高中生物2017年第1部分專題2課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)(選修一)課件

1、第第1部部分分專專題題2課課題題2理解教材理解教材新知新知把握熱點(diǎn)把握熱點(diǎn)考向考向應(yīng)用創(chuàng)新應(yīng)用創(chuàng)新演練演練知識點(diǎn)一知識點(diǎn)一知識點(diǎn)二知識點(diǎn)二考向一考向一考向二考向二返回返回返回返回返回返回返回返回 1.測定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平測定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平 板法和顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。板法和顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。 2稀釋涂布平板法常用來統(tǒng)計(jì)活菌的數(shù)目，稀釋涂布平板法常用來統(tǒng)計(jì)活菌的數(shù)目， 但統(tǒng)計(jì)結(jié)果往往比活菌數(shù)目低。但統(tǒng)計(jì)結(jié)果往往比活菌數(shù)目低。3只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作唯一氮源的選擇培養(yǎng)基分離該細(xì)菌。唯一氮源的

2、選擇培養(yǎng)基分離該細(xì)菌。4鑒定分解尿素細(xì)菌的方法是在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基鑒定分解尿素細(xì)菌的方法是在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，據(jù)是否變紅進(jìn)行判斷。中加入酚紅指示劑，據(jù)是否變紅進(jìn)行判斷。 返回返回返回返回 自讀教材自讀教材夯基礎(chǔ)夯基礎(chǔ) 1篩選菌株的思路篩選菌株的思路 (1)自然界中目的菌株的篩選：自然界中目的菌株的篩選： 依據(jù)：根據(jù)它對依據(jù)：根據(jù)它對 的要求，到相應(yīng)的環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。中去尋找。 實(shí)例：實(shí)例：PCR技術(shù)過程中用到的耐高溫的技術(shù)過程中用到的耐高溫的 ，就是從熱泉中篩選出來的，就是從熱泉中篩選出來的Taq細(xì)菌中提取出來的。細(xì)菌中提取出來的。生存環(huán)境生存

3、環(huán)境Taq DNA聚聚合酶合酶返回返回 (2)實(shí)驗(yàn)室中目的菌株的篩選：實(shí)驗(yàn)室中目的菌株的篩選： 原理：人為提供有利于原理：人為提供有利于 生長的條件生長的條件(包括包括營養(yǎng)、溫度、營養(yǎng)、溫度、pH等等)，同時(shí)，同時(shí) 其他微生物的生長。其他微生物的生長。 方法：利用選擇培養(yǎng)基分離。方法：利用選擇培養(yǎng)基分離。 a選擇培養(yǎng)基：允許選擇培養(yǎng)基：允許 微生物生長，同時(shí)微生物生長，同時(shí) 其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。 b實(shí)例：選擇分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基，以實(shí)例：選擇分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基，以 作作為唯一氮源，只有能合成為唯一氮源，只有能合成 的微生物才能分解尿素。的微生物才能分解

4、尿素。目的菌株目的菌株抑制或阻止抑制或阻止特定特定阻止阻止或抑制或抑制尿素尿素脲酶脲酶返回返回稀釋涂布平板稀釋涂布平板稀釋度稀釋度活菌活菌返回返回 計(jì)數(shù)原則：一般選擇菌落數(shù)在計(jì)數(shù)原則：一般選擇菌落數(shù)在 的平板進(jìn)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。行計(jì)數(shù)。 結(jié)果分析：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目結(jié)果分析：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目 。原因是當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只原因是當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是是 。 (2)其他方法：利用其他方法：利用 直接計(jì)數(shù)。直接計(jì)數(shù)。30300低低一個(gè)菌落一個(gè)菌落顯微鏡顯微鏡返回返回 圓褐固氮菌生活于土壤中，能以氮?dú)庾鳛榈础Ｕ執(zhí)綀A褐固氮菌生

