分子生物學(xué)：第十一章基因治療

1、第十一章 基因治療 廣義的基因治療目前是指體細(xì)胞基因治療，即把具有防治潛能的外源基因（目的基因）通過(guò)合適載體，轉(zhuǎn)移到患者的有關(guān)器官組織的細(xì)胞中，從而達(dá)到治療疾病的目的。 基因治療方案的內(nèi)容，一般包括目的基因的選擇和制備、靶細(xì)胞的選擇、基因轉(zhuǎn)移、目的基因的表達(dá)調(diào)控、治療效果的評(píng)價(jià)等。基因治療的策略包括基因修正、基因修補(bǔ)、基因添加、基因替代、基因失活五大類(lèi)型。 第一節(jié) 基因治療的發(fā)展及研究概況 1967年，Nirenberg首先提出基因工程可用于人類(lèi)疾病治療的設(shè)想。 1981年Cline對(duì)2名重癥-地中海貧血患者進(jìn)行了基因治療，但未成功。 1990年9月，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院研究人員Fterch A

2、nderson和Michael Blease，將腺苷酰脫氨酶基因轉(zhuǎn)移到一個(gè)4歲小女孩的淋巴細(xì)胞內(nèi)。 第二節(jié) 基因診斷與基因治療 基因診斷(Gene diagnosis)又稱(chēng)DNA診斷或DNA探針技術(shù)或基因探針技術(shù)，是以探測(cè)基因的存在，分析基因的類(lèi)型和缺陷及其表達(dá)功能是否正常,從而達(dá)到診斷疾病的一種方法。 基因診斷的途徑和方法 基因診斷的主要途徑包括異常基因的直接檢測(cè)和間接檢測(cè)（基因連鎖分析）兩類(lèi)。 異?；蛞约靶蛄械闹苯訖z測(cè)： 1.異?；虻娜笔?、插入、重排,以及短串連重復(fù)順序的重復(fù)數(shù)量，在這些情況下，DNA的變化較大，?？捎肧outhern 印跡雜交方法或PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。(1)South

3、ern 印跡雜交用于基因探測(cè)的基本過(guò)程 Southern印跡雜交常用于探測(cè)DNA的限制性?xún)?nèi)切酶圖譜。通過(guò)檢測(cè)某個(gè)體特定基因及旁側(cè)區(qū)域限制性?xún)?nèi)切酶圖譜的變化，可判斷是否發(fā)生了明顯的DNA重排。具體方法圖示如下：組織或細(xì)胞 含已知基因的重組質(zhì)粒菌株 基因組DNA 質(zhì)粒DNA 限制酶酶解及電泳分離 限制酶酶解及電泳分離回收含已知基因的DNA片段 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或尼龍膜 標(biāo)記的探針 預(yù)雜交雜交 洗膜 放射自顯影 圖 用Southern 印跡雜交方法進(jìn)行基因診斷的基本步驟 （2） 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction PCR) 或稱(chēng)體外擴(kuò)增，是一個(gè)使用

4、兩個(gè)特異的寡聚核苷酸引物在體外酶促合成特異DNA順序的方法。 基本的PCR反應(yīng)體系包含：模板DNA、引物、DNA 聚合酶、 4 種dNTP、Mg+2和緩沖液。引物是根據(jù)需擴(kuò)增的DNA片段兩端的序列設(shè)計(jì)并人工合成的，分別位于DNA分子的兩條單鏈上，彼此方向相對(duì)。所用的Taq DNA聚合酶是熱穩(wěn)定的，即經(jīng)過(guò)反復(fù)加熱仍保持活性。 2. 點(diǎn)突變的檢測(cè) 在PCR方法問(wèn)世以前，檢測(cè)基因點(diǎn)突變以及少數(shù)核苷酸的缺失或插入，主要靠DNA順序測(cè)定，而進(jìn)行DNA測(cè)序的前提是獲得基因克隆，這對(duì)大量樣品的基因診斷幾乎是不可能的。在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的若干其它技術(shù)，有力地促進(jìn)了這些突變的檢測(cè)。下面介紹一些常用的方法。（1）

