第六章DNA重組與克隆(陜西師范大學(xué))

1、第六章DNA重組與克隆(陜西師范大學(xué))DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合稱遺傳重組或或基因重排。重組產(chǎn)物稱為重組體?；蛑亟M主要發(fā)生在減數(shù)分裂時(shí)同源染色體之間的交換。（形式多樣）重組與進(jìn)化關(guān)系密切，增加群體的遺傳多樣性，利于突變的優(yōu)化組合。DNA重組接合作用 (conjugation)轉(zhuǎn)化作用 (transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transduction)#轉(zhuǎn) 座 (transposition)#同源重組 (homologous recombination)#位點(diǎn)特異的重組(site-specific recombination)異常重組發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(ho

2、mologous recombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。 以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型。6.1、同源重組Holliday模型中，同源重組主要4個(gè)關(guān)鍵步驟 兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體通過分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA（立體異構(gòu)）Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patch recombinant)拼接重組體(splice reco

3、mbinant) 片段重組體 ： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。 5555333355553333 內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移 (recA) 內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中間體53535353目 錄片段重組體 （見模型圖左邊產(chǎn)物）： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體

4、（見模型圖右邊產(chǎn)物）： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。 5353535353535353Holiday中間體535353535355533355553333555533335555333355553333內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶 DNA連接酶片段重組體拼接重組體目 錄分支移動(dòng)的過程伴隨著DNA 的修復(fù)同源重組是減數(shù)分裂的原因。同源重組是由于堿基間的精確配對(duì)實(shí)現(xiàn)的異源雙鏈與基因交換同源重組時(shí)會(huì)產(chǎn)生異源雙鏈，從而發(fā)生基因交換。減數(shù)分裂后分離：（對(duì)異源雙鏈區(qū)內(nèi)不配對(duì)堿基的修復(fù)而進(jìn)行的基因校正過程稱作基因轉(zhuǎn)換）基因轉(zhuǎn)換頻率在非對(duì)稱異源雙鏈

5、區(qū)較高。基因轉(zhuǎn)換也可以在有絲分裂時(shí)姐妹染色體的等位基因間、有絲分裂與減數(shù)分裂時(shí)同一條染色單體上非等位重復(fù)基因之間發(fā)生Holliday 模型提出了同源重組的基本模式，但對(duì)于基因重組具體細(xì)節(jié)，異源雙鏈的形成細(xì)節(jié)不清楚。在Holliday基礎(chǔ)上提出了單鏈斷裂模型和雙鏈斷裂模型，兩個(gè)模型的區(qū)別在于解釋重組期間DNA的修復(fù)的具體過程不一樣。有供體受體之分。（受體：發(fā)生鏈斷裂的分子P138-139）細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組低等生物也可以以轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合等多種方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的基因轉(zhuǎn)移。具體方式：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合。外源基因的命運(yùn)：降解、暫時(shí)保留、與內(nèi)源基因置換、整合。一、接合作用（conjugatio

6、n)當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用。F 因子編碼表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、DNA轉(zhuǎn)移通道蛋白等、F 因子可以與細(xì)菌染色體發(fā)生交叉連接而重組整合入細(xì)菌染色體二、轉(zhuǎn)化作用（transformation)通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型。感受態(tài)細(xì)胞高濃度鈣可以誘導(dǎo)感受態(tài)例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。三、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（transduction)當(dāng)病毒從被感染的細(xì)胞（供體）釋放出來，再次感染另一細(xì)胞（受體）時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組。溶

7、 菌感 染重 組感 染細(xì) 菌噬菌體圖 15-3 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過病毒介導(dǎo)發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞 之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組轉(zhuǎn)導(dǎo)：當(dāng)病毒從被感染的供體細(xì)胞釋放出來，再次感染另一受體細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)*轉(zhuǎn)染(transfection)轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式。 由transformation（轉(zhuǎn)化）和 infection（感染）兩詞構(gòu)成。原指將噬菌體、病毒或以其為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。通過感染方式將外來DNA引入宿主細(xì)胞，并導(dǎo)致宿主細(xì)胞遺傳性狀改變的過程稱為轉(zhuǎn)染。將任何類型DNA轉(zhuǎn)移至動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的

