第十章微生物基因工程ppt課件

1、D 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策8 大腸桿菌基因工程大腸桿菌基因工程C 大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略B 外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理A 大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征E 利用重組大腸桿菌消費人胰島素A 大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征8 大腸桿菌基因工程大腸桿菌基因工程大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善繁衍迅速、培育簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA同意為平安的基因工程受體生物A 大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征8 大腸桿菌基因工程大腸桿菌基因工程大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復性功能缺乏對真

2、核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素B 外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理8 大腸桿菌基因工程大腸桿菌基因工程啟動子終止子核糖體結(jié)合位點密碼子質(zhì)粒拷貝數(shù)啟動子啟動子最正確間隔的探測目的基因EEAEE啟動子A 酶切開Bal31酶解目的基因啟動子啟動子的挑選AprorigalKpKO1終止密碼子采用鳥槍法戰(zhàn)略，將適宜大小的DNA片段克隆到啟動子探針質(zhì)粒pKO1上受體細胞染色體DNA上的galE、galT與質(zhì)粒上報告基因galk的表達產(chǎn)物結(jié)協(xié)作用，可將培育基中的半乳糖酵解成紅色素物質(zhì)轉(zhuǎn)化galE+、galT+、galK-的大腸桿菌受體菌株含

3、有外源啟動子活性的重組克隆啟動子啟動子的構(gòu)建-35 區(qū)序列-10 區(qū)序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac啟動子T T G A C AG A T A C TT T G A T AT A T A A TT T G A C AT T A A C TT A G A C AT A A T G TT T T A C AT A T A A TT T G A C AT A T A A TPtac = 3 Ptrp = 11 Plac啟動子啟動子的可控性P乳糖啟動子Plac的可控性：OPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導乳糖 異丙基-b-D-硫代半乳糖苷IPTG野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一同

4、，在沒有誘導物存在時，整個支配子處于基基底程度轉(zhuǎn)錄底程度表達；誘導物可以使啟動子Plac介導的轉(zhuǎn)錄大幅提高啟動子啟動子的可控性Plac乳糖啟動子Plac的可控性：OPlacO高效轉(zhuǎn)錄葡萄糖代謝野生型的Plac上游附近擁有代謝激活因子CAP結(jié)合區(qū)，cAMP激活CAP，CAP基底程度轉(zhuǎn)錄結(jié)合啟動子控制區(qū)，進而促進Plac介導的轉(zhuǎn)錄。葡萄糖代謝使cAMP減少，也能阻遏Plac介導的轉(zhuǎn)錄。因此，基因工程中運用的乳糖啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即Plac UV5CAPcAMPcAMP濃度降低Plac UV5 O高效轉(zhuǎn)錄啟動子啟動子的可控性Ptrp色氨酸啟動子Ptrp的可控性：Otrp除去色氨酸色

5、氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底形狀。在培育系統(tǒng)中去除色氨酸基底程度轉(zhuǎn)錄或者參與3-吲哚丙烯酸IAA，便可有效地解除阻遏抑制造用。在正常的細菌培育體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導Ptrp介導的目基因的表達色氨酸或加3-吲哚丙烯酸高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白 IAAOtrpPtrp高效轉(zhuǎn)錄OtrpPtrp啟動子啟動子的可控性l噬菌體啟動子PlL的可控性：噬菌體啟動子PL受CI阻遏蛋白阻遏，很難直接誘導控制。在基因工程中常運用溫度敏感型的cI突變基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋在42時失活零落，PL便可介導目的基因的表達。但在大型細菌培育罐中迅

6、速升溫非常困難，因此常運用一個雙質(zhì)粒控制系統(tǒng)，用色氨酸間接控制目的基因表達PtrpABcI857PL目的基因阻遏作用PtrpABPL表達色氨酸終止子強化轉(zhuǎn)錄終止的必要性 外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭景象，即RNA聚合酶滑過終止子構(gòu)造繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上臨近的DNA序列，形生長短不一的mRNA混合物 過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達，其緣由如下： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時間就相應(yīng)添加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； 假設(shè)外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標志基因和復制子構(gòu)造等，那么RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄能夠干

