基因工程課時(shí)

1、基因工程課時(shí)切切接接轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)增增檢檢基因工程內(nèi)容和步驟第1頁(yè)/共73頁(yè)基因克隆和基因克隆和DNA分析（分析（第第5版版）第一部分第一部分 基因克隆和基因克隆和DNA分析的基本原理分析的基本原理第1章 為什么說(shuō)基因克隆與DNA分析非常重要第2章 基因克隆的載體質(zhì)粒和噬菌體第3章 從活細(xì)胞中純化DNA第第4章章 DNA純化后的利用純化后的利用第5章 將DNA引入活細(xì)胞第6章 大腸桿菌的克隆載體第7章 真核生物的克隆載體第8章 怎樣獲得特定基因的克隆第9章 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）第二部分第二部分 基因克隆和基因克隆和DNA分析在研究中的應(yīng)用分析在研究中的應(yīng)用第10章 基因的位置和結(jié)構(gòu)的研究第11章 基因

2、表達(dá)和功能的研究第12章 基因組研究第三部分第三部分 基因克隆和基因克隆和DNA分析在生物技術(shù)中的應(yīng)用分析在生物技術(shù)中的應(yīng)用第13章 克隆基因的表達(dá)第14章 基因克隆和DNA分析在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第15章 基因克隆和DNA分析在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用第16章 基因克隆和DNA分析在法醫(yī)學(xué)和考古學(xué)中的應(yīng)用第2頁(yè)/共73頁(yè)第4章 DNA純化后的利用DNA操作酶DNA連接酶DNA限制性內(nèi)切酶第3頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍核酸酶（nuclease）連接酶（ligase）聚合酶（polymerase）修飾酶（modifying enzyme）拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）其它第4頁(yè)/

3、共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶定義：打斷DNA鏈中連接相鄰核苷酸的磷酸二酯鍵第5頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶分類：外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶從DNA分子的末端一個(gè)一個(gè)地切除核苷酸鏈在一個(gè)DNA分子內(nèi)部打開(kāi)磷酸二酯鍵第6頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶外切核酸酶（單鏈或雙鏈切割）-Bal31Bal

4、31：同時(shí)對(duì)DNA分子的雙鏈末端一個(gè)一個(gè)地切除核苷酸鏈越來(lái)越短單核苷酸第7頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶外切核酸酶（單鏈或雙鏈切割）-核酸外切酶核酸外切核酸外切酶酶：可以從DNA雙鏈中一條鏈的3 末端一個(gè)一個(gè)地切除核苷酸鏈產(chǎn)物：?jiǎn)捂淒NA分子（不能作用于單鏈分子）第8頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶內(nèi)切核酸酶（單鏈或雙鏈切割）-S1核酸酶S1核酸核酸酶酶：催化單鏈DNA分子降解成為5單核苷酸

5、作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)，并從此處切斷核酸分子第9頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶內(nèi)切核酸酶（單鏈或雙鏈切割）-DNaseDNase（脫氧核糖核酸酶） ：打開(kāi)DNA分子內(nèi)部任意的磷酸二酯鍵（包括單鏈和雙鏈）產(chǎn)物為單核苷酸與寡核苷酸或單核苷酸（可以用在RNA提取中去除DNA）第10頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶內(nèi)切核酸酶（單鏈或雙鏈切割）-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶：能夠識(shí)別雙鏈D

6、NA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶基因工程中主要工具酶-一把特殊的剪刀第11頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.2 連接酶：將兩個(gè)核酸分子連接起來(lái)的酶連接酶：將兩個(gè)核酸分子連接起來(lái)的酶DNA連接酶DNA連連接接酶酶（ （ligase） ）：在一條DNA鏈的3末端具有一個(gè)游離的羥基（-OH），和在另一條DNA鏈的5-末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)（-P）的情況下，能夠催化在2條DNA鏈之間形成的磷酸二酯鍵第12頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍缺口（nick）裂口（gap）第13頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1