8、過程均可叫轉(zhuǎn)染。細(xì)菌的細(xì)胞融合由于細(xì)胞質(zhì)膜融合導(dǎo)致的基因轉(zhuǎn)移和重組。（原生質(zhì)體融合）細(xì)菌的同源重組的酶學(xué)機(jī)制1、RecBCD（外切核酸酶）和 Chi 位點(diǎn)具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、 序列特異性的單鏈內(nèi)切酶活性單鏈內(nèi)切酶活性和解旋酶活性使DNA產(chǎn)生具有游離末端的單鏈 RecA的作用位點(diǎn)RecBCD有固定切割位點(diǎn)原核生物的重組酶學(xué)機(jī)制已經(jīng)比較清楚Chi 位點(diǎn)出現(xiàn)幾率很高，是RecBCD的靶位點(diǎn)GCTGGTGG3 RecBCD的識(shí)別和切割位點(diǎn)a、 RecBCD結(jié)合在DNA的平 頭末端（產(chǎn)生機(jī)制不清楚）b、 外切、解鏈、移動(dòng) （ATP）c、 兔耳狀 loop 結(jié)構(gòu)產(chǎn)生再

9、旋酶活性低于解旋酶活性）d、 RecBCD 在 loop 單鏈區(qū)的 chi 位點(diǎn)3方46NT處切 斷單鏈（單鏈內(nèi)切酶） chi位點(diǎn)：GCTGGTGG 目前發(fā)現(xiàn)的重組熱點(diǎn) E.coli 含 1000 個(gè)、Euk.e、 RecBCD 切割產(chǎn)生3單鏈末端 2、RecA 蛋白 （1） 活性a、 RecA 有單、雙鏈 DNA 結(jié)合活性 b、 RecA 有 NTPase 活性（底物差異活性） 與單鏈 DNA 結(jié)合時(shí)活性最大-依賴于 DNAc、 RecA 有啟動(dòng)一個(gè)分子的單鏈侵入到另一雙螺旋分子 的能力，即聯(lián)會(huì)同源 DNA （但其靶 DNA 必須有缺口結(jié)合DNA）RecA入侵單鏈被置換連RecA引發(fā)鏈侵入模

10、型RecA引起的鏈交換和Holliday結(jié)構(gòu)的生成 （2）RecA 蛋白催化雙鏈和單鏈 DNA 的反應(yīng)階段a、 聯(lián)會(huì)前階段（緩慢） RecA 與單鏈結(jié)合b、 單鏈與雙螺旋的互補(bǔ)鏈迅速配對(duì)，形成雙鏈連接分子 Holliday（5侵入）c、 從雙螺旋結(jié)構(gòu)中緩慢置換一條鏈產(chǎn)生一段長的異源雙鏈 DNA 反應(yīng)結(jié)束時(shí)，RecA 結(jié)合到雙鏈上 其中單鏈同化有固定的方向 入侵單鏈進(jìn)入的方向是53， 雙鏈 DNA 的互補(bǔ)鏈?zhǔn)?5 RecBCD 和 RecA 的共同作用RecBCD產(chǎn)生游離單鏈-RECA 因子接到重組反應(yīng) 3、原核同源重組的其它蛋白 需要 E.coli 中三個(gè)基因 ruvA,ruvB 和 ruvC

11、 的產(chǎn)物 a、 RuvA 識(shí)別 Holliday 結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)b、 RuvB 為分枝遷移提供動(dòng)力（ATPase 1020bp/s） c、 RuvC 核酸內(nèi)切酶-專一性識(shí)別 Holliday 結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn) 體外切段連接點(diǎn)以拆分重組體 E.coli 重組的各階段 （損傷修復(fù)）損傷DNA復(fù)制產(chǎn)生缺口RecA鏈交換第二次鏈交換DNApol通過DNA合成填滿缺口RuvA,B分枝遷移RuvC切割Holliday連接點(diǎn)真核生物同源重組機(jī)制自學(xué)7.2、位點(diǎn)專一性重組（ site-specific recombination）1、概念：發(fā)生在專一序列而順序極少相同的DNA分子間 的重組（包括一些基因表達(dá)調(diào)節(jié)、發(fā)