7、擾質(zhì)粒的復制及其它生物功能，甚至導致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； 過長的mRNA往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，添加工程菌無謂的能量耗費； 更為嚴重的是，過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能構(gòu)成理想的二級構(gòu)造，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率終止子強終止子的選擇與運用 目前外源基因表達質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA支配子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。對于一些終止作用較弱的終止子，通常可以采用二聚體終止子串聯(lián)的特殊構(gòu)造，以加強其轉(zhuǎn)錄終止作用 終止子也可以象啟動子那樣，經(jīng)過特殊的探針質(zhì)粒從細菌或噬菌體基因組DNA中克隆挑選pCP1AproriTcr挑選Apr、Tcs的轉(zhuǎn)化子核糖體結(jié)合位點 外

8、源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率親密相關(guān)。大腸桿菌細胞中構(gòu)造不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5 端的構(gòu)造序列所決議，稱為核糖體結(jié)合位點RBS 核糖體結(jié)合位點大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括以下四個特征構(gòu)造要素：位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列5 UAAGGAGG 3，即Shine-DalgarnoSD序列，它經(jīng)過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3端區(qū)域3 AUUCCUCC 5并與之專注性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；翻譯起始密

9、碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，但有些基因也運用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子；SD序列與翻譯起始密碼子之間的間隔及堿基組成；基因編碼區(qū)5 端假設(shè)干密碼子的堿基序列 核糖體結(jié)合位點的構(gòu)造核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響SD序列的影響： 普通來說，mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于SD序列與16S rRNA的堿基互補性，其中以GGAG四個堿基序列尤為重要。對多數(shù)基因此言，上述四個堿基中任何一個換成C或T，均會導致翻譯效率大幅度降低 核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響SD序列與起始密碼子之間的序列

10、的影響： SD序列下游的堿基假設(shè)為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率那么分別是最高值的50%和25%。緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響，對于大腸桿菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個位置上最正確的堿基組合是UAU或CUU，假設(shè)用UUC、UCA或AGG取代之，那么酶的表達程度低20倍核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響SD序列與起始密碼子之間的間隔的影響： SD序列與起始密碼子之間的準確間隔保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正益處于核糖體復合物構(gòu)造中的P位，這是翻譯啟動的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七

11、個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導致翻譯起始效率不同程度的降低核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響起始密碼子及其后續(xù)假設(shè)干密碼子的影響： 大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時識別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但其識別頻率并不一樣，通常GUG為AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，從AUG開場的前幾個密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與mRNA的5 端非編碼區(qū)構(gòu)成莖環(huán)構(gòu)造，否那么便會嚴重干擾mRNA在核糖體上的準確定位 目前廣泛用于外源基因表達的大腸桿菌表達型質(zhì)粒上，均含有與啟動子來源一樣的核糖體結(jié)合位點序列，序列和間隔是最正確的 密碼子

12、生物體對密碼子的偏愛性 不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子運用頻率并不一樣，具有一定的偏愛性，其決議要素是： 生物基因組中的堿基含量 在富含AT的生物如單鏈DNA噬菌體fX174基因組中，密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高；而在GC豐富的生物如鏈霉菌基因組中，第三位上含有G或C的簡并密碼子占90%以上的絕對優(yōu)勢 密碼子與反密碼子相互作用的自在能 性中等強度規(guī)律 細胞內(nèi)tRNA的含量如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等運用少；如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等運用多；密碼子密碼子偏愛性對外源基因表達的影響 由

13、于原核生物和真核生物基因組中密碼子的運用頻率具有較大程大的差別性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高 效翻譯的一個重要要素是密碼子的正確選擇。普通而言，有兩種戰(zhàn)略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細胞中獲得最正確表達： 外源基因全合成同步表達相關(guān)tRNA編碼基因密碼子密碼子偏愛性對外源基因表達的影響按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，設(shè)計改換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長激素在大腸桿菌中的高效表達均采用了這種方法 外源基因全合成密碼子密碼子偏愛性對外源基因表達的影響 對于那些含有不調(diào)和密碼子種類單一、出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因此言，那么

14、選擇相關(guān)tRNA編碼基因同步克隆表達的戰(zhàn)略較為有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412個密碼子中，共含有22個精氨酸密碼子，其中7個AGG、2個AGA，而大腸桿菌受體細胞中tRNAAGG和tRNAAGA的豐度較低。為了提高人尿激酶原cDNA在大腸桿菌中的高效表達，將大腸桿菌的這兩個tRNA編碼基因克隆在另一個高表達的質(zhì)粒上。由此構(gòu)建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細胞對外源基因高效表達的制約作用同步表達相關(guān)tRNA編碼基因質(zhì)粒拷貝數(shù)質(zhì)?？截悢?shù)對細菌生長代謝的影響 目前實驗室里廣泛運用的表達型質(zhì)粒在每個大腸桿菌細胞中可達數(shù)百甚至上千個拷貝，質(zhì)粒的擴增過程通常發(fā)生在受體細胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此

