粉防己堿對實驗性心肌缺血再灌注損傷影響的研究

1、粉防己堿對實驗性心肌缺血再灌注損傷影響的研究摘要為探討粉防己堿(Tet)對心肌缺血再灌注損傷的影響，將16只雜種犬制作動物模型隨機分為用藥組和對照組，觀察兩組白細胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)、血小板激活因子(PAF)、心肌內(nèi)髓過氧化物酶(MPO)活性、心肌梗死范圍(MIS)等指標(biāo)。結(jié)果表明：用藥組MIS較對照組明顯縮小，同時IL-1、TNF、PAF、MPO等炎性指標(biāo)也較對照組明顯為低，IL-1、TNF、PAF與MIS存在明顯復(fù)相關(guān)關(guān)系，心肌MPO與MIS呈密切正相關(guān)。提示Tet具有抗心肌缺血再灌注損傷作用，其機理可能與其抗炎作用有關(guān)。關(guān)鍵詞粉防己堿心肌缺血再灌注損傷炎性遞質(zhì)心

2、肌梗死范圍 Influence of Tetrandrine on myocardium injury indogs with experimental ischemia reperfusionGuan Huaimin?Yiu RuiyunHuang Zhengwenet al(?Henan Provincial Chest Disease Hospital,Zhengzhou 450003)AbstractTo investigate the influence of Tetrandrine (Tet) in treating myocardial ischemia reperfusion

3、injnry,16 dogs models were divided randomly into Tet group and control group.The changes of interleukin-1 (IL-1),tumor necrosis factor(TNF),platelet activating factor(PAF),endocardiac myeloperoxidase(MPO) and myocardial infarction size(MIS)were observed in the 2 groups.The results showed:MIS in Tet

4、group was obviously small than that in control group,likewise IL-1,TNF,PAF and MPO in Tet group were obviously lower than that in control group.MIS or MPO was found to have a close coefficient of multiple correlation with the three inflammatony factors(IL-1,TNF,PAF),and between MPO and MIS there was

5、 a close positive correlation.The results indicated that Tet played an important role in protecting reperfusion of ischemic myocar-dium,this mechanism might relate to anti-inflammatory function of Tet.Key wordsTetrandrineMyocardium ischemia reperfusion injuryInflammatory agentsMyocardium infarction

6、size粉防己堿(Tet)和小檗堿、蝙蝠葛堿同屬異喹啉類生物堿，實驗研究已證實小檗堿、蝙蝠葛堿對心肌缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用。本研究以Tet作為保護劑，在犬心肌缺血再灌注模型上，觀察白細胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)、血小板激活因子(PAF)、髓過氧化物酶(MPO)含量等指標(biāo)，評估Tet對心肌缺血再灌注損傷的保護作用并探討其機理。1材料和方法1.1動物模型雜種犬16只，體重1320 kg，雌雄不拘。3%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)肌注麻醉，用多導(dǎo)生理記錄儀監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電，氣管插管行正壓人工呼吸，在無菌操作條件下于胸骨左緣第4、5肋間開胸，暴露心臟，縫制心包吊床，

7、在冠狀動脈(冠脈)左前降支(LDA)第一分支遠端分離LDA置線，心大靜脈內(nèi)置管采血標(biāo)本用，用無創(chuàng)血管夾阻斷冠脈1.5 h然后松開6 h。以冠脈阻斷前所采雙序號標(biāo)本的測出結(jié)果為基礎(chǔ)值，以冠脈阻斷后1.5 h，再灌注后2、4、6 h為采血標(biāo)本時間。將動物隨機分為兩組，每組8只。用藥組于冠脈阻斷前5 min靜脈注射0.3%Tet溶液(3 mg/kg，浙江金華制藥廠提供原粉，批號890815)，對照組于冠脈阻斷前5 min靜脈注射等量生理鹽水。兩組在觀察過程中均靜脈滴注生理鹽水(2 ml/min)維持。1.2IL1測定無菌采血2.5ml裝入預(yù)備無菌肝素抗凝瓶中，常規(guī)分離單個核細胞，配成5109/L濃度