7、.3 聚合酶：復(fù)制核酸分子的酶聚合酶：復(fù)制核酸分子的酶DNA聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶：能夠合成一條與一直模板DNA或者RNA互補(bǔ)的新DNA雙鏈要素：模版和引物第14頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.3 聚合酶：復(fù)制核酸分子的酶聚合酶：復(fù)制核酸分子的酶種類很多，基因工程中常用到四種（1）DNA聚合酶（大腸桿菌）DNADNA聚合酶聚合酶：當(dāng)DNA雙鏈分子中存在一個(gè)單鏈缺口時(shí)，DNA聚合酶與單鏈區(qū)域結(jié)合，合成一條新鏈，替換并降解原來(lái)存在的那段DNA具備DNA合成和水解雙重酶活性第15頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.3 聚合酶：復(fù)制核酸分子的酶聚

8、合酶：復(fù)制核酸分子的酶（2）Klenow片段（DNA聚合酶一部分）DNADNA聚合酶聚合酶的合成酶活性和水解酶活性是由酶分子的不同部分控制，其中酶分子前段325個(gè)氨基酸具有水解酶活性，切掉這一部分后，剩下的部分則只具有聚合酶活性，剩下的DNA聚合酶片段稱為KlenowKlenow片段片段，在基因工程中可以用來(lái)補(bǔ)缺口第16頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.3 聚合酶：復(fù)制核酸分子的酶聚合酶：復(fù)制核酸分子的酶（3）Taq DNA聚合酶（PCR）TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶是一種來(lái)源于嗜熱菌Thermus aquaticus的高度熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，95孵育時(shí)的

9、半衰期大于40分鐘第17頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.3 聚合酶：復(fù)制核酸分子的酶聚合酶：復(fù)制核酸分子的酶（4）反轉(zhuǎn)錄酶（病毒，依賴于RNA的DNA聚合酶）反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶是以RNA為模版合成互補(bǔ)的DNA鏈（cDNA）第18頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.4 修飾酶：去除或添加化學(xué)基團(tuán)的酶修飾酶：去除或添加化學(xué)基團(tuán)的酶（1）堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）堿性磷酸酶堿性磷酸酶：去除DNA分子5末端的磷酸基團(tuán)第19頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍第20頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4

10、.1.4 修飾酶：去除或添加化學(xué)基團(tuán)的酶修飾酶：去除或添加化學(xué)基團(tuán)的酶（2）多核苷酸激酶（polynucleotide kinase）多核苷酸激酶多核苷酸激酶：在DNA分子5游離末端添加磷酸基團(tuán)（活性正好和堿性磷酸酶相反堿性磷酸酶相反）第21頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.4 修飾酶：去除或添加化學(xué)基團(tuán)的酶修飾酶：去除或添加化學(xué)基團(tuán)的酶（3）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：在DNA分子3末端添加一個(gè)或多個(gè)脫氧核苷酸構(gòu)建人工粘性末端，不需要模板第22頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.5 拓?fù)洚悩?gòu)酶：向共價(jià)閉合環(huán)狀拓?fù)?/p>

11、異構(gòu)酶：向共價(jià)閉合環(huán)狀DNA中引入或消除雙螺旋的酶中引入或消除雙螺旋的酶第23頁(yè)/共73頁(yè)第24頁(yè)/共73頁(yè)限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能限制性內(nèi)切酶II在特定的核苷酸序列處切割DNADNA分子中識(shí)別序列的出現(xiàn)頻率在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行限制性酶切對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析DNA分子大小的估計(jì)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶通過(guò)作圖標(biāo)出一個(gè)DNA分子上的不同限制性位點(diǎn)平末端和黏末端第25頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶準(zhǔn)確可重復(fù)第26頁(yè)/共73頁(yè)4.2.1 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制