15、時正是細菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達勢必會影響受體細胞的生長代謝，進而導致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達程度的下降 處理上述難題的一種有效戰(zhàn)略是將重組質(zhì)粒的擴增納入可控制的軌道質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒擴增時序的控制pCP3擁有一個溫度可誘導型的復制子pCP3PLMCSoriApr在28時，每個細胞的質(zhì)?？截悢?shù)為60在42時，拷貝數(shù)迅速增至300 - 600在此溫度下，受體細胞染色體上的CI基 因表達的溫度敏感型阻遏蛋白失活 因此，用一種手段同時控制質(zhì)?？?貝數(shù)和基因的表達C 大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略6 大腸桿菌基因工程大腸桿菌基因工程包涵體型異源蛋白的

16、表達分泌型異源蛋白的表達交融型異源蛋白的表達寡聚型異源蛋白的表達整合型異源蛋白的表達蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構(gòu)建包涵體型異源蛋白的表達包涵體及其性質(zhì) 在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內(nèi)，或被膜包裹或構(gòu)成無膜裸露構(gòu)造，這種水不溶性的構(gòu)造稱為包涵體Inclusion Bodies，IB。富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培育基的大腸桿菌細胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會喪失其理化特性和生物功能，從而集聚構(gòu)成包涵體。由高效表達質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在普通情況下也以包涵體的方式存在于細菌細胞

17、內(nèi)。除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子包涵體型異源蛋白的表達以包涵體方式表達目的蛋白的優(yōu)缺陷能簡化外源基因表達產(chǎn)物的分別操作 包涵體表達方式的優(yōu)點：包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接經(jīng)過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分別出來能在一定程度上堅持表達產(chǎn)物的構(gòu)造穩(wěn)定 在構(gòu)成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用根本上對異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成要挾包涵體型異源蛋白的表達以包涵體方式表達目的蛋白的優(yōu)缺陷包涵體表達方式的缺陷： 以包涵體方式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必需經(jīng)過有效的變性復性操作，才干回收得到具有正

18、確空間構(gòu)象因此具有生物活性的目的蛋白，因此包涵體變復性操作的效率對目的產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。然而，這也是一個技術(shù)難題，尤其當目的蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時，體外復性蛋白質(zhì)的勝利率相當?shù)停胀ú怀?0%包涵體型異源蛋白的表達以包涵體方式表達目的蛋白的操作 假設(shè)未進展特殊設(shè)計如分泌型表達或交融型表達，外源基因在大腸桿菌中表達的蛋白量占細胞總蛋白量20%以上時，表達產(chǎn)物普通傾向于構(gòu)成包涵體。因此，以包涵體方式表達目的基因操作的關(guān)鍵就是選擇高表達的載體。現(xiàn)實上，這種高表達率也是包涵體法的優(yōu)點所在包涵體型異源蛋白的表達包涵體的變性與復性操作C 共價修飾的蛋共價修飾的蛋白質(zhì)白質(zhì)蛋白量變性復性的動力學

19、原理：C1C2CnCUI 1I nNX1X2XnXAgAgAgAgI 有效變復性過程中的中有效變復性過程中的中間形狀間形狀X 脫離有效變復性過程而進入集聚的脫離有效變復性過程而進入集聚的中間形狀中間形狀N 天然形狀的蛋天然形狀的蛋白質(zhì)白質(zhì)U 變性形狀的蛋變性形狀的蛋白質(zhì)白質(zhì)A 集聚形狀的蛋白集聚形狀的蛋白質(zhì)質(zhì)在細菌細胞內(nèi)，集聚形狀和共價修飾的蛋白質(zhì)不能進入復性過程，因此永遠成為無活性的蛋白質(zhì)。包涵體中的蛋白質(zhì)就屬于這兩種形狀，因此需求在體外進展人工變性解除共價修飾和驅(qū)散集聚體復性操作包涵體型異源蛋白的表達包涵體的變性與復性操作包涵體的溶解與變性： 包涵體的溶解與變性的主要義務(wù)是拆開錯配的二硫鍵