12、育過程中DNA重排）噬菌體基因組整合到細(xì)菌染色體基因組中屬此種重組2、特征： 在特定的結(jié)合序列部位，有專一的酶催化斷裂重接 -產(chǎn)生精確的DNA重排 都具有整合作用的兩個(gè)基本特征a、 典型的保守性重組-交換是相互的和保存原先的DNAb、 發(fā)生在噬菌體和細(xì)菌DNA短同源序列的專一性核苷酸上二、phage的整合與切除（溶原和裂解狀態(tài)）1、實(shí)現(xiàn)機(jī)制：均是通過-細(xì)菌DNA和DNA上特定位點(diǎn)之間的重組2、特定位點(diǎn)-附著位點(diǎn)（attachment site att） E.coli attB 含BOB三序列 23bp phage attP 含 POP三序列 240bp 核心序列 “O”完全一致 （同源部分）

13、-位點(diǎn)特異性重組發(fā)生的地方 B,B,P,P-臂3、整合過程 整合后的附著位點(diǎn)為 attL（BOP） attR（POB） 整合位點(diǎn)-attB、attP 切除位點(diǎn)-attL、attR 整合過程需要整合酶 （integrase Int）（編碼） 和寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用溶源性細(xì)菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌體4、整合分子機(jī)制 核心序列O全長15bp，富含A-T 發(fā)生在O內(nèi)的重組交換位點(diǎn)相距 7bp 整合酶的結(jié)合位點(diǎn)：attP 240bp、attB 23bp(兩者的作用不同) attP位點(diǎn)的負(fù)超螺旋為重組所必須-加強(qiáng)了I

14、nt和IHF的親和力 -高劑量的蛋白維持單鏈重組所必需的結(jié)構(gòu) Int結(jié)合 -核心序列的反向位點(diǎn)（切割位置） -結(jié)合在att臂上（臂與核心區(qū)靠近）intIHFXis 整合體及其作用 整合體（intasome）- Int和IHF結(jié)合到attP時(shí)的復(fù)合物 整合體捕獲attB 說明- a、attB和attP的最初識(shí)別靠Int 識(shí)別兩序列的能力 b、兩序列的同源性在鏈交換時(shí)為 重要因素 Int蛋白能切斷DNA，并使它重新連接，近而使holliday結(jié)構(gòu)拆分 重組時(shí)attP和attB部位交叉斷裂，互補(bǔ)單鏈末端進(jìn)行交叉雜交例（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變 hix為反向重復(fù)序列，它們

15、之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。 H2鞭毛素 阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1 H1鞭毛素hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變P1977.3、轉(zhuǎn)座成分概述1、轉(zhuǎn)座子(元)或轉(zhuǎn)座元件(transposon or transposable element): 基因組上不必借助于同源序列就可以移動(dòng)的DNA片段，它們可以直 接從基因組的一個(gè)位點(diǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)（供體和受體）轉(zhuǎn)座（transpo

16、sition）：轉(zhuǎn)座元的轉(zhuǎn)移過程（不十分確切）2、發(fā)現(xiàn)和發(fā)展 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes 玉米果皮、糊粉層花斑突變 玉米籽粒糊粉層色素不穩(wěn)定遺傳機(jī)理 跳躍基因（jumping gene） 1947 冷泉港實(shí)驗(yàn)室（美） Barbara McClintocka) 不依賴供體序列與靶位點(diǎn)間序列的同源性b) 轉(zhuǎn)座不是簡單的轉(zhuǎn)移，涉及轉(zhuǎn)座子的復(fù)制Hotspots (熱點(diǎn))Regional preference ( 在3kb區(qū)域內(nèi)的隨機(jī)插入) d) 某些轉(zhuǎn)座因子（Tn3）對(duì)同類轉(zhuǎn)座因子的插入具有排他性 （免疫性）e) 靶序列在轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)會(huì)形成正向重復(fù)

17、 f) 轉(zhuǎn)座因子的切除與轉(zhuǎn)座將產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳學(xué)效應(yīng)3、轉(zhuǎn)座重組的特點(diǎn)c) 轉(zhuǎn)座插入的靶位點(diǎn)并非完全隨機(jī)（插入專一型）二、Prok.轉(zhuǎn)座子種類 兩種類型： 簡單轉(zhuǎn)座子（simple transposon） （插入序列 insertion sequence IS ） 復(fù)合轉(zhuǎn)座子（composite transposon） 共同特征： a）兩端有2040bp的IR(反向重復(fù)序列) b）具有編碼轉(zhuǎn)座酶（transposase）的基因1、插入序列（最簡單的轉(zhuǎn)座子稱作插入序列） 最簡單，是細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和某些噬菌體的正常組分 命名： IS編號(hào)（鑒定類型） 長度 7002000bp 特點(diǎn)： a）兩端IR為