5、活于土壤中，能以氮?dú)庾鳛榈础Ｕ執(zhí)接?、交流?shí)驗(yàn)室分離圓褐固氮菌的方法。討、交流實(shí)驗(yàn)室分離圓褐固氮菌的方法。 提示：提示：配制無氮培養(yǎng)基作為選擇培養(yǎng)基。配制無氮培養(yǎng)基作為選擇培養(yǎng)基。返回返回 跟隨名師跟隨名師解疑難解疑難 1選擇培養(yǎng)基的類型及作用選擇培養(yǎng)基的類型及作用 (1)在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)。如加入青霉素可以在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)。如加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌；加入高濃度的食鹽可得到金黃色葡分離出酵母菌和霉菌；加入高濃度的食鹽可得到金黃色葡萄球菌。這里的加入指的是在培養(yǎng)基的培養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上萄球菌。這里的加入指的是在培養(yǎng)基的培養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上加入。加入。 (2)改變培養(yǎng)基中的營養(yǎng)

6、成分。如培養(yǎng)基中缺乏氮源時(shí)，改變培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分。如培養(yǎng)基中缺乏氮源時(shí)，可以分離固氮微生物，因?yàn)榉枪痰⑸锊荒茉诖伺囵B(yǎng)基可以分離固氮微生物，因?yàn)榉枪痰⑸锊荒茉诖伺囵B(yǎng)基上生存。當(dāng)培養(yǎng)基的某種營養(yǎng)成分為特定化學(xué)成分時(shí)，也上生存。當(dāng)培養(yǎng)基的某種營養(yǎng)成分為特定化學(xué)成分時(shí)，也具有分離效果。具有分離效果。 (3)改變微生物的培養(yǎng)條件。如將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境改變微生物的培養(yǎng)條件。如將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)只能得到耐高溫的微生物。中培養(yǎng)只能得到耐高溫的微生物。返回返回 2統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目 (1)稀釋涂布平板法：稀釋涂布平板法： 原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長原理：當(dāng)樣品的稀釋度

7、足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過統(tǒng)計(jì)的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。行計(jì)數(shù)。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： a設(shè)置重復(fù)組：同一稀釋度下，至少涂布設(shè)置重復(fù)組：同一稀釋度下，至少涂布3個(gè)平板作個(gè)平板作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性。分析結(jié)果時(shí)，為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性。分析結(jié)果時(shí)，需考慮重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作

8、需考慮重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。返回返回 特別提醒特別提醒教材中的實(shí)例說明了設(shè)置重復(fù)組的重要教材中的實(shí)例說明了設(shè)置重復(fù)組的重要性。第一位同學(xué)只涂布了性。第一位同學(xué)只涂布了1個(gè)平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因個(gè)平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問此結(jié)果不具有說服力。第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，涂布了題，涂布了3個(gè)平板，但是，其中個(gè)平板，但是，其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)值結(jié)果與個(gè)平板的計(jì)數(shù)值結(jié)果與另另2個(gè)相差太遠(yuǎn)，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因個(gè)相差太遠(yuǎn)，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡單地將此，

9、不能簡單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來求平均值。個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來求平均值。返回返回 b設(shè)置對照：目的是排除實(shí)驗(yàn)中非測試因素對實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照：目的是排除實(shí)驗(yàn)中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)的可信度。結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)的可信度。 計(jì)算公式：每克樣品中的菌株數(shù)計(jì)算公式：每克樣品中的菌株數(shù)(CV)M。 C：代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)。：代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)。 V：代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積。：代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積。 M：代表稀釋倍數(shù)。：代表稀釋倍數(shù)。返回返回 (2)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法：顯微鏡直接計(jì)數(shù)法： 原理：此法利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血球計(jì)數(shù)板，在原理：

10、此法利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量。顯微鏡下計(jì)算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量。 缺點(diǎn)：不能區(qū)分細(xì)菌的死活。缺點(diǎn)：不能區(qū)分細(xì)菌的死活。 方法：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，方法：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，上面有一個(gè)特定的面積為上面有一個(gè)特定的面積為1 mm2和高為和高為0.1 mm的計(jì)數(shù)室，的計(jì)數(shù)室，在在1 mm2的面積里又被劃分成的面積里又被劃分成25個(gè)個(gè)(或或16個(gè)個(gè))中格，每個(gè)中中格，每個(gè)中格進(jìn)一步劃分成格進(jìn)一步劃分成16個(gè)個(gè)(或或25個(gè)個(gè))小格，但計(jì)數(shù)室都是由小格，但計(jì)數(shù)室都是由400個(gè)個(gè)小格組成的。如圖所示。小格組成的

