和鑒定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果而言，它是一個(gè)定量分析定性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。其生化實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性

32、決定了學(xué)生必須對(duì)該實(shí)驗(yàn)的操作要點(diǎn)和具體步驟作出必要的歸納總結(jié)，才能對(duì)實(shí)驗(yàn)流程作一個(gè)整體把握。就該實(shí)驗(yàn)的過(guò)程而言，大有文章可作。應(yīng)鼓勵(lì)學(xué)生積極開(kāi)拓思維，從不同的研究角度大膽地進(jìn)行創(chuàng)新研究，在評(píng)判諸如選材的優(yōu)劣、操作的繁簡(jiǎn)以及實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)等方面問(wèn)題的過(guò)程中，愉快而輕松地學(xué)習(xí)。1個(gè)目的：在體驗(yàn)科學(xué)思維的過(guò)程中提取和鑒定DNA。2次用蒸餾水：蒸餾水破膜提取核物質(zhì)和蒸餾水稀釋析出DNA。3次過(guò)濾：過(guò)濾核外物質(zhì)，過(guò)濾DNA核蛋白，過(guò)濾DNA。4個(gè)關(guān)鍵詞：DNA提取，設(shè)計(jì)思路，科學(xué)思維和研究性學(xué)習(xí)。5次攪拌：第1步同方向加力攪拌，第3、5步同方向輕緩攪拌，第7步同方向緩慢攪拌，第8步可不同方向攪拌。6種溶液：

33、主要有檸檬酸鈉液、酒精液、二苯胺液、甲基綠液、0.015 molL和2 molL氯化鈉液。7種探究模式：本實(shí)驗(yàn)可嘗試性拓展為探究性實(shí)驗(yàn)，改型后主要參考課題有（a）探究使用雞的不同組織材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)的實(shí)驗(yàn)效果。（b）探究蒸餾水量引起的雞血細(xì)胞在不同低滲狀態(tài)下的破裂程度。（c）探究 DNA在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈉溶液中的溶解度并繪出曲線圖。(d）探究DNA鑒定過(guò)程中不同水浴溫度對(duì)顯色的影響。（e）探究沉淀DNA時(shí)不同溫度的酒精對(duì)沉淀量的影響。（f）探究過(guò)濾過(guò)程中紗布層數(shù)對(duì)最終提取物量的影響。(g）探究使用玻璃燒杯、試管與使用塑料制品對(duì)DNA提取量的影響。8個(gè)步驟：提取過(guò)濾溶解過(guò)濾再溶解再過(guò)濾提純鑒定。10 DNA粗提取和鑒定的記憶本實(shí)驗(yàn)是考綱當(dāng)中步驟最為復(fù)雜的，記憶成為一個(gè)難題，思得一法，試行之。一、結(jié)合原理對(duì)應(yīng)步驟記憶，將實(shí)驗(yàn)分為以下三大步。 1、DNA在0.14mol/L