蛋白質理化4hours

1、第一章緒論第二章蛋白質結構基礎第三章蛋白質分子設計第四章蛋白質的修飾和表達第五章蛋白質理化性質的分析和鑒定第五章蛋白質理化性質的分析和鑒定 蛋白質工程蛋白質工程參考書目：生物化學、蛋白質結構導論參考書目：生物化學、蛋白質結構導論 /wampler/8010/finkprot.html 第五章第五章 蛋白質的理化性質分析蛋白質的理化性質分析一、蛋白質一、蛋白質理化理化性質性質二、二、蛋白質分離與純化蛋白質分離與純化三、三、蛋白質結構分析蛋白質結構分析氨基酸的物理性質氨基酸的物理性質氨基酸的化學性質氨基酸的化學性質蛋白質的理化性質蛋白質的理化性質分離純化策

2、略分離純化策略分離純化程序分離純化程序三相純化策略三相純化策略定量分析定量分析測序測序X射線晶體衍射射線晶體衍射核磁共振核磁共振質譜質譜氨基酸的物理性質氨基酸的物理性質氨基酸的吸收光譜：氨基酸的吸收光譜： 酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸具有紫外光（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸具有紫外光（280nm280nm） 吸收能力吸收能力氨基酸的兩性電離性質：氨基酸的兩性電離性質： 離子交換層析離子交換層析氨基酸的物理性質：氨基酸的物理性質： 氨基酸在水中溶解度各異，易溶于酸和堿：氨基酸在水中溶解度各異，易溶于酸和堿： 分配層析分配層析紙層析紙層析薄層層析薄層層析氨基酸與茚三酮在弱酸性溶氨基酸與茚三酮在弱酸性溶液中

3、加熱可產(chǎn)生有色化合物。液中加熱可產(chǎn)生有色化合物。與含有游離的與含有游離的- -氨基的氨氨基的氨基酸和肽類生成基酸和肽類生成紫色化合物紫色化合物，而脯氨酸因其而脯氨酸因其- -氨基被取氨基被取代而生成代而生成黃色產(chǎn)物黃色產(chǎn)物。靈敏度靈敏度：微克級。多肽靈敏度降低微克級。多肽靈敏度降低氨基酸的化學性質氨基酸的化學性質 蛋白質的性質蛋白質的性質體內(nèi)多數(shù)蛋白質的體內(nèi)多數(shù)蛋白質的等電點為等電點為5 5左右，在左右，在生理條件下多以負生理條件下多以負離子形式存在離子形式存在應用：應用：蛋白質的等蛋白質的等電點沉淀電點沉淀、離子交離子交換換、電泳電泳蛋白質的兩性電離與等電點蛋白質的兩性電離與等電點在溫和條件

4、下，通過改變?nèi)芤旱脑跍睾蜅l件下，通過改變?nèi)芤旱膒HpH或電荷狀況，使蛋白質從膠體或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離溶液中沉淀分離在沉淀過程中，結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，在沉淀過程中，結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀，如等可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等如加熱沉淀（次級鍵）、強酸堿沉淀（影響荷電）、重金屬鹽沉如加熱沉淀（次級鍵）、強酸堿沉淀（影響荷電）、重金屬鹽沉淀（淀（Hg2+Hg2+、 Pb2+ Pb2+ 、Cu2+

5、Cu2+、 Ag2+Ag2+）和生物堿試劑或某些酸類沉）和生物堿試劑或某些酸類沉淀等都屬于不可逆沉淀淀等都屬于不可逆沉淀蛋白質沉淀反應蛋白質沉淀反應不同蛋白質采取不同的分離純化策略不同蛋白質采取不同的分離純化策略 分泌型重組蛋白：分泌型重組蛋白：體積大、濃度低易先行濃縮處理：體積大、濃度低易先行濃縮處理：沉淀、超濾沉淀、超濾 包涵體型重組蛋白：包涵體型重組蛋白：離心離心 融合型重組蛋白融合型重組蛋白 胞內(nèi)可溶：胞內(nèi)可溶：親和層析親和層析 細胞膜和細胞壁之間：細胞膜和細胞壁之間：溶菌酶（低濃度）溶菌酶（低濃度）多種分離純化技術的聯(lián)合應用多種分離純化技術的聯(lián)合應用在進行重組蛋白的純化時，對分離純化