5、PCR和限制酶酶解 當(dāng)突變涉及到某個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)改變時(shí)，可對(duì)被測(cè)樣品PCR產(chǎn)物，用適當(dāng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切后進(jìn)行電泳分離，根據(jù)酶切片段長(zhǎng)度，判斷突變是否存在。（2）PCR產(chǎn)物的寡聚核苷酸探針雜交及反向雜交 對(duì)被測(cè)樣品PCR產(chǎn)物進(jìn)行等位基因特異的寡聚核苷酸探針雜交（allele-specific oligonucleotide hybridization，ASOH)，是檢測(cè)點(diǎn)突變最常用的方法，基本上適用于任何情況的點(diǎn)突變。 一般制備兩套點(diǎn)樣膜，分別與經(jīng)過(guò)標(biāo)記的具有正常順序和具有某突變順序的寡聚核苷酸探針雜交。與正常順序寡聚核苷酸探針而不與具有某突變順序的寡聚核苷酸探針雜交者判斷為不含某突變，

6、與具有某突變順序的寡聚核苷酸探針而不與正常順序寡聚核苷酸探針雜交者判斷為某突變的純合子，與兩種探針均雜交者判斷為某突變的雜合子。一個(gè)變更的方法是將具有不同突變的ASO探針固定在濾膜上進(jìn)行反向雜交， 通過(guò)標(biāo)記待測(cè)個(gè)體DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即可同時(shí)鑒定待測(cè)個(gè)體的基因突變狀況。 在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，使其中的一個(gè)引物涉及突變位置并使突變點(diǎn)正好處于引物的3末端。由于PCR過(guò)程中引物延伸是從引物3端開(kāi)始的，如3末端堿基與DNA模板互補(bǔ)，PCR正常進(jìn)行。得到特定長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段。如3末端堿基不與DNA模板互補(bǔ)，則不能得到特定長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段。53引物I引物II53引物I引物II引物II為3堿基特異引物（3）

7、等位基因特異的PCR （allele specific PCR, ASPCR）(又稱(chēng)3堿基特異PCR)這一方法是用含濃度遞增的變性劑（如尿素或甲醛或二者并用）的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行DNA片段的電泳分離。在某一變性劑濃度下，DNA的一個(gè)區(qū)域（結(jié)構(gòu)域）發(fā)生變性，局部雙螺旋解離成單鏈，遷移速度明顯下降。由于不同堿基順序的片段在不同部位發(fā)生變性，兩個(gè)具有相同長(zhǎng)度但具有不同堿基順序的DNA片段，可以彼此分開(kāi)。如果變性劑的梯度平緩，此技術(shù)的靈敏度足以將相差一個(gè)堿基對(duì)的DNA片段分開(kāi)。（4） 變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoreses, DGGE）（5）P

8、CR和單股構(gòu)象多態(tài)性(single stranded conformation polymorphism, SSCP) 分析 把 PCR后獲得的雙股DNA加熱變性后形成單鏈DNA，相同長(zhǎng)度的DNA單鏈由于堿基順序不同，它們?cè)谥行跃郾０纺z中可有不同的構(gòu)象而導(dǎo)致電泳速度的不同，這種現(xiàn)象稱(chēng)為單鏈構(gòu)象多態(tài)性。 PCR產(chǎn)物變性后經(jīng)由SSCP分析，可能有效的檢出DNA順序變異。不是所有的核苷酸序列改變都引起可檢測(cè)的單鏈構(gòu)象改變，因此SSCP方法并不能鑒別所有的突變。雙脫氧指紋法是將雙脫氧末端終止法與SSCP結(jié)合起來(lái)的分析技術(shù)。其方法是用一側(cè)引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙脫氧末端終止法測(cè)序反應(yīng)，用一個(gè)ddNT

