流式細(xì)胞儀的原理

1、流式細(xì)胞術(shù)的原理及應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的原理及應(yīng)用無(wú)錫二院檢驗(yàn)科無(wú)錫二院檢驗(yàn)科流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是以是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段，能夠快速、精確流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段，能夠快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞或的對(duì)單個(gè)細(xì)胞或顆粒的物顆粒的物理和化學(xué)特性理和化學(xué)特性（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNADNA、RNARNA、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)、抗原等）抗原等）進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。術(shù)。流流 式式 細(xì)細(xì) 胞胞 術(shù)術(shù) 的的 特特 點(diǎn)點(diǎn)（1）流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持）流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持

2、細(xì)胞及細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的細(xì)胞及細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，從分子水平上獲取多種信號(hào)對(duì)狀態(tài)下，從分子水平上獲取多種信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。（2）測(cè)量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定）測(cè)量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量量流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞顆粒度DNADNA含量與細(xì)胞周期含量與細(xì)胞周期RNARNA含量含量蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞功能細(xì)胞功能 細(xì)胞表面細(xì)胞表面/胞漿胞漿/核的核的 特異性抗原特異性抗原 細(xì)胞活性細(xì)胞活性 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)/外的細(xì)胞因子外的細(xì)胞因子 激素結(jié)合位點(diǎn)激素結(jié)合位點(diǎn) 細(xì)

3、胞受體細(xì)胞受體 鈣離子濃度鈣離子濃度 線粒體膜電位線粒體膜電位 一、流式細(xì)胞儀的工作原理一、流式細(xì)胞儀的工作原理n采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；性與激發(fā)效率；n利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測(cè)的靈敏度和特異性；保證檢測(cè)的靈敏度和特異性；n用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測(cè)速多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析精確性。度與統(tǒng)計(jì)分析精確性。 1.1.流式細(xì)胞儀的

4、基本結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)（1） 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)（2） 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)（3） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（1 1）液）液 流流 系系 統(tǒng)統(tǒng)n 單細(xì)胞懸液?jiǎn)渭?xì)胞懸液n 大多數(shù)儀器檢測(cè)范圍是在大多數(shù)儀器檢測(cè)范圍是在50-300 50-300 m m 大小。大小。n將細(xì)胞懸液注射進(jìn)入鞘液中這一過(guò)程將細(xì)胞懸液注射進(jìn)入鞘液中這一過(guò)程, ,稱為流體動(dòng)力學(xué)聚焦稱為流體動(dòng)力學(xué)聚焦液液 流流 系系 統(tǒng)統(tǒng) 示示 意意 圖圖（2 2）光）光 學(xué)學(xué) 系系 統(tǒng)統(tǒng) 由激光光源由激光光源、分色反光鏡分色反光鏡、光束成形光束成形器器、透鏡組透鏡組、濾片和光電倍增管組成。濾片和光電倍增管組成。FlowFlowTipTipL

5、aserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector流流 式式 細(xì)細(xì) 胞胞 儀儀 與與 顯顯 微微 鏡鏡 的的 區(qū)區(qū) 別別區(qū)別區(qū)別流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡光源光源激光激光自然光、燈光自然光、燈光對(duì)象對(duì)象細(xì)胞、生物粒子細(xì)胞、生物粒子細(xì)胞、組織等細(xì)胞、組織等承載工具承載工具鞘液及流動(dòng)室鞘液及流動(dòng)室載玻片載玻片檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)信號(hào)光學(xué)信號(hào)光學(xué)信號(hào)形態(tài)及染色形態(tài)及染色放大方式放大方式PMTPMT、放大電路、放大電路目鏡目鏡物鏡、光學(xué)放大物鏡、光學(xué)放大統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)計(jì)算機(jī)計(jì)算機(jī)人工人工結(jié)果結(jié)果多參數(shù)，高通量綜合分多參數(shù)，

6、高通量綜合分析析簡(jiǎn)單，單參數(shù)簡(jiǎn)單，單參數(shù)二、散二、散 射射 光光 的的 測(cè)測(cè) 量量 細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍周圍360立體角方向散射的光線信立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向前向散射光散射光和側(cè)向散射光側(cè)向散射光。前前 向向 散散 射射 光（光（FSFS） 前向散射光（前向散射光（forward scatter, FSforward scatter, FS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度度(0.5(0.51