6、方法的在進行重組蛋白的純化時，對分離純化方法的選擇應遵循以下原則：選擇應遵循以下原則： 應選擇不同分離純化機理的方法聯(lián)合應用應選擇不同分離純化機理的方法聯(lián)合應用 選擇能除去含量最多雜質的方法選擇能除去含量最多雜質的方法 選擇高效的分離方法選擇高效的分離方法 將費時、成本最高的分離純化方法安排在最后階段將費時、成本最高的分離純化方法安排在最后階段 （一）目標蛋白質的分離純化程序（一）目標蛋白質的分離純化程序1 1、材料的選擇、材料的選擇2 2、組織勻漿和破碎細胞獲得粗提液（前處理）、組織勻漿和破碎細胞獲得粗提液（前處理）3 3、蛋白質初步提純（粗分級）、蛋白質初步提純（粗分級）4 4、選擇一種或

7、幾種合適的方法除去雜蛋白，直、選擇一種或幾種合適的方法除去雜蛋白，直 至完全純化（細分級）至完全純化（細分級）5 5、目標蛋白的鑒定、目標蛋白的鑒定 前處理（前處理（pretreatment)pretreatment)：蛋白質釋放；保持天然狀態(tài)；不變性，不蛋白質釋放；保持天然狀態(tài)；不變性，不失活。方法：（失活。方法：（1 1）電動允漿機或攪拌機）電動允漿機或攪拌機 （2 2）超聲波）超聲波 （3 3）加沙研）加沙研磨磨 （4 4）纖維素酶或溶菌酶處理）纖維素酶或溶菌酶處理 如果所需要的蛋白質集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖如果所需要的蛋白質集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體

8、等，則可用差速離心法將其分開，收集該細胞組分作為下一步材料體等，則可用差速離心法將其分開，收集該細胞組分作為下一步材料粗分級（粗分級（rough fractionation)rough fractionation)：當?shù)鞍踪|混合物提取液得到后，當?shù)鞍踪|混合物提取液得到后，就可選用適當?shù)姆椒▽⑺枰牡鞍踪|與其它雜蛋白分開。一般這一步用就可選用適當?shù)姆椒▽⑺枰牡鞍踪|與其它雜蛋白分開。一般這一步用鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大，既能除去大量雜質，又可濃縮蛋白質溶液處理量大，既能除去大量雜質

9、，又可濃縮蛋白質溶液細分級（細分級（fine fractionation)fine fractionation)：一般使用層析法。包括凝膠過濾、一般使用層析法。包括凝膠過濾、離子交換、吸附和親和層析等及電泳法離子交換、吸附和親和層析等及電泳法（二）蛋白質混合物的分離方法（二）蛋白質混合物的分離方法1 1、根據(jù)分子大小的分離、根據(jù)分子大小的分離 （1 1）透析（）透析（dialysis)dialysis)和超過濾和超過濾( (ultrafiltrationultrafiltration) )：玻璃紙、火棉紙和其它：玻璃紙、火棉紙和其它 合成材料合成材料 （2 2）密度梯度（區(qū)帶）離心：蔗糖梯度、

10、聚蔗糖梯度）密度梯度（區(qū)帶）離心：蔗糖梯度、聚蔗糖梯度 （3 3）凝膠過濾：交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖等）凝膠過濾：交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖等2 2、利用溶解度差別的分離方法、利用溶解度差別的分離方法 （1 1）等電點沉淀和）等電點沉淀和pHpH控制控制 （2 2）蛋白質的鹽析和鹽溶）蛋白質的鹽析和鹽溶 3 3、根據(jù)電荷不同的分離方法根據(jù)電荷不同的分離方法 （1 1）電泳）電泳 （2 2）離子交換層析）離子交換層析 水平板式電泳槽水平板式電泳槽垂直板式電泳槽垂直板式電泳槽4 4、蛋白質的選擇吸附分離：、蛋白質的選擇吸附分離： 與非極性吸附劑的結合可能主要是范德華力和疏水作用；