9、P參入反應(yīng)，產(chǎn)生長(zhǎng)短不一的單鏈DNA ，然后進(jìn)行SSCP分析。可分別使用兩側(cè)的PCR引物，獲得一端平齊的長(zhǎng)度不等的DNA單鏈。DDF方法克服了SSCP分析時(shí)因DNA長(zhǎng)度影響SSCP顯示的困難，通過(guò)一種雙脫氧核苷酸產(chǎn)生異質(zhì)性的單鏈DNA，使其中長(zhǎng)度合適的DNA片段顯示SSCP改變。（6）PCR和雙脫氧指紋法(dideoxy finger printing, DDF)（7）PCR和核苷酸錯(cuò)配的化學(xué)裂解（chemical cleavage of nucleotide mismaches） 這一方法的原理與Maxam-Gilbert DNA化學(xué)裂解法測(cè)序基本一致。其步驟是把先PCR產(chǎn)物進(jìn)行32P末端標(biāo)

10、記，然后變性，再把僅一端帶有放射性標(biāo)記的單鏈DNA進(jìn)行12組堿基特異的裂解反應(yīng)（可根據(jù)測(cè)序時(shí)所用5組，G、（AG）、C、（CT）、AC 選擇）。例如，用硫酸二甲酯對(duì)G殘基進(jìn)行部分修飾后再用熱哌啶溶液處理，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影，可檢測(cè)是否發(fā)生了涉及G的突變 首先把PCR產(chǎn)物經(jīng)5末端標(biāo)記后，再變性成僅一端帶有同位素標(biāo)記的單股DNA，然后進(jìn)行后序步驟。 僅一端帶有同位素的單股DNA32P AC ACTGAACGTTCATGTCGA me32P ACACTGAACGTTCATGTCGA me32P ACACTGAACGTTCATGTCGA me32P ACACTGAACGTTCATG

11、TCGA me32P ACACT32P ACACTGAAC32P ACACTGAACGTTCAT32P ACACTGAACGTTCATGTC聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射性自顯影DMSO處理用熱哌啶溶液處理，使被修飾的G殘基脫落并使糖磷酸主鏈發(fā)生水解（8）PCR產(chǎn)物的測(cè)序 在獲得PCR產(chǎn)物后，可以直接測(cè)序或把PCR產(chǎn)物克隆到M13載體或質(zhì)粒載體（如T載體）上用末端終止法測(cè)序以判斷基因突變。 為了獲得更好的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果，有時(shí)采用所謂不對(duì)稱(chēng)PCR方法。即在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，把一個(gè)引物減少到常規(guī)用量的1/50左右（稱(chēng)為限制性引物）。這樣，在前十幾個(gè)循環(huán)中，擴(kuò)增合成一定量的雙股DNA，限制性引

12、物被逐漸耗盡。在后十幾個(gè)循環(huán)中，只有加入了常規(guī)量的那個(gè)引物與模板形成復(fù)合物并發(fā)生鏈延伸，只合成單股DNA，可以此單股DNA為模板用末端終止法測(cè)序。在一些情況下，直接檢測(cè)基因突變具有一定困難。如：1）某些遺傳病具有多種突變類(lèi)型；2）一些疾病相關(guān)基因只知在染色體上的位置，但未克隆分離，對(duì)基因結(jié)構(gòu)及導(dǎo)致疾病的分子機(jī)制尚不清楚；3）致病基因尚未確定。這時(shí)可用連鎖分析進(jìn)行間接的基因診斷。 連鎖是指一個(gè)基因（或一段DNA順序）與另一基因在同一染色體上并且位置接近，因此二者可在一起被遺傳，前者可作為后者的遺傳標(biāo)志。DNA多態(tài)性是進(jìn)行基因診斷和疾病相關(guān)基因定位時(shí)最常使用的遺傳標(biāo)志。 (二) 間接的基因診斷多態(tài)

