分子生物學--分子克隆技術(shù)

1、1基因操作技術(shù)及其應用基因操作技術(shù)及其應用2參考書目資料參考書目資料n分子克隆實驗指南（第三版）：美J.薩姆布魯克等著, 黃培堂等譯，科學出版社，2008.nGene IX：Benjamin Lewin編著.n基因工程原理：吳乃虎，科學出版社，1998.n分子生物學實驗指導：郜金榮，葉林柏，武漢大學出版社，2007.n基因工程：張惠展，華東理工大學出版社，2005.3分子克隆分子克隆45n 基因工程是指在微觀領域（分子水平）中，根據(jù)分子生物學和遺傳學原理，設計并實施一項把一個生物體中有用的目的DNA(遺傳信息)轉(zhuǎn)入另一個生物體中，使后者獲得新的需要的遺傳性狀或表達所需要的產(chǎn)物，最終實現(xiàn)該技術(shù)的

2、商業(yè)價值。n 基因工程的基本特點是，分子水平基因工程的基本特點是，分子水平操作，細胞水平表達。操作，細胞水平表達。6n 重組DNA技術(shù)的重大突破帶動了現(xiàn)代生物技術(shù)的興起，并很快產(chǎn)生了許多生命科學的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)。n 重組DNA技術(shù)，又稱為基因或分子克隆技術(shù)，是基因工程的核心技術(shù)。該技術(shù)包括了一系列的分子生物學操作步驟。基因工程的核心技術(shù)是DNA重組技術(shù)7n分子克隆技術(shù)分子克隆技術(shù) 又稱為重組又稱為重組DNA技術(shù)，是指將一種生物體（供體）的基因與載體在技術(shù)，是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）

3、內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序。體外操作程序。 供體、受體、載體是重組供體、受體、載體是重組DNADNA技術(shù)的三大基本元件。技術(shù)的三大基本元件。8 重組DNA操作一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；（3）用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細胞，并能在受體細胞中復制和遺傳；（4）對轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（5）對獲得外源基因的細胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達出所需要的產(chǎn)物。9n 獲得需要的目的基因常用的方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構(gòu)建基因文庫(gene librar

4、y)，從中調(diào)用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補的DNA片段；（3）利用聚合酶鏈式反應（PCR）特異性地擴增所需要的目的基因片段，等等。10細胞內(nèi)總DNA的提取分離與基因文庫的構(gòu)建細胞內(nèi)總DNA的提取分離程序11l 紫外分光光度計測定DNA溶液的純度和濃度。12基因工程的工具酶基因工程的工具酶“手術(shù)刀手術(shù)刀” 專司切割之職，內(nèi)切酶專司切割之職，內(nèi)切酶“縫紉針縫紉針” 具有連接之功，連接酶具有連接之功，連接酶“復印機復印機” 行使復制之責，行使復制之責，DNA聚合酶聚合酶13(“交通工具車子交通工具車子”)載體載體n有了切割與縫合（有了切割與縫合（ligase）基因基因DNA的工具

5、，還得的工具，還得有一個有一個“車子車子”將重組將重組DNA送到宿主細胞中去。送到宿主細胞中去。 14逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶使真核基因的制備成為可能。使真核基因的制備成為可能。 （1）真核基因組龐大而復雜，不易制得基因圖譜。）真核基因組龐大而復雜，不易制得基因圖譜。 （2）即使有了基因圖譜，因為真核基因有內(nèi)含子，不能）即使有了基因圖譜，因為真核基因有內(nèi)含子，不能在原核表達系統(tǒng)剪接出在原核表達系統(tǒng)剪接出mRNA，沒有成熟的沒有成熟的mRNA就不就不能得到相應得產(chǎn)物。能得到相應得產(chǎn)物。 （3）經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄）經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄mRNAcDNA (complementory DNA)得得到的到的cDNA文庫要比基因組

6、文庫小得多，所以篩選陽性克文庫要比基因組文庫小得多，所以篩選陽性克隆就方便得多。隆就方便得多。 15四、分子克隆的技術(shù)支撐四、分子克隆的技術(shù)支撐n核酸凝膠電泳技術(shù)n核酸分子連接技術(shù)n細菌轉(zhuǎn)化技術(shù)nDNA序列分析技術(shù)n寡核苷酸合成技術(shù)n基因定點突變技術(shù)n聚合酶鏈反應（PCR）技術(shù)nDNA序列測定技術(shù)16核酸凝膠電泳核酸凝膠電泳17細菌轉(zhuǎn)化技術(shù)細菌轉(zhuǎn)化技術(shù)（包括感受態(tài)細胞制備）（包括感受態(tài)細胞制備）18聚合酶鏈反應（聚合酶鏈反應（PCR）技術(shù)）技術(shù)19大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)野生細胞野生細胞分離工程酶分離工程基因工程蛋白質(zhì)工程途徑工程工程細胞發(fā)酵工程酶工程細胞工程生物活性物質(zhì)2