20、和次級鍵在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復性途徑中。能有效促進包涵體溶解變性的試劑和條件包括： 清洗劑 SDS、正十二醇肌氨酸，廉價，但影響復性和純化 促溶劑 鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素廉價，但常被自發(fā) 構(gòu)成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反響 混合溶劑 如尿素與醋酸、二甲基砜等結(jié)合運用，溶解力加強 極端pH 廉價，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反響包涵體型異源蛋白的表達包涵體的變性與復性操作包涵體的復性與重折疊refolding： 包涵體的復性與重折疊的主要義務(wù)是：經(jīng)過次級鍵的構(gòu)成使蛋白質(zhì)復性將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊包涵體型異源蛋白的表達包涵體的變性與復性操作包涵體

21、的復性與重折疊refolding：復性操作 包涵體復性操作的方法包括：分段稀釋法，逐漸降低變性劑的濃度，防止二次集聚的發(fā)生一步稀釋法，蛋白復性與濃度無關(guān)，但集聚與濃度關(guān)系很大試劑添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修飾法，氨基檸檬酸酐?；鞍讕ж撾?，抑制集聚產(chǎn)物隔離法，將變性的蛋白分子固定化，防止其相互碰撞分子伴侶法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表達包涵體型異源蛋白的表達包涵體的變性與復性操作包涵體的復性與重折疊refolding：二硫鍵構(gòu)成在包涵體變性體系中，一直存在著復原劑，使多肽鏈中的巰基堅持復原形狀，防化學氧化法A需求電子受體，最廉價的電子受體為空

22、氣，二硫鍵構(gòu)成是二硫鍵交換B需求復原型和氧化型谷胱甘肽GSH和GSSG，二硫鍵止二硫鍵錯配導致嚴重的集聚。在變性操作終了后，這些游離型的巰基必需重新配對構(gòu)成二硫鍵，此時多肽鏈也重新發(fā)生折疊。構(gòu)成二硫鍵的方式主要有： 隨機的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊 構(gòu)成相對特異，因此適用性較廣，重折疊效果好HSHS S S+2e+2H+AHSHS S-S-R HS+BR-S-S-R S S2R-SH分泌型異源蛋白的表達 在大腸桿菌中表達的異源蛋白按其在細胞中的定位可分為兩種方式：即以可溶性或不溶性包涵體形狀存在于細胞質(zhì)中；或者經(jīng)過運輸或分泌方式定位于細胞周質(zhì)，甚至穿過外膜進入培育基中。

23、蛋白產(chǎn)物N端信號肽序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件分泌型異源蛋白的表達以分泌方式表達目的蛋白的優(yōu)缺陷分泌表達方式的優(yōu)點：目的蛋白穩(wěn)定性高 重組人胰島素原假設(shè)分泌到細胞周中，其穩(wěn) 穩(wěn)定性大約是在細胞質(zhì)中的10倍目的蛋白易于分別目的蛋白末端完好 相當多的真核生物成熟蛋白N端并不含有 甲硫氨酸殘基。當這些真核基因在大腸桿菌中表達時，蛋白質(zhì) N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如假設(shè)將外源基因與大腸 桿菌的信號肽編碼序列重組在一同，一旦分泌型表達，其N端 的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去分泌型異源蛋白的表達以分泌方式表達目的蛋白的優(yōu)缺陷分泌表達方式的缺陷： 相對其它生物細胞而言，大腸桿菌

24、的蛋白分泌機制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進展分泌型表達，少數(shù)外源基因既便能分泌表達，但其表達率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌雖然有，但并不普遍分泌型異源蛋白的表達蛋白質(zhì)的分泌機制原核細菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機折疊，分泌在細胞周質(zhì)或培育基中的重組蛋白很少構(gòu)成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率添加，且對蛋白酶不敏感 分泌型異源蛋白的表達分泌型目的蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建 包括大腸桿菌在內(nèi)的絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質(zhì)直接分泌到胞外，但有些革蘭氏陰性菌能將細菌的抗菌蛋