11、而與極性吸附劑的與非極性吸附劑的結合可能主要是范德華力和疏水作用；而與極性吸附劑的作用的主要力可能是離子吸引或氫鍵鍵和。吸附劑：結晶磷酸鈣（羥磷灰作用的主要力可能是離子吸引或氫鍵鍵和。吸附劑：結晶磷酸鈣（羥磷灰石）、活性炭、硅膠、氧化鋁和磷酸鈣凝膠等?，F(xiàn)在蛋白質提純中使用最廣石）、活性炭、硅膠、氧化鋁和磷酸鈣凝膠等?，F(xiàn)在蛋白質提純中使用最廣泛和最有效的。泛和最有效的。5 5、根據(jù)生物功能專一性的純化方法、根據(jù)生物功能專一性的純化方法 親和層析：親和層析：是分離蛋白質的一種極為有效的方法。只需一步處理即可使某種是分離蛋白質的一種極為有效的方法。只需一步處理即可使某種蛋白質從很混合物中分離出來，且

12、純度很高蛋白質從很混合物中分離出來，且純度很高 谷胱甘肽谷胱甘肽S-S-轉移酶（轉移酶（GSTGST）：可用交聯(lián)谷胱甘肽的層析介質純化）：可用交聯(lián)谷胱甘肽的層析介質純化 6 6組氨酸標簽：在中性和弱堿性條件下，帶組氨酸標簽的目的蛋白與鎳柱結組氨酸標簽：在中性和弱堿性條件下，帶組氨酸標簽的目的蛋白與鎳柱結合，在低合，在低pHpH下用咪唑競爭洗脫下用咪唑競爭洗脫 “三相純化策略三相純化策略”( three phase purification strategy)( three phase purification strategy) 1)1) 富集富集(capture step) (capture

13、 step) ：初步純化，去除那些與目標蛋白初步純化，去除那些與目標蛋白質性質差異很大的物質及對目標蛋白質不穩(wěn)定的物質如各質性質差異很大的物質及對目標蛋白質不穩(wěn)定的物質如各種蛋白酶。離子交換、疏水作用、親和層析，對層析介質種蛋白酶。離子交換、疏水作用、親和層析，對層析介質的要求是流速快、載量大的要求是流速快、載量大 2)2) 中間純化中間純化(intermediate step)(intermediate step)：去除那些在分子大小、去除那些在分子大小、理化性質與目標蛋白質類似的雜質，通常采用與富集時不理化性質與目標蛋白質類似的雜質，通常采用與富集時不同的層析技術，對分離介質的要求是選擇性

14、好同的層析技術，對分離介質的要求是選擇性好( (分辨率分辨率高高) ) 、載量大、載量大, ,通常應用顆粒較小的介質通常應用顆粒較小的介質 3 3）精制）精制(polishing step)(polishing step)：最終去除那些痕量雜質最終去除那些痕量雜質, ,達到產(chǎn)達到產(chǎn)品的純度要求，凝膠過濾是這一步中經(jīng)常使用的層析技術，品的純度要求，凝膠過濾是這一步中經(jīng)常使用的層析技術，對分離介質的要求選擇性高對分離介質的要求選擇性高 蛋白質的定量分析蛋白質的定量分析方法方法原理原理靈敏度靈敏度凱氏定氮法凱氏定氮法福林福林- -酚試劑法酚試劑法雙縮脲法雙縮脲法BCABCA比色法比色法考馬斯亮藍方法