7、010) )向前方散射的訊號(hào)用于向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比與細(xì)胞體積大小成正比。 通常在通常在FCM應(yīng)用中，選取應(yīng)用中，選取FS作閾值，來(lái)排除樣品中的作閾值，來(lái)排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對(duì)被測(cè)細(xì)胞的干擾。各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對(duì)被測(cè)細(xì)胞的干擾。前前 向向 散散 射射 光光 示示 意意 圖圖FALS SensorLaser前向散射光前向散射光側(cè)側(cè) 向向 散散 射射 光（光（SSSS） 側(cè)向散射光（側(cè)向散射光（side scatter, SSside scatter, SS）：）：激光束照

8、射細(xì)胞時(shí)，光以激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以9090角散射角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。側(cè)側(cè) 向向 散散 射射 光光 示示 意意 圖圖FALS Sensor90LS SensorLaser側(cè)向散射光側(cè)向散射光 光光 散散 射射 測(cè)測(cè) 量量 的的 用用 途途 測(cè)得的測(cè)得的FS與與SS信號(hào)通過(guò)計(jì)信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，可得到算機(jī)處理，可得到FS-SS圖，圖，由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。選。 此為血細(xì)胞分類的基本此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。原理，但不能分析表面分子。光散射測(cè)量最有

9、效用途：光散射測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群從非均一群體中鑒別出某些亞群 三、熒三、熒 光光 的的 測(cè)測(cè) 量量n熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。不同。n每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過(guò)波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散通過(guò)波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi)，送入不同的光電倍增射光和熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi)，送入不同的光電倍增管。管。n選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞選擇不同的

10、單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。上的多個(gè)不同特征。熒熒 光光 染染 料料 的的 特特 性性激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)(EMISSION)熒熒 光光 信信 號(hào)號(hào) 的的 檢檢 測(cè)測(cè)n使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析n熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量熒熒 光光 補(bǔ)補(bǔ) 償償5 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC7四、細(xì)四、細(xì) 胞胞 分分 選選 原原 理理 通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行

11、細(xì)胞分選主要是在對(duì)通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。行的。細(xì)細(xì) 胞胞 分分 選選 示示 意意 圖圖細(xì)胞懸液形成液流柱細(xì)胞懸液形成液流柱流動(dòng)室振動(dòng)流動(dòng)室振動(dòng)液流斷裂成液滴液流斷裂成液滴空白液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴含細(xì)胞的液滴棄去棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體壓電晶體產(chǎn)生產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)機(jī)械振動(dòng)不充電不充電充電充電五、數(shù)五、數(shù) 據(jù)據(jù) 的的 顯顯 示示 與與 分分 析析n參數(shù)：參數(shù)：FS,SS,FLFS,SS,FLn數(shù)據(jù)顯示方式數(shù)據(jù)顯示方式 （單參數(shù)直方圖（單參數(shù)直方圖 、雙參數(shù)散點(diǎn)、雙參數(shù)散點(diǎn)圖圖 、二維

12、等高圖、二維等高圖 、假三維等高圖、假三維等高圖 、三參數(shù)、三參數(shù)散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖 ）n設(shè)門分析技術(shù)設(shè)門分析技術(shù)（一）參（一）參 數(shù)數(shù) 說(shuō)說(shuō) 明明FSFS：反映顆粒的大?。悍从愁w粒的大小SSSS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FLFL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少以及熒光種類：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少以及熒光種類（二）（二）數(shù)數(shù) 據(jù)據(jù) 顯顯 示示 方方 式式直分析方圖直分析方圖n單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖n雙參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點(diǎn)圖點(diǎn)圖 二維等高圖二維等高圖 假三維等高圖假三維等高圖n三參數(shù)直方圖三參數(shù)直方圖n多參數(shù)分析多參數(shù)分析1.1.單單 參參 數(shù)數(shù) 直直 方方

13、圖圖 由一維參數(shù)由一維參數(shù)( (散射光或熒光散射光或熒光) )與顆粒計(jì)數(shù)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。單單 參參 數(shù)數(shù) 直直 方方 圖圖細(xì)胞相對(duì)數(shù)細(xì)胞相對(duì)數(shù)量量信道信道(channel(channel ) )2.2.雙雙 參參 數(shù)數(shù) 直直 方方 圖圖n雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。n雙參數(shù)信號(hào)雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是

