實(shí)驗(yàn)四免疫印跡

1、組成l十二烷基磺酸納-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）l蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印l固相免疫測(cè)定 聚丙烯酰胺凝膠電泳過程中三種物理效應(yīng)： 樣品的濃縮效應(yīng) 凝膠的分子篩效應(yīng) 一般電泳分離的電荷效應(yīng)lSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中，由于SDS和巰基乙醇作用，使得蛋白質(zhì)分子中二硫鍵還原，氫鍵、疏水鍵打開，SDS按14gSDSlg蛋白質(zhì)的比例結(jié)合到蛋白質(zhì)多肽鏈分子上，形成SDS多肽復(fù)合物。l十二烷苯磺酸根帶負(fù)電，使各種SDS多肽復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過了 蛋白質(zhì)多肽分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)多肽分子間原有的電荷差別l同時(shí)，在水溶液中，SDS多肽復(fù)合物具有近似的形狀(長(zhǎng)橢圓棒狀)，

2、并且不同SDS多肽復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度趨于一 致，而長(zhǎng)軸與分子量成正比。這樣，SDS多肽復(fù)合物，在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的遷移率，不再 受蛋白質(zhì)多肽原有電荷和形狀的影響，而只與其分子量有關(guān)，并且在一定條件下與遷移率成線性關(guān)系l聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(acry1amide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑亞甲雙丙烯酰胺(N,N-methylene bisacry1amide，簡(jiǎn)稱Bis)在催化劑的作用下聚合而成 l凝膠聚合時(shí)所形成的微孔影響了不同SDS多肽復(fù)合物電泳時(shí)的遷移率，即所謂的分子篩效應(yīng)。微孔的大小由于Bis和Acr的比例和凝膠的濃度決定。l凝膠的濃度與有效分離范圍：lSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳使用

3、一種不連續(xù)的緩沖液系統(tǒng),在這一系統(tǒng)中，凝膠分為低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液也有不同的pH和離子強(qiáng)度。l當(dāng)電泳時(shí)，凝膠中樣品里的SDS多肽復(fù)合物沿移動(dòng)的界面遷移，在分離膠表面形成了一個(gè)極薄的層，極大地濃縮了樣品的體積l電泳裝置 垂直板電泳槽（水平）電泳儀 NC膜、Whatman 3MM濾紙 A液30%丙烯酰胺儲(chǔ)存液 B液 1.5mol/L Tris-HCl分離膠緩沖液（pH8.8 ） C液 0.5mol/L Tris-HCl濃縮膠緩沖液（pH6.8 ） D液 雙蒸水 E 液 10% SDS F液 四甲基乙二胺（TEMED） G液 10過硫酸銨 Tris-甘氨酸電泳緩沖液 、

4、上樣緩沖液 、印跡電泳緩沖液 、封閉液 、脫色液 SDS-PAGE 凝膠的制備 SDS-PAGE貯備液（試劑中的AF液）按比例制備 分離膠(T=12) 濃縮膠(T=5 ) l灌分離膠 分離膠溶液迅速灌注 ，留出灌注濃縮膠所需的空間（梳子長(zhǎng)加1cm）l灌濃縮膠 分離膠聚合完全，灌入濃縮膠并立即插入Teflon梳子（避免氣泡）移出梳子，用去離子水洗加樣槽 l蛋白質(zhì)變性 蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液按1:1的比例混合后，100加熱3min l加樣 樣品10l/孔，無蛋白質(zhì)樣品時(shí)用上樣緩沖液代替 電泳 恒流電泳 ，分離膠中電壓提高，溴酚藍(lán)標(biāo)記移至底部時(shí)終止電泳。l電泳完畢，切膠，剪與膠等大的1張NC膜及6張濾紙l凝膠、NC膜、濾紙、海綿襯墊用印跡電泳緩沖液浸濕l按圖所示裝好印跡電泳裝置，注意蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移方向 - +，除