11、。如圖所示。返回返回 計(jì)算公式：每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)每小格平均計(jì)算公式：每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)每小格平均細(xì)菌數(shù)細(xì)菌數(shù)40010 000稀釋倍數(shù)。稀釋倍數(shù)。返回返回 自讀教材自讀教材夯基礎(chǔ)夯基礎(chǔ) 有機(jī)質(zhì)有機(jī)質(zhì)中性中性38 cm返回返回30300溫度溫度時(shí)間時(shí)間數(shù)目穩(wěn)定數(shù)目穩(wěn)定返回返回 (4)計(jì)數(shù)：當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，取同一計(jì)數(shù)：當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，取同一 下的下的3個(gè)平個(gè)平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，求出板進(jìn)行計(jì)數(shù)，求出 ，并根據(jù)所對應(yīng)的，并根據(jù)所對應(yīng)的 計(jì)算出計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目樣品中細(xì)菌的數(shù)目稀釋度稀釋度平均值平均值稀釋度稀釋度返回返回 2菌種鑒定菌種鑒定 (1)原理：分解尿素的細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解為原理：

12、分解尿素的細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解為 ，使培養(yǎng)基的使培養(yǎng)基的 增強(qiáng)。增強(qiáng)。 (2)方法：在以方法：在以 為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入 指示指示劑培養(yǎng)細(xì)菌，若指示劑變劑培養(yǎng)細(xì)菌，若指示劑變 ，可確定該種細(xì)菌能夠分解尿，可確定該種細(xì)菌能夠分解尿素。素。氨氨堿性堿性尿素尿素酚紅酚紅紅紅返回返回 1當(dāng)?shù)谝淮螠y定時(shí)為什么要將稀釋的范圍放寬一些？當(dāng)?shù)谝淮螠y定時(shí)為什么要將稀釋的范圍放寬一些？ 提示：提示：為確保能從中選擇出菌落數(shù)在為確保能從中選擇出菌落數(shù)在30300之間的之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。 2為什么要選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果？為什么要選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)

13、果？ 提示：提示：防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。返回返回 跟隨名師跟隨名師解疑難解疑難 1操作中的注意事項(xiàng)操作中的注意事項(xiàng) (1)無菌操作：鐵鏟和信封都要滅菌。稱取土壤、將稱無菌操作：鐵鏟和信封都要滅菌。稱取土壤、將稱好的土樣倒入錐形瓶、稀釋土壤溶液，每一步都要在酒精好的土樣倒入錐形瓶、稀釋土壤溶液，每一步都要在酒精燈的火焰旁進(jìn)行。燈的火焰旁進(jìn)行。 (2)做好標(biāo)記：如在培養(yǎng)皿上注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日做好標(biāo)記：如在培養(yǎng)皿上注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期以及培養(yǎng)樣品的稀釋度等。期以及培養(yǎng)樣品的稀釋度等。 返回返回 2結(jié)果分析與評價(jià)結(jié)果分析與評價(jià) (1)培

14、養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落：對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)菌落：對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。 (2)樣品的稀釋操作是否成功：如果得到了樣品的稀釋操作是否成功：如果得到了2個(gè)或個(gè)或2個(gè)以上個(gè)以上菌落數(shù)目在菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌

15、落的計(jì)數(shù)。夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。 (3)重復(fù)組的結(jié)果是否一致：如果不同同學(xué)選取的是同一重復(fù)組的結(jié)果是否一致：如果不同同學(xué)選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，需要分種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，需要分析產(chǎn)生差異的原因。析產(chǎn)生差異的原因。返回返回返回返回 例例1 下表是培養(yǎng)分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基配方，請下表是培養(yǎng)分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基配方，請回答下面的問題：回答下面的問題：編號編號成分成分含量含量KH2PO41.4 g Na2HPO42.1 g MgSO47H2O0.2 g 葡萄糖葡萄糖10.0 g 尿素尿素1.0 g 瓊脂瓊脂15.0 g 將上述物質(zhì)溶解后，用自