8、，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后洗去不粘附細胞，加入1%新生小牛血清和含有內(nèi)毒素的1640營養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)40 h，收集上清液經(jīng)0.22 m濾膜過濾后分裝，-20冰箱中保存待測，以C 57/BL純系小鼠胸腺細胞作為靶細胞，用四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma)細胞增殖法測定IL-1活性，結(jié)果以u/ml表示，IL-1標(biāo)準(zhǔn)品由中國人民解放軍醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。1.3TNF測定無菌采血2 ml，將單個核細胞調(diào)整成濃度為4109/L，加入內(nèi)毒素后在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，過濾分裝低溫保存。TNF測定用酶聯(lián)吸附法，結(jié)果以g/L表示，TNF藥盒由中國人民解放軍醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。1.4PAF測定采血3

9、ml立即注入預(yù)先加有甲醇15 ml的試管中，搖勻，振蕩10 min，3000 r/min離心，取上清液加氯仿7.5 ml、蒸餾水7.5 ml振蕩1 min，靜置到分層清晰后取出氯仿相，低溫保存。測定前將氯仿用氮氣沖干，高效薄層層析法測定(島津CS-930型薄層掃描儀)血中PAF含量，結(jié)果以g/L表示，PAF標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。1.5心肌MPO測定心肌缺血再灌注時心肌內(nèi)有多形核粒細胞浸潤，在其胞漿嗜天青顆粒中含有MPO。處死動物后立即取再灌注區(qū)心肌12 g，低溫保存。測定按羅武生等1改良方法，取心肌組織100 mg加入2 ml 0.05 mol PBS緩沖液中，經(jīng)電動勻漿后用超聲粉碎儀粉碎

10、細胞及亞細胞成份，于04、4 3000 r/min離心15 min，取上清0.1 ml加入2.9 ml反應(yīng)液(鹽酸鄰聯(lián)堿茴香胺16.7 mg、0.05 mol PBS緩沖液10 ml、蒸餾水9 ml加30% H2O2使終濃度為0.0005%)混合，在721分光光度計460 nm波長下立即進行2 min掃描，以第30 s至90 s的1 min內(nèi)吸光度變化代表酶活性改變。1單位MPO活力以25時分解1 mol H2O2表示，結(jié)果以u/g表示。1.6心肌梗死范圍(MIS)測定采用TTC大體標(biāo)本染色法，將左心室橫切成0.5 cm薄片，浸泡在37、1% TTC磷酸緩沖液中孵育30 min，剪去未染組織后

11、稱重，獲取梗死心肌重量占左室重量的百分比表示MIS。1.7統(tǒng)計學(xué)處理各參數(shù)以s表示，同一指標(biāo)間比較、不同指標(biāo)間直線相關(guān)分析用t檢驗，復(fù)相關(guān)分析用F檢驗。2結(jié)果2.1兩組不同時間IL-1、TNF、PAF水平變化比較見附表。2.2兩組心肌MPO含量比較每克濕重心肌組織中含有MPO，對照組為16.553.51u/g，用藥組為10.572.61 u/g，兩組差異極顯著(P0.01)。2.3兩組MIS比較對照組為35.312.81(%)，用藥組為18.22.27(%)，兩組差異極顯著(P0.001)。附表兩組IL-1、TNF、PAF水平變化比較項目組別阻斷前阻斷后1.5 h再灌2 h再灌4 h再灌6 h

12、IL-1(u/ml)對照組用藥組136.2514.4177.8820.022720.725316.527515.86153.1216.4*18815.8*219.915.3*24516*TNF(g/L)對照組用藥組6.640.7637.263.9861.303.4270.303.6176.534.1332.133.33*53.283.12*66.253.48*69.943.38*PAF(g/L)對照組用藥組185.316.742850582.736.7317.346.7208.736.534741*461.353.2*232.733.3*203.326.7與同組前一時間值相比，P0.001；與