18、轉(zhuǎn)座酶的識(shí)別位點(diǎn)（突變） b）插入靶位點(diǎn)后會(huì)出現(xiàn)靶位點(diǎn)的正向重復(fù)（39bp） IS 可以正反方向插入到DNA（宿主、質(zhì)?；蚰承┦删w）， 常對(duì)插入位點(diǎn)后面的基因表達(dá)功能產(chǎn)生極性效應(yīng)a) Tn / TnA family l 具有IR、轉(zhuǎn)座酶基因、 調(diào)節(jié)基因（解離酶）、抗抗生素基因 l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) Tn5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn10 (TetR) 2.5 kb 20 kb Tn3 IR TnpA Res TnpR AmpR IR 38bp 3

19、8bp 轉(zhuǎn)座酶 regulator - 內(nèi)酰胺酶 2、復(fù)合轉(zhuǎn)座子 兩種類型 b）兩端重復(fù)序列為IS的復(fù)合轉(zhuǎn)座子 e.g. IS插入到功能基因兩端，可能形成復(fù)合轉(zhuǎn)座因子IS ISIS IS L IS R臂 中心區(qū) 臂transposition 當(dāng)兩個(gè)IS組件相同時(shí)，其中任一個(gè)都可行使轉(zhuǎn)座功能 不同時(shí)，主要依靠一個(gè) 兩側(cè)的IS既可以是IR，又可以是DR狀態(tài)（IR多）3 轉(zhuǎn)座噬菌體 Mu phage （巨型轉(zhuǎn)座子 ） C repressor for A, BB 33 kd 與轉(zhuǎn)座有關(guān)A 70 kd 轉(zhuǎn)座酶U, S 毒性蛋白attL, attR 與寄主同源，反向重復(fù)，轉(zhuǎn)座必需 Gin G區(qū)倒位酶 at

20、t L C A B S U att R 150bp 1.5kb G 倒位區(qū) 38kbPgin 以E.coli為寄主的溫和型噬菌體（溶源、裂解） Mu的插入途徑a） 侵入的Mu在溶源化過程中任意插入寄主DNA （兩側(cè)各5bp的靶位點(diǎn)序列重復(fù)）b） 進(jìn)入裂解生長后，復(fù)制產(chǎn)生后代Mu DNA幾乎全部插入寄主 DNA中，并可繼續(xù)轉(zhuǎn)座（形成寄主DNA和Mu的共合體），噬 菌體成熟時(shí)，切段共合體包裝三、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)作機(jī)制及模式 三種類型：復(fù)制型、非復(fù)制型和保守型1、復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式 實(shí)質(zhì)：轉(zhuǎn)座子元件被復(fù)制并被移動(dòng)到受體位點(diǎn)，最終轉(zhuǎn)座過程 擴(kuò)增了轉(zhuǎn)座子的拷貝（供、受點(diǎn)） 需兩種酶： 轉(zhuǎn)作酶（作用于原拷貝兩末端）

21、 解離酶（作用于復(fù)制后的拷貝） 模式： 兩大步 a) 共合體形成 切口連接復(fù)制 b) 拆分 靶位點(diǎn)的DR形成2、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式 供體上最終產(chǎn)生雙鏈斷裂 供體位點(diǎn)如不能被修復(fù)則有致 死效應(yīng)五、轉(zhuǎn)座子的某些遺傳學(xué)效應(yīng)P157轉(zhuǎn)座可以導(dǎo)致基因變異插入操縱子位置可以影響操縱子下游基因表達(dá)應(yīng)用：難以篩選的基因轉(zhuǎn)移基因定位標(biāo)記篩選插入突變構(gòu)建特殊菌株克隆難以進(jìn)行表型鑒定的基因7.3.6 真核生物的轉(zhuǎn)座成分P152自學(xué) 真核生物的轉(zhuǎn)座成分根據(jù)轉(zhuǎn)座機(jī)制目前分為兩類： a) 轉(zhuǎn)座機(jī)制與細(xì)菌的轉(zhuǎn)座子類似需要轉(zhuǎn)座酶、兩端的IR,轉(zhuǎn)座靶點(diǎn)序列隨機(jī)， 遺傳信息： DNADNA轉(zhuǎn)座酶、轉(zhuǎn)座因子兩端的IR序列， 玉米的A