25、白細菌素分泌到培育基中，這一過程嚴厲依賴于細菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi)上的磷酸酯酶，導致細菌內(nèi)外膜的通透性增大。 因此，只需將細菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個適宜的質(zhì)粒上即可構(gòu)建完全分泌型的受體細胞。此時，用另一種攜帶大腸桿菌信號肽編碼序列和目的基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述完全分泌型受體細胞，并運用一樣性質(zhì)的啟動子介導目的基因的轉(zhuǎn)錄，那么可實現(xiàn)目的蛋白從重組大腸桿菌中的完全分泌。交融型異源蛋白的表達 除了直接表達異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌本身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一同，并作為一個開放型閱讀框架進展表達。由這種雜合基因表達出的蛋白質(zhì)稱為交融蛋白。在這種交融蛋白構(gòu)造中，通常受體細菌的蛋白部分位

26、于N端，異源蛋白位于C端。經(jīng)過在DNA程度上人工設(shè)計引入的蛋白酶切割位點或化學試劑特異性斷裂位點，可以在體外從純化的交融蛋白分子中釋放回收異源蛋白交融型異源蛋白的表達以交融方式表達目的蛋白的優(yōu)缺陷目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對分子量較小的多肽效果更佳目的蛋白易于分別 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進目的蛋白表達率高 與受體蛋白共用一套完善的表達元件 胞內(nèi)構(gòu)成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性 目的蛋白。在實踐消費中，產(chǎn)品主要的本錢往往就在該工段 行親和層析，可以快速獲得純度較高的交融蛋白目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，交融蛋白往往能在目的蛋白需求回收 交融蛋白需求裂解和進一步分別，才干獲交融

27、型異源蛋白的表達交融型目的蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建交融蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建原那么：受體細胞的構(gòu)造基因能高效表達，且其表達產(chǎn)物可以經(jīng)過親和層析進展特異性簡單純化兩個構(gòu)造基因拼接位點處的序列設(shè)計非常重要，它直接決議著為目的蛋白分別回收發(fā)明條件外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為交融蛋白提供終止密碼子。在某些情況下，并不需求完好的受體構(gòu)造基因，目的是盡能夠防止交融蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近，交融蛋白的裂解工藝兩個蛋白編碼序列應(yīng)堅持一致的翻譯閱讀框架 交融型異源蛋白的表達交融型目的蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建用于交融蛋白構(gòu)建的受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST 維持良好空間構(gòu)象硫氧化復原蛋白TrxA 維持良好空

28、間構(gòu)象 pTrxFus麥芽糖結(jié)合蛋白MBP 促進分泌金黃色葡萄球菌蛋白ASAPA 免疫親和層析 pRIT2T外膜蛋白OmpF 促進分泌b-半乳糖苷酶LacZ 免疫親和層析泛素蛋白Ubi 維持良好空間構(gòu)象交融型異源蛋白的表達目的蛋白的回收 交融蛋白中受體蛋白部分的存在能夠會影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，假設(shè)將之注入人體還會導致免疫反響，因此在制備和消費藥用目的蛋白時，將交融蛋白中的受體蛋白部分完好除去是必不可少的工序。交融蛋白的位點專注性斷裂方法有兩種： 化學斷裂法 酶促裂解法 交融型異源蛋白的表達目的蛋白的回收 用于蛋白位點專注性化學斷裂的最正確試劑為溴化氰CNBr它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘

29、基側(cè)鏈的硫醚基反響，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，構(gòu)成兩個多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基堅持不變。這一方法的優(yōu)點是回收率高可到達85%以上，專注性強，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細胞中的成熟表達產(chǎn)物較為接近。然而，假設(shè)異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，那么不能用此方法化學斷裂法：交融型異源蛋白的表達目的蛋白的回收酶促裂解法：單殘基位點蛋白內(nèi)切酶切割位點梭菌蛋白酶 Arg-C葡萄球菌蛋白酶 Glu-C假單孢菌蛋白酶 Lys-C豬胰蛋白酶 Arg-C Lys-C蛋白酶酶促裂解法的特點是斷裂效率更

30、高，同時每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點決議簇，因此可供選擇的專注性斷裂位點范圍較廣。幾種斷裂位點專注性最強的商品化蛋白酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開酰胺鍵，構(gòu)成不含上述殘基的下游斷裂肽段，與溴化氰化學斷裂法類似。用上述蛋白酶裂解交融蛋白的前提條件是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基，假設(shè)外源基因表達產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但大分子量的異源蛋白來說，上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率是相當高的Arg CNNC受體蛋白目的蛋白交融型異源蛋白的表達目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點 為了抑制僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來的運用局限性，可在受體蛋白編碼