12、性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶20世紀(jì)50年代宿主調(diào)控性限制第27頁(yè)/共73頁(yè)4.2.1 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶第28頁(yè)/共73頁(yè)1970年年H.O. Smith等分離出第一種限制性核酸內(nèi)切酶。等分離出第一種限制性核酸內(nèi)切酶。Werner Arber 理論預(yù)見(jiàn)限制酶理論預(yù)見(jiàn)限制酶Daniel Nathans 用限制酶切得用限制酶切得SV40 DNA片斷片斷Hamilton O. Smith 得到第一個(gè)限制酶得到第一個(gè)限制酶1978年年Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)4.2.1 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和

13、功能4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶第29頁(yè)/共73頁(yè)目前為止，在細(xì)菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了目前為止，在細(xì)菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了12001200多種限制性內(nèi)切酶，分為三類：多種限制性內(nèi)切酶，分為三類：I. I. 其識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)相距其識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)相距1000-5000bp1000-5000bp，切割位點(diǎn)不表現(xiàn)嚴(yán)格的切割位點(diǎn)不表現(xiàn)嚴(yán)格的特異性特異性；2 2條鏈上的斷裂位點(diǎn)相距條鏈上的斷裂位點(diǎn)相距70-7570-75個(gè)核苷酸；個(gè)核苷酸；II.II. 識(shí)別序列具有特異性識(shí)別序列具有特異性，且序列為旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性，切割位點(diǎn)位于限制性，且序列為旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性，切割位點(diǎn)位于限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列之內(nèi)

14、，限制性內(nèi)切酶的功能核甲基化酶的功能分開(kāi)；內(nèi)切酶識(shí)別序列之內(nèi)，限制性內(nèi)切酶的功能核甲基化酶的功能分開(kāi)；是基因工程中常用的內(nèi)切酶；是基因工程中常用的內(nèi)切酶；III.III. 由由R R、MSMS亞基共同組成，其中亞基共同組成，其中MSMS亞基具有位點(diǎn)識(shí)別和甲基化修飾亞基具有位點(diǎn)識(shí)別和甲基化修飾的雙重功能；的雙重功能；R R亞基具有內(nèi)切酶活性。切割位點(diǎn)位于識(shí)別位點(diǎn)的一側(cè)亞基具有內(nèi)切酶活性。切割位點(diǎn)位于識(shí)別位點(diǎn)的一側(cè)若干堿基對(duì)處，無(wú)序列特異性，而只與識(shí)別位點(diǎn)的距離有關(guān)，從若干堿基對(duì)處，無(wú)序列特異性，而只與識(shí)別位點(diǎn)的距離有關(guān)，從7-7-26bp26bp不等。在與識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合之后，修飾作用和限制作用取決

15、于兩不等。在與識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合之后，修飾作用和限制作用取決于兩個(gè)亞基之間的競(jìng)爭(zhēng)。個(gè)亞基之間的競(jìng)爭(zhēng)。限制性內(nèi)切酶的分類4.2.1 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶第30頁(yè)/共73頁(yè) I I和IIIIII型酶識(shí)別序列特點(diǎn)： 一般具有內(nèi)切酶和甲基化酶的活性， 識(shí)別或切割位點(diǎn)不恒定， 不具備用來(lái)做工具酶， IIII型酶識(shí)別序列特點(diǎn)： 均有嚴(yán)格的識(shí)別特定核苷酸的序列， 識(shí)別的核苷酸序列一般在4 48 8個(gè)堿基對(duì) 大多數(shù)識(shí)別位點(diǎn)具有180180度旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)形式4.2.1 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能4.2 切割切割

16、DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶第31頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.2 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶II在特定核苷酸序列處切割在特定核苷酸序列處切割DNA第32頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.2 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶II在特定核苷酸序列處切割在特定核苷酸序列處切割DNA命名：命名：400400余種余種II II類酶，鑒定的識(shí)別和切割位點(diǎn)有類酶，鑒定的識(shí)別和切割位點(diǎn)有300300多種，商品化多種，商品化100100多種，多種，DNADNA重組技術(shù)中常用的有重組技術(shù)中常用的有2020多種。多種。其命名