22、c-Ds元件、果蠅的P元件和FB元件等 b) 轉(zhuǎn)作機(jī)制類似逆轉(zhuǎn)錄病毒 真核生物特有的轉(zhuǎn)座機(jī)制（逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座） 遺傳信息： DNARNADNA 逆轉(zhuǎn)錄子轉(zhuǎn)錄成RNA,然后反轉(zhuǎn)錄成DNA,插入基因組，類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒的作用 如：逆轉(zhuǎn)錄病毒、果蠅的copia元件、酵母的Ty元件逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，P208逆轉(zhuǎn)錄酶生物學(xué)意義：影響其他基因表達(dá)，介導(dǎo)基因重排，促進(jìn)基因的流動(dòng)第 二 節(jié) 重組DNA技術(shù)DNA Recombination Technique 重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年 的豌豆雜交試驗(yàn)1944年 的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1973年 美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子1977年 美國南舊金山由博

23、耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年 開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉一、相關(guān)概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體二、基本原理及操作步驟 本節(jié)主要內(nèi)容一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念 克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一） DNA克隆DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因

24、的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等。目的 分離獲得某一目的基因或DNA 獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(genetic engineering) 實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作，又稱重組DNA技術(shù)。（二）工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末

25、端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA 3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease)識(shí)別DNA的特異序列, 并在識(shí)別

26、位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護(hù)自身DNA。分類：、類（基因工程技術(shù)中常用的是類）第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin d 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶類酶識(shí)別序列特點(diǎn)： 回文結(jié)構(gòu)(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBam HGTCCAGGCCTAGGAT

27、CC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A（三）目的基因 cDNA (complementary DNA)基因組DNA (genomic DNA)（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌

28、體DNA病毒DNA克隆載體(cloning vector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。1. 質(zhì)粒 (plasmid)特點(diǎn): 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息, 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt

29、系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?. 噬菌體(phage) M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列 Multiple Cloning Sites3. 柯斯質(zhì)粒(cosmid)pJB8的物理圖譜酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體桿狀病毒載體其他二、重組DNA技術(shù)基本原理目的基因的獲取重組DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá) 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的DNA 克 隆 過 程（一）目的基因的

30、獲取1. 化學(xué)合成法已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。2.基因組DNA文庫(genomic DNA library)3. cDNA文庫(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR) 1.化學(xué)合成法由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列組織或細(xì)胞染色體DNA基因片段克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合2. 基因組DNA文庫限制酶切位點(diǎn)限制酶消化 除去中間片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化 外源

31、DNA與載體DNA混合 連接反應(yīng) 體外包裝 用重組噬菌體感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段 基因文庫mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制3.cDNA文庫 逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶堿水解 T T T T是一種在體外利用酶促反應(yīng)大量獲得特異序列的基因組DNA或cDNA的專門技術(shù)，又稱為無細(xì)胞的分子克隆。4. 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）模板DNA引物4種dNTPTaq DNA聚合酶含Mg2+的緩沖液。PCR的反應(yīng)體系（1）變性，加熱至95 ，使模

32、板DNA解開成單鏈；（2）退火，溫度降至適宜，使引物與模板互補(bǔ)結(jié)合；（3）延伸，溫度升至72 ，DNA聚合酶以4種dNTP為底物，在引物的3-OH上，合成與模板互補(bǔ)的DNA新鏈。PCR的基本反應(yīng)步驟及原理PCR反應(yīng)條件變性95C延伸72C退火Tm-5CPCR反應(yīng)的基本原理（三）外源基因與載體的連接1. 粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建Bam H切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割載體DNA用Bam H切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接不同

33、限制酶切位點(diǎn)的連接Eco R切割位點(diǎn)Bg l切割位點(diǎn)+EcoR+ Bg l雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切T4 DNA連接酶15C重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。2. 平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15C重組體載體自連目的基因 自連3. 同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。5335載體DNA5335目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT

34、35 5 3355 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶15C重組體4. 人工接頭(linker)連接由平端加上帶有新的酶切位點(diǎn)的接頭，再用限制性酶切產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。Eco REco REco R人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R受體菌條件安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染 (transfection)感染 (infection)

35、（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌（五）重組體的篩選1. 直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(3) 分子雜交法原位雜交Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成DNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救 互補(bǔ)的檢測原位雜交Southern印跡雞的肌球蛋白的克隆和檢出重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為 小 結(jié)分分離目的基因 切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩選重組體 重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA cDNA人工合成PC