16、來水定容到將上述物質(zhì)溶解后，用自來水定容到1 000 mL返回返回 (1)在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物提供碳源的是在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物提供碳源的是_，提供氮源的是，提供氮源的是_。 (2)絕大多數(shù)微生物都能利用絕大多數(shù)微生物都能利用_，但是，只有，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解能合成脲酶的微生物才能分解_。 (3)分析該培養(yǎng)基的配方，該培養(yǎng)基對微生物是否具分析該培養(yǎng)基的配方，該培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，又是如何進(jìn)行選擇的？有選擇作用？如果具有，又是如何進(jìn)行選擇的？ 返回返回 解析解析碳源是提供碳元素的物質(zhì)，氮源是提供氮元碳源是提供碳元素的物質(zhì)，氮源是提供氮元素的物

17、質(zhì)，所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。該培養(yǎng)基的素的物質(zhì)，所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。該培養(yǎng)基的配方中含有凝固劑配方中含有凝固劑瓊脂，所以，配制的一定為固體培瓊脂，所以，配制的一定為固體培養(yǎng)基。絕大多數(shù)生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成養(yǎng)基。絕大多數(shù)生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以這種培養(yǎng)基對微生物有脲酶的微生物才能分解尿素，所以這種培養(yǎng)基對微生物有選擇作用。選擇的原理是只有能夠利用尿素的微生物才能選擇作用。選擇的原理是只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。夠生長。 答案答案(1)葡萄糖尿素葡萄糖尿素 (2)葡萄糖尿素葡萄糖尿素 (3)該培養(yǎng)基對微生物具有選擇作

18、用。以尿素為唯一氮該培養(yǎng)基對微生物具有選擇作用。以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基可以分離得到產(chǎn)生脲酶的微生物源的培養(yǎng)基可以分離得到產(chǎn)生脲酶的微生物(即分解尿素的即分解尿素的微生物微生物)。返回返回 (1)病毒為非細(xì)胞結(jié)構(gòu)生物體，專營活細(xì)胞內(nèi)寄生生活，病毒為非細(xì)胞結(jié)構(gòu)生物體，專營活細(xì)胞內(nèi)寄生生活，目前不能利用人工培養(yǎng)基來培養(yǎng)。目前不能利用人工培養(yǎng)基來培養(yǎng)。 (2)能夠在選擇培養(yǎng)基上生長的微生物不一定是實(shí)驗(yàn)所需能夠在選擇培養(yǎng)基上生長的微生物不一定是實(shí)驗(yàn)所需要的微生物，因?yàn)橛行┪⑸锟衫闷渌⑸锏拇x產(chǎn)物要的微生物，因?yàn)橛行┪⑸锟衫闷渌⑸锏拇x產(chǎn)物進(jìn)行生長繁殖，因此還需要對分離后的微生物進(jìn)行鑒定

19、。進(jìn)行生長繁殖，因此還需要對分離后的微生物進(jìn)行鑒定。返回返回 例例2 自然界中的微生物往往是混雜生長的。人們在研究微生自然界中的微生物往往是混雜生長的。人們在研究微生物時(shí)一般要將它們分離提純，然后進(jìn)行數(shù)量的測定。下面是對大物時(shí)一般要將它們分離提純，然后進(jìn)行數(shù)量的測定。下面是對大腸桿菌進(jìn)行數(shù)量測定的實(shí)驗(yàn)，請回答有關(guān)問題。腸桿菌進(jìn)行數(shù)量測定的實(shí)驗(yàn)，請回答有關(guān)問題。 實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟： (1)制備稀釋倍數(shù)為制備稀釋倍數(shù)為102、103、104、105、106的系列稀釋液。的系列稀釋液。 (2)選用選用_法接種樣品。法接種樣品。 (3)適宜溫度下培養(yǎng)。適宜溫度下培養(yǎng)。返回返回 結(jié)果分析：結(jié)果分析：

20、(1)測定的大腸桿菌數(shù)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為測定的大腸桿菌數(shù)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，正確可信的是基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，正確可信的是 () A一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是23 B兩個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是兩個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是22和和26，取平均，取平均值值24 C三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是21、5和和52，取平，取平均值均值26 D四個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是四個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是21、30、24和和25，取平均值取平均值25返回返回 (2)一同學(xué)在稀釋倍數(shù)為一同學(xué)在稀釋倍數(shù)為105的培養(yǎng)基中測得平板上菌落的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均值為數(shù)的平均值為23.4，那么每毫升樣品中的菌株數(shù)是，那么每毫升樣品中的菌株數(shù)是(涂布平涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為板時(shí)所用稀釋液的體積為0.2 mL)_。 (3)用這種方