7、021 用攜帶了外源基因的農(nóng)桿菌用攜帶了外源基因的農(nóng)桿菌TiTi質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體，發(fā)育成具有新性狀的完整植株質(zhì)體，發(fā)育成具有新性狀的完整植株轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因植物。 22基因工程的工具酶基因工程的工具酶“手術(shù)刀手術(shù)刀” 專司切割之職專司切割之職“縫紉針縫紉針” 具有連接之功具有連接之功“復印機復印機” 行使復制之責行使復制之責內(nèi)切酶內(nèi)切酶連接酶連接酶聚合酶聚合酶23內(nèi)切酶內(nèi)切酶“手術(shù)刀手術(shù)刀” 專司切割之職專司切割之職“縫紉針縫紉針” 具有連接之功具有連接之功“復印機復印機” 行使復制之責行使復制之責內(nèi)切酶內(nèi)切酶連接酶連接酶聚合酶聚合酶24內(nèi)切酶25同裂酶(Isoschiz

8、omers）26同尾酶27星活性*n所謂星活性又稱Star活性。是指由于反應條件不同而產(chǎn)生的切斷與原來認識序列不同的位點的現(xiàn)象，也就是說產(chǎn)生Star活性后，不但可以切斷特異性的識別位點，還可以切斷非特異性的位點。產(chǎn)生Star活性的結(jié)果是酶切條帶增多。 nDifferences which can lead to star activity include low ionic strength, high pH, and high ( 5% v/v) glycerol concentrations.nHigh Fidelity (HF) Restriction Enzymes can be us

9、ed to reduce star activity.2829DNA聚合酶nTaq酶用Taq酶擴增DNA時常使片段3端凸出一個A。nPfu酶產(chǎn)生平末端產(chǎn)物。30連接酶nT4 DNA Ligase (invitrogen)16C過夜或者室溫1-2個小時了連接即可。31基因工程的載體-用于擴增32克隆載體必備條件克隆載體必備條件（1）具有復制起點（2）具有抗菌素抗性基因（3）具有若干限制酶單一識別位點（4）具有較小的相對分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)。33表達型基因工程的載體-以PET32為例34多克隆位點35宿主n要考慮宿主菌對密碼子的偏愛性 大腸桿菌不同密碼子的偏愛性問題，將64組密碼子分為強、中、弱

10、密碼子36目的產(chǎn)物目的產(chǎn)物目的基因不溶性的高效表達n過程：目的基因編碼的真核蛋白質(zhì)與宿主基因編碼的原核多肽或或其它基因編碼的具有其它功能的多肽和結(jié)合在一起，這種結(jié)合在一起的形成的不溶性無活性的包涵體，又叫為融合蛋白。n舉例：胰島素與-半乳糖苷酶形成包涵體n優(yōu)點：避免細菌蛋白酶破壞，提高目的基因表達產(chǎn)物產(chǎn)量。n缺點：需要經(jīng)過溶解和復性才能獲得有活性的n適合：不需要翻譯后修飾的蛋白質(zhì)產(chǎn)物37目的基因的高效分泌表達n概念：目的蛋白分泌到細胞周質(zhì)和目的蛋白轉(zhuǎn)運到細胞周質(zhì)后再分泌到細胞外n優(yōu)點： 防止宿主菌對表達產(chǎn)物的降解；有利于蛋白質(zhì)正確折疊，形成天然構(gòu)象減輕宿主細胞代謝負荷有利于分離n需要在質(zhì)粒設計

11、時加入一段信號肽基因38基因克隆操作過程39克隆示意圖40克隆示意圖41克隆技術(shù)流程n分n切n連n轉(zhuǎn)n篩42分n分離（來自生物組織）、擴增（設計引物，PCR擴增）nmRNA-DNA-擴增43引物設計與訂購n酶切位點雙酶切、保護堿基、最合適的緩沖液。n引物訂購44保護堿基451.用限制性酶消化限制性酶消化 DNA 樣品樣品46單酶切47雙酶切48選擇合適的雙酶切緩沖液492.用限用限制性內(nèi)制性內(nèi)切酶消切酶消化化質(zhì)粒DNA 503.連接樣品DNA和質(zhì)粒DNA的消化產(chǎn)物51連接前最好要定量n連接比例摩爾比例為：插入片度：質(zhì)粒=10:1-5:1為佳。n質(zhì)粒幾十個ng為佳。52雙酶切雙酶切GCTTAAA

12、TCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點切割位點Bg l切割位點切割位點AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末端的配伍末端的連接情況和同一連接情況和同一限制酶切位點連限制酶切位點連接相似。接相似。53冷循環(huán)器544.用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞n轉(zhuǎn)化細菌有兩個基本方法。一是 化學法，即用CaCl2 處理并加熱激以促進DNA進入菌體；二是電