31、序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列Ile-Glu-Gly-Arg的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的識別和作用序列，其斷裂位點在Arg的C末端。純化后的交融蛋白用Xa處置，即可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的識別作用序列由四個氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從交融蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物交融型異源蛋白的表達目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點啟動子 受體基因 接頭 目的基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgArgLysGluIle-Glu-gly-Arg表達親

32、和層析酶解回收交融型異源蛋白的表達目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點Pinpoint Xatac生物素結(jié)合肽編碼序列Xa因子識別位點編碼序列SP6T7AproriMCSATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGCATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGCXa-1Ile Glu Gly Arg GluIle Glu Gly Arg GluATC GAA

33、 GGT CGC GAA AGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG CATC GAA GGT CGC GAA AGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG CXa-2ATC GAA GGT CGC GAA AAG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GCATC GAA GGT CGC GAA AAG CTT CAG CTG GGA TCC GGT

34、 ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GCXa-3 NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotIXa因子切割位點寡聚型異源蛋白的表達 從實際上講，外源基因的表達程度與受體細胞中可轉(zhuǎn)錄基因的拷貝數(shù)即基因劑量呈正相關(guān)。然而重組質(zhì)粒除了含有外源基因外，還攜帶其它的可轉(zhuǎn)錄基因，如作為挑選標志的抗生素抗性基因等。隨著重組質(zhì)?？截悢?shù)的不斷添加，受體細胞內(nèi)的大部分能量和原料被用于合成一切的重組質(zhì)粒編碼蛋白，而細胞的正常生長代謝卻因能量不濟遭到影響，因此經(jīng)過添加質(zhì)?？截悢?shù)提高外源基因表達產(chǎn)物的產(chǎn)量往往不能獲得稱心的效

35、果。 另一種經(jīng)過添加外源基因劑量而提高目的蛋白產(chǎn)量的有效方法是構(gòu)建寡聚串聯(lián)型異源蛋白表達載體，即將多拷貝的外源基因克隆在一個低拷貝質(zhì)粒上，以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表達的戰(zhàn)略寡聚型異源蛋白的表達以寡聚方式表達目的蛋白的優(yōu)缺陷目的蛋白高效表達在不提高質(zhì)粒拷貝數(shù)的前提下，添加目的基因的拷貝數(shù)，可以穩(wěn)定表達小分子短肽在一定程度上改善表達量目的產(chǎn)物回收困難短肽由于缺乏有效的空間構(gòu)造，在細菌細胞中的半衰期較短。串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)類似的長度及空間構(gòu)造，因此抗蛋白酶降解的才干大幅度提高寡聚短肽需求裂解和進一步分別，才干獲最終分子，但裂解后的短肽分子容易出現(xiàn)序列不均一性寡聚型異源蛋白的表達寡聚型目的

36、蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建PSDgenegenegenegeneT1 T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr根本戰(zhàn)略：寡聚型異源蛋白的表達寡聚型目的蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建構(gòu)建舉例：P SDT1 T2EcoRIBamHIAATTCAGATCT GTCTAGAGCCTAGEcoRI Bgl IIBamHIEcoRIBamHIBgl II GATCT AGCCTAGEcoRIBamHIBgl IIEcoRIBamHIBgl IIEcoRI + BamHIBgl II + BamHIBamHI整合型異源蛋白的表達以整合方式表達目的蛋白的優(yōu)缺陷目的基因穩(wěn)定表達整合型的目的基因隨受體細胞染色體DN

37、A的復制而復制，在大多數(shù)情況下相當穩(wěn)定，工程菌在沒有選擇壓力存在下可以延續(xù)目的基因表達率低單拷貝整合的目的基因表達率遭到限制，此時可經(jīng)過強化表達元件而加以補償培育而不喪失目的基因表達盒，這對以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程案例特別有意義整合型異源蛋白的表達DNA體內(nèi)重組的根本原理 在生物體細胞尤其是原核細菌細胞內(nèi)，廣泛存在著DNA的遺傳重組機制，其能夠的生物學效果是促進生物種群的進化。細胞內(nèi)的遺傳重組可分為兩大類： 轉(zhuǎn)位因子依賴型同源序列依賴型整合型異源蛋白的表達DNA體內(nèi)重組的根本原理 轉(zhuǎn)位因子是指生物細胞內(nèi)天然存在的一類無復制才干的DNA可挪動因子，不同生物種群擁有構(gòu)造不同的轉(zhuǎn)位因子，例