13、對照組同一時間相比*P0.05，*P0.01，*P0.0012.4相關(guān)分析IL-1、TNF、PAF三種炎性因子間相互存在著密切的復(fù)相關(guān)關(guān)系(均P0.05)；心肌內(nèi)MPO含量與三種炎性因子間存在著顯著復(fù)相關(guān)關(guān)系(r=0.958，P0.05)，MPO與MIS存在著密切的正相關(guān)關(guān)系(r=0.853，P0.005)。3討論急性心肌缺血再灌注損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，它不僅是由于血流阻斷或代謝產(chǎn)物蓄積，而且是因為缺血引發(fā)了一系列反應(yīng)，而這種反應(yīng)的結(jié)果是，再灌注時白細胞進入缺血區(qū)，與內(nèi)皮細胞相互作用，誘發(fā)和釋放炎性遞質(zhì)，致使缺血性損傷加重2。有資料證實，急性心肌缺血或(和)再灌注時具有強烈致炎作用的I

14、L-1、TNF和PAF均顯著升高，且其升高程度愈明顯，炎癥反應(yīng)愈重，預(yù)后愈差3，4。本研究結(jié)果與上述報道一致，三種炎性因子在缺血期已有明顯升高，再灌注更顯著。相關(guān)分析表明，三種炎性因子間相互存在著密切的復(fù)相關(guān)關(guān)系，說明三者相互影響，形成網(wǎng)絡(luò)，在迅速放大炎癥效應(yīng)中起重要作用。MPO系心肌浸潤白細胞內(nèi)所含的一種重要溶酶體酶，它既能間接反映心肌浸潤PMN的數(shù)量，又能反映其激活程度，MPO與三種炎性細胞因子存在著明顯的復(fù)相關(guān)關(guān)系，提示系其共同導(dǎo)致了白細胞激活和心肌內(nèi)白細胞浸潤，這也正與它們炎性因子的生物活性相吻合。細胞浸潤的結(jié)果造成了：機械阻塞心肌內(nèi)毛細血管；釋放溶酶體酶；產(chǎn)生自由基；釋放花生四烯酸代

15、謝產(chǎn)物；促進血小板聚集；產(chǎn)生更多的IL-1、TNF和PAF5，6。因而加速或促成心肌變性壞死，使MIS擴大。MIS與MPO呈密切正相關(guān)支持這種觀點。已知Tet具有廣泛的鈣離子拮抗作用和較強的非特異性抗炎作用，可以有效地防治心肌缺血再灌注時的炎癥反應(yīng)，從而達到減輕心肌損傷、縮小MIS的效果。本研究結(jié)果顯示，Tet能有效抑制IL-1、TNF、PAF的產(chǎn)生，減輕由此誘發(fā)的心肌炎性反應(yīng)，使心肌內(nèi)MPO含量明顯下降，MIS縮小。體外細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)Tet對正常單核類白細胞分泌IL-1、TNF具有顯著抑制作用7；而Tet對PAF的抑制功能，可能與其鈣拮抗作用有關(guān)，因為細胞膜磷酯酶(PLA2)是合成PAF的關(guān)鍵

16、酶，而PLA2的激活是靠細胞內(nèi)高濃度Ca2+來完成的。Tet和其它的鈣調(diào)素(CaM)抑制劑一樣，可通過抑制或競爭CaM機制，而降低CaM依賴性PLA2的活性，進而減少PAF合成8。Tet還可對抗PAF所致的細胞Ca2+內(nèi)流而抑制其自分泌作用9，也能降低急性炎癥期血管通透性，抑制中性粒細胞的激活、游走和溶酶體酶釋放10，使缺血局部無菌性炎癥降低到最低程度，從而縮小MIS?？傊?，Tet對心肌缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用，機理除有與其已知的鈣拮抗作用外，可能與抑制IL-1、TNF、PAF等炎性因子產(chǎn)生以及抑制白細胞游走激活、降低心肌內(nèi)炎性細胞浸潤和溶酶體酶釋放等抗炎作用有關(guān)。 參考文獻1羅武生，

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