13、激法，即 施加短脈沖的電荷以促進施加短脈沖的電荷以促進DNA 吸收。55用氯化鈣化學轉(zhuǎn)化用氯化鈣化學轉(zhuǎn)化56用氯化鈣化學用氯化鈣化學轉(zhuǎn)化57電激轉(zhuǎn)化電激轉(zhuǎn)化58一個電激轉(zhuǎn)化程序n加 50-200ng DNA 到 40ul 電激感受態(tài)細菌中n將混合物放入一個預冷的電激杯中n施以脈沖電處理，脈沖長度預期值為 8 to 12msn立即加1ml LB 培養(yǎng)液，在室溫下振蕩 2-4 小時。分別取10ul 和 100ul 涂布在到兩個加有抗菌素的LB 瓊脂平板上， 保溫培養(yǎng)1天。 595. 細菌在加有在加有Amp+X-Gal的培養(yǎng)基上生長以進行篩選n連接會有三種結(jié)果，一是要插入的序列自連；二是切開的質(zhì)粒重

14、連；三是要插入的序列與質(zhì)粒相連。第一種連接結(jié)果沒有菌落形成。第二種連接結(jié)果表現(xiàn)為藍色菌落。只有后一種結(jié)果是符合需要的，產(chǎn)生白色的抗氨芐青霉素菌落。 60滅菌器61加IPTG和X-GAL62倒平板63 互補互補利用利用互補原理篩選重組體互補原理篩選重組體pUC18 64篩選結(jié)果n藍菌落代表含有質(zhì)粒的耐藥菌，表達出由完好的藍菌落代表含有質(zhì)粒的耐藥菌，表達出由完好的 LacZ序列編碼的功能性的功能性的 片段。片段。n白菌落代表含有質(zhì)粒的耐氨芐青霉素菌，質(zhì)粒上白菌落代表含有質(zhì)粒的耐氨芐青霉素菌，質(zhì)粒上 LacZ序列上有上有插入片段。插入片段。65乳糖和誘導物IPTG的化學結(jié)構(gòu) 66X-galnX-Ga

15、l是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的顯色底物，在-半乳糖苷酶的催化下會產(chǎn)生藍色產(chǎn)物。常用于-半乳糖苷酶的原位染色檢測以及藍白斑篩選。67X-gal水解68篩選結(jié)果模式圖69藍菌落n建議用DH5做宿主菌。 70藍白菌落71電泳儀72n經(jīng)過雙酶切、PCR等鑒定，送陽性克隆測序。n提取正確的克隆菌中的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入表達型的菌株，如BL21等。誘導表達蛋白73鑒定方法74 PCR鑒定鑒定75 原位雜交原位雜交76雞的雞的肌球蛋白的克隆和檢出肌球蛋白的克隆和檢出免疫學方法免疫學方法 77蛋白質(zhì)的純化78謝謝！79多利誕生的過程多利誕生的過程 為什么震驚和驚呼，我們先了解一下多利誕生的過程以及胚

16、胎細胞克隆為什么震驚和驚呼，我們先了解一下多利誕生的過程以及胚胎細胞克隆和體細胞克隆的區(qū)別這兩個基本問題，對我們學習后面內(nèi)容或許有所幫和體細胞克隆的區(qū)別這兩個基本問題，對我們學習后面內(nèi)容或許有所幫助和啟發(fā)。助和啟發(fā)。 多利誕生的過程：多利誕生的過程： 1.取出第一只成年母羊乳腺的普通細胞，分離基因備用。取出第一只成年母羊乳腺的普通細胞，分離基因備用。 2.取出第二只母羊未受精的卵細胞，取出基因換上第一只羊乳腺細胞取出第二只母羊未受精的卵細胞，取出基因換上第一只羊乳腺細胞基因（基因（“掉包掉包”），放電激活該卵細胞，使之象正常受精卵一樣進行細），放電激活該卵細胞，使之象正常受精卵一樣進行細胞分裂，直至一定階段，胚胎成熟。胞分裂，直至一定階段，胚胎成熟。 3.將成熟的胚胎移植到第三只母羊子宮中發(fā)育，妊娠（同正常一樣）將成熟的胚胎移植到第三只母羊子宮中發(fā)育，妊娠（同正常一樣），最后產(chǎn)下多利。，最后產(chǎn)下多利。 這樣一只與第一只羊基因百分之百一樣的復制品誕生了。這樣一只與第一只羊基因百分之百一樣的復制品誕生了。 808182目的基因高效表達規(guī)律目的基因高效表達規(guī)律1.目的蛋白無須變形和復性就具有生物活性的表達方式2.對于翻譯后需要修飾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，能夠進行目的蛋白結(jié)構(gòu)修飾的表達方式3.能夠?qū)⒛康牡鞍追置诘郊毎苜|(zhì)、特別是分泌到細胞外的分泌型表達