38、如： 轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子家族噬菌體 G片段G-Fragment 原核細菌 插入順序IS 真核細菌 轉(zhuǎn)座子Tn、Ty 高等植物 可挪動因子Ac、Ds 高等動物 騰躍基因mobil gene 整合型異源蛋白的表達DNA體內(nèi)重組的根本原理轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子的構(gòu)造IS1 kbTy5 kbTn2 - 20 kbACCATGGTTTTGGTACCA抗藥性基因轉(zhuǎn)位酶基因識別位點 阻遏基因IRIRIRIRISIS整合型異源蛋白的表達DNA體內(nèi)重組的根本原理轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：整合方式整合型異源蛋白的表達DNA體內(nèi)重組的根本原理 在很多原核細菌細胞中，染色體DNA鏈上的兩個

39、同源區(qū)之間可發(fā)生所謂的同源重組，其頻率與細菌種類、兩個同源區(qū)之間的間隔同源區(qū)的長度、同源程度親密相關(guān)。普通地說，間隔越遠、長度越長、同源性越高，重組的頻率也就越高，反之亦然。 同源重組有整合和交換兩種方式，前者只需求一個斷裂位點，而后者涉及兩個斷裂位點同源序列依賴型的體內(nèi)重組：根本方式整合型異源蛋白的表達DNA體內(nèi)重組的根本原理同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源整合ori目的基因同源區(qū)域標志基因整合位點染色體DNA整合型異源蛋白的表達DNA體內(nèi)重組的根本原理同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源交換ori目的基因同源區(qū)域標志基因交換區(qū)域染色體DNAori標志基因+ +蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構(gòu)建 無論

40、是在真核生物還是在原核細胞中，重組目的蛋白表達后都會面臨被降解的命運，其穩(wěn)定性甚至還不如半衰期較短的受體細胞內(nèi)源性蛋白質(zhì)。 在大多數(shù)情況下，重組目的蛋白的不穩(wěn)定性可歸結(jié)為對受體細胞蛋白酶系統(tǒng)的敏感性。然而越來越多的實驗闡明，重組目的蛋白在受體細胞內(nèi)的半衰期可以經(jīng)過蛋白序列的人工設(shè)計以及受體細胞的改造加以調(diào)整和控制。蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構(gòu)建 實驗結(jié)果闡明，大多數(shù)不穩(wěn)定的重組目的蛋白是被大腸桿菌中的蛋白酶La和Ti降解的，兩者分別由lon和clp基因編碼，其蛋白水解活性依賴于ATP。lon基來由熱休克等環(huán)境壓力激活，細胞內(nèi)異常蛋白或重組異源蛋白的過量表達也可作為一種環(huán)境壓力誘導lon基因的

41、表達。lon-的大腸桿菌突變株可使原來半衰期較短的細菌調(diào)控蛋白如SulA、RscA、lN穩(wěn)定性大增，因此被廣泛用作外源基因高效表達的受體菌。蛋白酶缺陷型受體細胞的改造lon基因缺陷的大腸桿菌受體lon -：蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構(gòu)建 大腸桿菌中龐大的熱休克蛋白家族對異常或異源蛋白的降解也有重要作用，其機理是脅迫異?；虍愒吹鞍讟?gòu)成一種對蛋白酶識別和降解較有利的空間構(gòu)象，從而提高異常或異源蛋白對蛋白酶的敏感性。熱休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及環(huán)境壓力特異性s因子編碼基因htpR的突變株均呈現(xiàn)出對異源蛋白降解作用的嚴重缺陷，特別是lon-htpR-的雙缺陷株，非常適宜高效

42、表達各種不穩(wěn)定的重組異源蛋白。蛋白酶缺陷型受體細胞的改造htpR基因缺陷的大腸桿菌受體htpR -：蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構(gòu)建 大量的實驗結(jié)果闡明，在一切的極性氨基酸中，天門冬氨酸Asp的存在對提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的效應(yīng)最顯著，而且Asp殘基離C末端越近，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性就越大。更為重要的是，在多種構(gòu)造和功能相互獨立的蛋白質(zhì)C末端引入Asp殘基，都能顯著地延伸這些蛋白質(zhì)的半衰期，因此具有普遍意義。抗蛋白酶的重組異源蛋白序列的設(shè)計多肽鏈C末端氨基酸序列對穩(wěn)定性的影響：蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構(gòu)建 大量的實驗結(jié)果同時闡明，假設(shè)多肽鏈的N末端序列中含有較高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、H