17、書(shū)寫(xiě)規(guī)則：其命名書(shū)寫(xiě)規(guī)則：以生物體屬名的第一個(gè)大寫(xiě)字母和種名的前以生物體屬名的第一個(gè)大寫(xiě)字母和種名的前2 2個(gè)小寫(xiě)字母構(gòu)成酶的基本名個(gè)小寫(xiě)字母構(gòu)成酶的基本名稱；稱；若酶在一個(gè)特殊菌株上發(fā)現(xiàn)，則將株名的第一個(gè)字母加在基本名稱之后若酶在一個(gè)特殊菌株上發(fā)現(xiàn)，則將株名的第一個(gè)字母加在基本名稱之后；若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則還用一個(gè)大寫(xiě)字母表若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則還用一個(gè)大寫(xiě)字母表示這些非染色體的遺傳因子；示這些非染色體的遺傳因子；酶最后的部分為羅馬字母，表明該生物發(fā)現(xiàn)此酶的先后順序。酶最后的部分為羅馬字母，表明該生物發(fā)現(xiàn)此酶的先后順序。如如HindIII Hin

18、dIII 表明在表明在Heamophilus influenzae dHeamophilus influenzae d菌株種發(fā)現(xiàn)的第菌株種發(fā)現(xiàn)的第3 3種酶；種酶； EcoRI EcoRI 表明在表明在Escherichia coliEscherichia coli的抗藥性的抗藥性R R質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)酶質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)酶第33頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.2 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶II在特定核苷酸序列處切割在特定核苷酸序列處切割DNA第34頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.2 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切

19、酶II在特定核苷酸序列處切割在特定核苷酸序列處切割DNAII 型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識(shí)別雙鏈DNA分子中4 - 8對(duì)堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)識(shí)別切割序列呈典型的1801800 0旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的識(shí)別序列第35頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.2 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶II在特定核苷酸序列處切割在特定核苷酸序列處切割DNA回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu) 如如HindIII HindIII AAGCTT

20、AAGCTT TTCGAA TTCGAA HapII HapII CCGG CCGG GGCC GGCC Cfr13I Cfr13I GGNCC GGNCC CCNGG CCNGG Eco81I Eco81I CCTNAGG CCTNAGG GGANTCC GGANTCC Not I Not I GCGGCCGC GCGGCCGC CGCCGGCG CGCCGGCG 第36頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.3 平末端和黏末端平末端和黏末端第37頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.3 平末端和黏末端平末端和黏末端5

21、 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 55 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH PPstI等產(chǎn)生的3粘性末端第38頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.3 平末端和黏末端平末端和黏末端同尾酶：有些來(lái)源不同的酶盡管其識(shí)別的序列不同，但是其切割出的同尾酶：有些來(lái)源不同的酶盡管其識(shí)別的序列不同，但

22、是其切割出的DNADNA片段片段是有相同的粘性末端。是有相同的粘性末端。第39頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.4 DNA分子中識(shí)別序列的出現(xiàn)頻率分子中識(shí)別序列的出現(xiàn)頻率理論上：GATC 每44 = 256個(gè)堿基 出現(xiàn)一次GGATCC 每46 = 4096個(gè)堿基 出現(xiàn)一次實(shí)際上識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生的頻率從要小一點(diǎn)（如識(shí)別6個(gè)堿基的BamHI，BglII，SalI）第40頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.4 DNA分子中識(shí)別序列的出現(xiàn)頻率分子中識(shí)別序列的出現(xiàn)頻率限制性酶切位點(diǎn)通常稱不會(huì)均勻分布于DNA分子中第41頁(yè)/共7

23、3頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.5 在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行限制性酶切在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行限制性酶切如何做一個(gè)酶切反應(yīng)：（1） 2ug DNA 濃縮到125ug/ml （不高不低，純）16ul（2） 限制性內(nèi)切酶 BglII （4U/ul） 一個(gè)酶單位（U）定義為一定溫度（通常為37度）下1小時(shí)內(nèi)切割1ugDNA所需要的酶量 2ug DNA 需要2U即 4U/ul X 0.5ul（3） 緩沖液（buffer） 10X第42頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶第43頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.