15、考馬斯亮藍方法蛋白質具有恒定的含氮量蛋白質具有恒定的含氮量在堿性條件下蛋白質與銅生產(chǎn)復合物，還原在堿性條件下蛋白質與銅生產(chǎn)復合物，還原磷鉬酸磷鉬酸- -磷鎢酸試劑生產(chǎn)藍色化合物磷鎢酸試劑生產(chǎn)藍色化合物25-250ug在堿性條件下，蛋白質分子中的肽鍵與銅可生在堿性條件下，蛋白質分子中的肽鍵與銅可生產(chǎn)紫紅色的絡合物產(chǎn)紫紅色的絡合物0.5-10mg/ml在堿性溶液中，蛋白質將二價銅還原為一價銅在堿性溶液中，蛋白質將二價銅還原為一價銅再與再與BCABCA（二羧酸（二羧酸- -而喹啉鈉）生產(chǎn)紫色復合物而喹啉鈉）生產(chǎn)紫色復合物0.5ug/ml考馬斯亮藍考馬斯亮藍G-250G-250能與蛋白質通過范得華相互

16、作能與蛋白質通過范得華相互作用形成蛋白質用形成蛋白質考馬斯亮藍復合物藍色溶液考馬斯亮藍復合物藍色溶液 1ug蛋白質純度和分子量測定蛋白質純度和分子量測定一、蛋白質分子量的測定一、蛋白質分子量的測定超速離心法：分子大小和形狀相同的蛋白質以相同的速度沉淀超速離心法：分子大小和形狀相同的蛋白質以相同的速度沉淀SDS-PAGESDS-PAGE電泳法：蛋白質所帶電荷和分子大小不同，在電場中的電泳電泳法：蛋白質所帶電荷和分子大小不同，在電場中的電泳速度各異速度各異分子篩層析法：球形蛋白質分子篩層析法：球形蛋白質二、蛋白質純度的測定二、蛋白質純度的測定層析法：層析法：電泳法：電泳法：PAGEPAGE免疫化學

17、方法：更具抗原與抗體反應的特異性免疫化學方法：更具抗原與抗體反應的特異性蛋白質末端分析蛋白質末端分析蛋白質二硫鍵分析蛋白質二硫鍵分析-OOCCHCH2SHNH3+-OOCCHCH2SHNH3+-OOCCHNH3+CH2SSCH2NH3+CH-OOCH3NCHCH2S-COO-+SSNO2NO2CO2HCO2H+二硫硝基苯甲酸二硫硝基苯甲酸 (DTNB(DTNB) EllmanEllman反應反應+COO-H3NCHCH2SCO2HNO2-S-NO2COO-HS-+在在pH8.0pH8.0時，時，412nm412nm波長有強烈吸收波長有強烈吸收硫硝基苯甲酸硫硝基苯甲酸可用于比色法定量測定半胱氨酸

18、的含量可用于比色法定量測定半胱氨酸的含量與與X X射線及晶體衍射有關的部分諾貝爾獎獲得者名單射線及晶體衍射有關的部分諾貝爾獎獲得者名單 年 份學 科得獎者內(nèi) 容1901物理倫琴Wilhelm Conral RontgenX射線的發(fā)現(xiàn)1914物理勞埃Max von Laue晶體的X射線衍射亨利.布拉格Henry Bragg勞倫斯.布拉格Lawrence Bragg.1917物理巴克拉Charles Glover Barkla元素的特征X射線1924物理卡爾.西格班Karl Manne Georg SiegbahnX射線光譜學戴維森Clinton Joseph Davisson湯姆孫George

19、Paget Thomson1954化學鮑林Linus Carl Panling化學鍵的本質肯德魯John Charles Kendrew帕魯茲Max Ferdinand Perutz1962生理醫(yī)學Francis H.C.Crick、JAMES d.Watson、Maurice h.f.Wilkins脫氧核糖核酸DNA測定1964化學Dorothy Crowfoot Hodgkin青霉素、B12生物晶體測定霍普特曼Herbert Hauptman卡爾Jerome Karle魯斯卡E.Ruska電子顯微鏡賓尼希G.Binnig掃描隧道顯微鏡羅雷爾H.Rohrer布羅克豪斯 B.N.Brockho