43、is，那么蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性顯著改善。 相反，N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白質(zhì)，在真核和原核細胞中的半衰期通常很短，尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列PEST序列，是胞內(nèi)蛋白酶的超敏感區(qū)?？沟鞍酌傅闹亟M異源蛋白序列的設(shè)計多肽鏈N末端氨基酸序列對穩(wěn)定性的影響：D 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策8 大腸桿菌基因工程大腸桿菌基因工程基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制改善基因工程菌不穩(wěn)定性的戰(zhàn)略基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)方式 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表如今重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有以下兩種表現(xiàn)方式：構(gòu)造不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一

44、區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導致其表觀生物學功能的喪失分配不穩(wěn)定性整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸curing基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)活力制受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達產(chǎn)物的毒性誘導受體細胞外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝產(chǎn)生應(yīng)激反響：封鎖合成途徑，啟動降解程序重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時的不均勻分配這是重組質(zhì)粒逃逸的根本緣由受體細胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制重組質(zhì)粒的逃逸率一部分細胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細胞數(shù)與總細胞數(shù)之比稱為 當含有重組質(zhì)粒的

45、工程菌在非選擇性條件下生長時，培育系統(tǒng)中稱為重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率。重組質(zhì)粒逃逸的緣由有： 高溫培育、外表活性劑SDS、藥物利福平、染料 吖啶促使重組質(zhì)粒滲漏 受體細胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時不均勻分配，細胞所含重組質(zhì)粒 拷貝數(shù)的差別隨著細胞分裂次數(shù)的增多而加劇改善基因工程菌不穩(wěn)定性的戰(zhàn)略改良載體受體系統(tǒng) 以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括：將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表達型載體中，其表達產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細胞正確設(shè)置載體上的多克隆位點，制止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)將受體細胞的致死性基因安裝在載體上，同時構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸

46、桿菌的ssb基因DNA單鏈結(jié)合蛋白編碼基因改善基因工程菌不穩(wěn)定性的戰(zhàn)略施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標志，向培育系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素藥物和食品消費時制止運用抗生素根據(jù)載體上的營養(yǎng)缺陷型標志，向培育系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營培育基復雜，本錢較高養(yǎng)組份改善基因工程菌不穩(wěn)定性的戰(zhàn)略控制目的基因的過量表達運用可控型啟動子控制目的基因的定時表達及表達程度運用可控型復制子控制質(zhì)粒的定時增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)優(yōu)化基因工程菌的培育工藝培育基組成：限制培育基比豐富培育基更有利于穩(wěn)定培育溫度： 較低的培育溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定E 利用重組大腸桿菌消費人胰島素8 大腸桿菌基因工程大腸桿菌基因工程胰島素的構(gòu)造及其生物合成

47、人胰島素的消費方法重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建胰島素的構(gòu)造及其生物合成SSSSCNSSB 肽30C 肽31A 肽21RRRKSSSSCNSSNC高爾基體內(nèi)的特異性肽酶NC信號肽B 肽C 肽A 肽信號肽酶人胰島素的消費方法直接提取法制人胰島素迄今為止，有四種大規(guī)模消費人胰島素的方法：早期人的胰島素是從人的胰臟中直接分別純化的，由于原料供應(yīng)的限制，其產(chǎn)量遠遠不能滿足日益增多的糖尿病人的臨床需求。人胰島素的消費方法化學合成法制人胰島素根據(jù)人胰島素A鏈和B鏈的序列，由單個氨基酸從頭合成。這條化學全合成的道路從技術(shù)上來說是可以做到的，但其消費本錢奇高，從而也限制了產(chǎn)品的廣泛運用。人胰島素的消費方法化學轉(zhuǎn)型法制人胰島素 豬的胰島素可從原料豐富的豬胰臟中提取獲得，而且豬胰島素與人胰島素只在B鏈的C末端有一個氨基酸的差別，豬的為Ala，人的為Thr，因此將豬胰島素在體外酶促轉(zhuǎn)化為人