24、2.5 在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行限制性酶切在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行限制性酶切設(shè)計(jì)一個(gè)最普通的酶切體系設(shè)計(jì)一個(gè)最普通的酶切體系總體系 20ul10buffer H 2ul切割的DNA分子 16ul限制性內(nèi)切酶 BglII (4u/ul) 0.5ulH2O 其余用H2O補(bǔ)齊體系 37 2小時(shí)第44頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.5 在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行限制性酶切在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行限制性酶切影響限制性內(nèi)切酶活性的因素：影響限制性內(nèi)切酶活性的因素：1. 1.酶活定義：指在最適反應(yīng)條件下（因酶而異，包括最適反應(yīng)溫度，酶活定義：指在最適反應(yīng)條件下（因酶而異，包括最適反應(yīng)溫度，

25、最適緩沖條件），經(jīng)過(guò)最適緩沖條件），經(jīng)過(guò)1 1小時(shí)反應(yīng)將小時(shí)反應(yīng)將1ugDNA1ugDNA完全分解所需要的酶完全分解所需要的酶量，稱為酶活單位；量，稱為酶活單位；2.2.影響酶活的因素：影響酶活的因素：a. a.DNADNA的純度：限制性內(nèi)切酶消化的純度：限制性內(nèi)切酶消化DNADNA底物的反應(yīng)效率，很大程度底物的反應(yīng)效率，很大程度上取決于所使用上取決于所使用DNADNA本身的純度，而本身的純度，而DNADNA制劑中的某些物質(zhì)，如制劑中的某些物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、EDTAEDTA以及以及SDSSDS等都可以抑制酶的活性。等都可以抑制酶的活性。如果如果DNADNA

26、純度不夠，可以采用擴(kuò)大反應(yīng)體系來(lái)稀釋雜質(zhì)含量；純度不夠，可以采用擴(kuò)大反應(yīng)體系來(lái)稀釋雜質(zhì)含量；b.b.酶切消化的反應(yīng)溫度：大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度是酶切消化的反應(yīng)溫度：大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度是3737，也存在許多例外條件，如，也存在許多例外條件，如BamHI30, AccIII60BamHI30, AccIII60，TaqI TaqI 65;65;在實(shí)際試驗(yàn)中,甲基化和星號(hào)活性是很少的. 大多數(shù)切不開(kāi)都與自己的體系或者DNA質(zhì)量有關(guān).第45頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.6 對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行

27、分析標(biāo)準(zhǔn)電泳不能區(qū)分大小凝膠電泳可區(qū)分大小第46頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.6 對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析表3-1 瓊脂糖凝膠濃度與分辨DNA大小范圍的關(guān)系瓊脂糖凝膠濃度/（%） 可分辨的線性DNA大小范圍/（kb）0.3 6050.6 2010.7 100.80.9 70.51.2 60.41.5 40.22.0 30.1更小的DNA片段區(qū)分可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，40%聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分1-300bp的片段實(shí)驗(yàn)室通常操作的DNA片段在0. 5-10kb左右，所以一般使用0.8-1%的瓊脂糖凝膠基因

28、組則一般使用0.5-0.7的的瓊脂糖凝膠第47頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.6 對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析上樣緩沖液： 6上樣緩沖液 ： 0.25% 溴酚藍(lán)， 0.25% 二甲苯青 FF ， 30% 甘油。 （40%蔗糖）第48頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.6 對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析第49頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.6 對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)