14、點(diǎn)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。數(shù)量的多少。雙雙 參參 數(shù)數(shù) 直直 方方 圖圖 點(diǎn)點(diǎn) 圖圖綠色熒光強(qiáng)綠色熒光強(qiáng)度度紅色熒光強(qiáng)紅色熒光強(qiáng)度度（三）（三）設(shè)設(shè) 門門 分分 析析 技技 術(shù)術(shù) 1.Gate 1.Gate設(shè)置：指根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布設(shè)置：指根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群。選定其中想要分析的特定細(xì)胞群。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、

15、任意形狀門和十字門。邊形門、任意形狀門和十字門。A 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞B 單核細(xì)胞單核細(xì)胞C 中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞A、B、C均為任均為任意門意門線性門線性門 2. 區(qū)閾區(qū)閾（RegionRegion設(shè)置設(shè)置）: 如十字門分析時(shí)，由四個(gè)如十字門分析時(shí)，由四個(gè)區(qū)閾構(gòu)成，即區(qū)閾構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。 D1：CD4+/CD3-D2：CD4+/CD3+D3：CD4- /CD3-D4：CD4- /CD3+（1）淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)： CD3,CD4,CD8,CD16+56,CD19 免疫功能的變化監(jiān)測(cè)，AIDS（2）HLA-B27:強(qiáng)直性脊柱炎 （3） 白血病免疫分型：白血病的分類（4） 貧血的鑒

16、定：PNH（CD55,CD59）,血小板抗體 (5) . 六、流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用六、流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用七、七、流流 式式 細(xì)細(xì) 胞胞 儀儀 的的 科科 研研 應(yīng)應(yīng) 用用=細(xì)胞周期的分析細(xì)胞周期的分析=干細(xì)胞研究干細(xì)胞研究=癌癥病人的多藥耐藥性癌癥病人的多藥耐藥性=細(xì)胞動(dòng)力學(xué)功能研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)功能研究=環(huán)境微生物分析環(huán)境微生物分析=流式細(xì)胞術(shù)與分子生物學(xué)研究流式細(xì)胞術(shù)與分子生物學(xué)研究=流式細(xì)胞術(shù)在免疫檢驗(yàn)中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在免疫檢驗(yàn)中的應(yīng)用DNA DNA 細(xì)細(xì) 胞胞 周周 期期 分分 析析Scell divisionG1(DNAsynthesis)G2M(mitosis)PIPI染色檢測(cè)細(xì)胞

17、周期染色檢測(cè)細(xì)胞周期 ProtocolProtocol n離心收集細(xì)胞，棄上清，用離心收集細(xì)胞，棄上清，用PBSPBS洗細(xì)胞兩次。洗細(xì)胞兩次。n加入預(yù)冷的加入預(yù)冷的70%70%乙醇，于乙醇，于4 40 0C C固定過(guò)夜，或固定過(guò)夜，或-20-200 0C C長(zhǎng)期固長(zhǎng)期固定。定。n細(xì)胞染色：離心收集細(xì)胞，用細(xì)胞染色：離心收集細(xì)胞，用1mlPBS1mlPBS洗細(xì)胞一次，加洗細(xì)胞一次，加入入500ulPBS500ulPBS（含（含50ug/ml50ug/ml溴化乙錠（溴化乙錠（PIPI），），100ug/mlRNase A,0.2% Triton X-100)4100ug/mlRNase A,0.2

18、% Triton X-100)40 0C C避光孵育避光孵育3030分鐘。分鐘。n流式細(xì)胞儀檢測(cè)：一般細(xì)胞計(jì)數(shù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)：一般細(xì)胞計(jì)數(shù)2-32-3萬(wàn)個(gè)。結(jié)果用軟件萬(wàn)個(gè)。結(jié)果用軟件ModfitModfit分析。分析。 細(xì)細(xì) 胞胞 凋凋 亡亡 的的 檢檢 測(cè)測(cè)n細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞膜通透性的變化細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞膜通透性的變化(Hoechest 33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）nCaspasesCaspases激活激活(Caspase-3 ) n線粒體跨膜電位降低線粒體跨膜電位降低 (Rhodamine123）n膜磷脂酰絲氨酸外化膜磷脂酰絲氨酸外化(Annexin V-FITC/PI)nCa2+ Ca2+ 濃度升高濃度升高 (Fluo-3）nDNADNA斷裂及含量的變化斷裂及含量的變化 (TUNEL 和 PI）