20、use中子譜學沙爾 C.G.Shull中子衍射直接法解析結構1915物理晶體結構的X射線分析1937物理電子衍射1986物理1994物理1962化學蛋白質的結構測定1985化學/nm/nm/cm/cm-1-1能量升高能量升高電磁波譜與有機光譜的對應關系電磁波譜與有機光譜的對應關系X X射線晶體結構分析射線晶體結構分析1) X1) X射線射線 （X-rayX-ray）18951895年倫琴發(fā)現(xiàn)用高速電子沖擊固體時，年倫琴發(fā)現(xiàn)用高速電子沖擊固體時，有一種新射線從固體上發(fā)出來有一種新射線從固體上發(fā)出來陰極陰極陽極陽極+-19121912年勞埃等人實驗證實了年勞埃等人實驗證實了X X射線與晶體射線與晶

21、體相遇時能發(fā)生衍射現(xiàn)象，證明了相遇時能發(fā)生衍射現(xiàn)象，證明了X X射線具有射線具有電磁波的性質，成為電磁波的性質，成為X X射線衍射學的第一個射線衍射學的第一個里程碑。當一束單色里程碑。當一束單色X X射線入射到晶體時，射線入射到晶體時，由于晶體是由原子規(guī)則排列成的晶胞組成，由于晶體是由原子規(guī)則排列成的晶胞組成，這些規(guī)則排列的原子間距離與入射這些規(guī)則排列的原子間距離與入射X X射線波長有相同數(shù)量射線波長有相同數(shù)量級，故由不同原子散射的級，故由不同原子散射的X X射線相互干涉，在某些特殊方射線相互干涉，在某些特殊方向上產(chǎn)生強向上產(chǎn)生強X X射線衍射，衍射線在空間分布的方位和強度射線衍射，衍射線在空

22、間分布的方位和強度，與晶體結構密切相關，與晶體結構密切相關 X X射線衍射原理射線衍射原理The 14 possible BRAVAIS LATTICES note that spheres in this picture represent lattice points, not atoms!晶體結構與空間格子-C衍射線空間方位與晶體結構的關系可用布拉格方程表示：衍射線空間方位與晶體結構的關系可用布拉格方程表示：晶體生長的理化條件晶體生長的理化條件 蛋白質晶體生長的生化條件：蛋白質晶體生長的生化條件： pHpH值、離子強度、沉淀劑和添加劑值、離子強度、沉淀劑和添加劑 在摸索晶體生長的過程中，

23、首先是緩沖液的選取，其在摸索晶體生長的過程中，首先是緩沖液的選取，其次是沉淀劑，最后是蛋白質的濃度次是沉淀劑，最后是蛋白質的濃度蛋白質晶體生長的物理條件：蛋白質晶體生長的物理條件： 溫度、震動、溶劑的清潔度、試劑的純度、重力等因素溫度、震動、溶劑的清潔度、試劑的純度、重力等因素 物理條件控制了晶核形成的速度和晶體生長的速度物理條件控制了晶核形成的速度和晶體生長的速度單晶衍射分析單晶衍射分析應用應用 能提供晶體內(nèi)部三維空間的電子云密度分布，晶體中分能提供晶體內(nèi)部三維空間的電子云密度分布，晶體中分子的立體構型、構像、化學鍵類型，鍵長、鍵角、分子間距子的立體構型、構像、化學鍵類型，鍵長、鍵角、分子間

24、距離，配合物配位等離，配合物配位等常見有機波譜常見有機波譜核磁共振核磁共振 核磁共振是核磁共振是19461946年由美國哈佛大學年由美國哈佛大學普舍爾普舍爾( (E.M.PurcellE.M.Purcell) )小組和斯坦大學小組和斯坦大學的布洛赫（的布洛赫（F.BlochF.Bloch）小組同時獨立發(fā)）小組同時獨立發(fā)現(xiàn)的，它的研究對象是原子核的磁矩現(xiàn)的，它的研究對象是原子核的磁矩在磁場中對電磁波的吸收和發(fā)射根在磁場中對電磁波的吸收和發(fā)射根據(jù)核磁共振峰的化學位移和自旋據(jù)核磁共振峰的化學位移和自旋- -自旋自旋分裂可以測定分子的靜態(tài)結構、分裂可以測定分子的靜態(tài)結構、 研究研究化學交換等化學交換等