29、行分析凝膠中DNA分子的可視化EB在紫外照射下能把DNA分子顯示出來(lái)Gelred，SYBR Green，Goldview等放射自顯影（檢測(cè)極微量的DNA）第50頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.7 DNA分子大小的估計(jì)分子大小的估計(jì)第51頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.8 通過(guò)作圖標(biāo)出一個(gè)通過(guò)作圖標(biāo)出一個(gè)DNA分子上的限制性酶切位點(diǎn)分子上的限制性酶切位點(diǎn)第52頁(yè)/共73頁(yè)4.2 切割切割DNA的酶的酶-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶4.2.8 通過(guò)作圖標(biāo)出一個(gè)通過(guò)作圖標(biāo)出一個(gè)DNA分子上的限制性酶切位點(diǎn)分子上的限制

30、性酶切位點(diǎn)第53頁(yè)/共73頁(yè)4.3 連接連接-將將DNA連接在一起連接在一起第54頁(yè)/共73頁(yè)4.3 連接連接-將將DNA連接在一起連接在一起4.3.1 DNA連接酶的作用模式連接酶的作用模式第55頁(yè)/共73頁(yè)5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG第

31、56頁(yè)/共73頁(yè)4.3 連接連接-將將DNA連接在一起連接在一起第57頁(yè)/共73頁(yè)4.3 連接連接-將將DNA連接在一起連接在一起4.3.2 黏末端可增加連接的效率黏末端可增加連接的效率一般情況下，平末端只有黏末端連接效率的一般情況下，平末端只有黏末端連接效率的1/10-1/1001/10-1/100。第58頁(yè)/共73頁(yè)4.3 連接連接-將將DNA連接在一起連接在一起4.3.2 黏末端可增加連接的效率黏末端可增加連接的效率如何提高平末端的連接效率如何提高平末端的連接效率（1 1）提高）提高DNADNA分子的濃度，增加末端接觸的機(jī)會(huì)分子的濃度，增加末端接觸的機(jī)會(huì) （2） 例如，載體具有黏末端，D

32、NA分子具有平末端，采取如下方法：4.3.3 黏末端可增加連接的效率黏末端可增加連接的效率 DNA DNA接頭接頭（linkerlinker）第59頁(yè)/共73頁(yè)4.3 連接連接-將將DNA連接在一起連接在一起4.3.2 黏末端可增加連接的效率黏末端可增加連接的效率 寡核苷酸接頭寡核苷酸接頭第60頁(yè)/共73頁(yè)4.3 連接連接-將將DNA連接在一起連接在一起4.3.2 黏末端可增加連接的效率黏末端可增加連接的效率 寡核苷酸接頭寡核苷酸接頭第61頁(yè)/共73頁(yè)4.3 連接連接-將將DNA連接在一起連接在一起4.3.2 黏末端可增加連接的效率黏末端可增加連接的效率 通過(guò)附加同聚物反應(yīng)產(chǎn)生黏末端通過(guò)附加同

33、聚物反應(yīng)產(chǎn)生黏末端第62頁(yè)/共73頁(yè)4.3 連接連接-將將DNA連接在一起連接在一起平頭末端的連接：平頭末端的連接：不同粘性末端的連接：第63頁(yè)/共73頁(yè)4.3 連接連接-將將DNA連接在一起連接在一起普通連接反應(yīng)的設(shè)計(jì)：普通連接反應(yīng)的設(shè)計(jì)：總體系 10ul10buffer 1ulVector (3k;500ng/ul) 1ulDNA fragment(500bp;50ng/ul) 3ulLigase 0.5-1ulH2O2 加水至10ul反應(yīng)在16度過(guò)夜第64頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍核酸酶（nuclease）連接酶（ligase）聚合酶（polymerase）修飾酶（modifying enzyme）拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）其它第65頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切開(kāi)、切除或降解核酸分子的酶分類：外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶從DNA分子的末端一個(gè)一個(gè)地切除核苷酸鏈在一個(gè)DNA分子內(nèi)部打開(kāi)磷酸二酯鍵第66頁(yè)/共73頁(yè)4.1 DNA操作酶的范圍操作酶的范圍4.1.3 聚合酶：復(fù)制核酸分子