25、原子核由質子和中子組成質子、中子與電子一樣具有原子核由質子和中子組成質子、中子與電子一樣具有自旋運動，因而核也產(chǎn)生磁矩自旋運動，因而核也產(chǎn)生磁矩并非所有原子核自旋都具有磁矩，實驗證明只有那些原子并非所有原子核自旋都具有磁矩，實驗證明只有那些原子序數(shù)或質量數(shù)為奇數(shù)的原子自旋才具有磁矩例如：序數(shù)或質量數(shù)為奇數(shù)的原子自旋才具有磁矩例如：H H，C C，N N，O O等等 讓處于外磁場的自旋核接受一定頻率的電磁波輻射，而輻讓處于外磁場的自旋核接受一定頻率的電磁波輻射，而輻射的能量又恰好等于高低兩種不同取向的能量差時，質子就吸射的能量又恰好等于高低兩種不同取向的能量差時，質子就吸收電磁輻射，從低能態(tài)躍遷

26、到高能態(tài)而產(chǎn)生共振現(xiàn)象，稱為核收電磁輻射，從低能態(tài)躍遷到高能態(tài)而產(chǎn)生共振現(xiàn)象，稱為核磁共振（磁共振（NMRNMR） 以吸收的能量的強度為縱坐標，以吸收的頻率為橫坐標，以吸收的能量的強度為縱坐標，以吸收的頻率為橫坐標，用記錄儀描繪下來，分子中各個核在核磁共振譜上即出現(xiàn)吸收用記錄儀描繪下來，分子中各個核在核磁共振譜上即出現(xiàn)吸收峰，成為峰，成為核磁共振譜圖核磁共振譜圖 核磁共振的發(fā)展核磁共振的發(fā)展 19711971年比利時的年比利時的J.JeenerJ.Jeener首次提出二維核磁共振的概念。首次提出二維核磁共振的概念。 2020世紀世紀8080年代末期遺傳工程技術迅速發(fā)展，已成功制備了年代末期遺傳

27、工程技術迅速發(fā)展，已成功制備了許多許多15N15N和和13C13C等穩(wěn)定同位素標記的蛋白質樣品，使二維異等穩(wěn)定同位素標記的蛋白質樣品，使二維異核核磁共振方法得以實施核核磁共振方法得以實施 2020世紀世紀9090年代初期年代初期A.BaxA.Bax等人提出了異核三維和四維核磁等人提出了異核三維和四維核磁共振方法。已可用于確定分子量為共振方法。已可用于確定分子量為15-25kDa15-25kDa蛋白質分子的蛋白質分子的溶液三維空間結構。溶液三維空間結構。NMRNMR技術最大的優(yōu)點在于它能對在溶技術最大的優(yōu)點在于它能對在溶液中和非晶態(tài)的蛋白質進行測量液中和非晶態(tài)的蛋白質進行測量 多維核磁共振波譜技

28、術成為確定蛋白質和核酸等生物分子多維核磁共振波譜技術成為確定蛋白質和核酸等生物分子溶液三維空間結構的唯一有效手段。近幾年來異核核磁共溶液三維空間結構的唯一有效手段。近幾年來異核核磁共振方法迅速發(fā)展，已可用于確定分子量為振方法迅速發(fā)展，已可用于確定分子量為151525KDa25KDa蛋白蛋白質分子溶液的三維空間結構質分子溶液的三維空間結構 質譜質譜 質譜方法質譜方法(Mass (Mass Spectroscope,MSSpectroscope,MS):):可以正確測定蛋白質分子的質可以正確測定蛋白質分子的質量而進行蛋白質分子鑒定、蛋白質分子的修飾和蛋白質分子相互作用的量而進行蛋白質分子鑒定、蛋白質分子的修飾