13、性連鎖分析2.1 基因治療的概念 基因治療的最初含義是指遺傳病的基因替代治療，即將正常基因通過(guò)某種途徑轉(zhuǎn)入到由于該基因缺陷而患有某種遺傳病的患者體內(nèi)，從而達(dá)到治療該遺傳病的目的。 目前廣義的基因治療是指體細(xì)胞基因治療，即把具有防治潛能的外源基因（目的基因），通過(guò)合適載體轉(zhuǎn)移到患者的有關(guān)器官組織的細(xì)胞中，從而達(dá)到治療疾病的目的。 基因治療是一種治療和預(yù)防遺傳性疾病和多因素疾病的方法。遺傳病的基因治療是指通過(guò)遺傳工程手段，將正常基因（最好包括表達(dá)所需的調(diào)控順序）導(dǎo)入該基因有缺陷的遺傳病患者體內(nèi)，使導(dǎo)入基因發(fā)揮作用，或使缺陷基因能在原位得以校正或修復(fù)，從而糾正基因缺陷導(dǎo)致的各種異常表現(xiàn)。目前，基因治

14、療已經(jīng)擴(kuò)大到一些由遺傳因素和環(huán)境因素共同決定的疾病，如癌癥等的治療。如通過(guò)轉(zhuǎn)入與刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答相關(guān)的基因，或直接抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞相關(guān)的基因治療癌癥，通過(guò)轉(zhuǎn)入與某種疾病病因相關(guān)的功能基因治療該病等。（一）基因治療的概念(二）基因治療的必要條件開(kāi)展某種疾病的基因治療必須具備的必要條件為：1）對(duì)從DNA水平上的發(fā)病機(jī)制已經(jīng)清楚或至少有一定了解；2）要轉(zhuǎn)移的基因已經(jīng)克隆分離，對(duì)此基因及表達(dá)產(chǎn)物有詳盡的了解；3）該基因正常表達(dá)的組織可以在體外進(jìn)行遺傳操作，或者該基因能在其它可允許體外操作的組織內(nèi)表達(dá)。但是要實(shí)現(xiàn)較為理想的基因治療，還必須達(dá)到如下條件：1）外源基因可有效導(dǎo)入靶細(xì)胞；

15、2）外源基因能在靶細(xì)胞中長(zhǎng)期穩(wěn)定存留；3）導(dǎo)入基因能適量表達(dá)；4）導(dǎo)入基因的方法及所用載體對(duì)宿主細(xì)胞安全無(wú)害； 基因治療的基本條件1.用現(xiàn)行各種治療方法治療無(wú)效，或療效不佳。2.已經(jīng)在DNA水平上明確發(fā)病機(jī)理3.有關(guān)的基因已經(jīng)克隆4.該基因可在體外進(jìn)行操作5.只需低水平表達(dá)即可治愈或改善疾病6.表達(dá)水平不需嚴(yán)格控制年紀(jì)輕，體重小，有嚴(yán)重的癥狀，有少量相關(guān)蛋白，未產(chǎn)生該蛋白抗體，沒(méi)有其他任何嚴(yán)重疾病，自愿，能很好配合。 基因治療的療效考核與安全性基因治療第一例成功的報(bào)告基因治療實(shí)例重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID） 重癥聯(lián)合免疫缺陷（Severe combined immunodeficiency d

16、isease，簡(jiǎn)稱(chēng)SCID），患者缺乏正常人體免疫功能，其染色體上編碼腺苷酸脫氨酶（簡(jiǎn)稱(chēng)ADA）的基因發(fā)生突變所致。由于ADA是嘌呤代謝中的一種酶，該基因缺陷將導(dǎo)致患者身體細(xì)胞中脫氧腺苷的累積，達(dá)到高濃度時(shí)脫氧腺苷將對(duì)免疫系統(tǒng)細(xì)胞（如T-細(xì)胞和B-細(xì)胞）產(chǎn)生毒性。1990年，美國(guó)第一次對(duì)SCID病人作基因治療，其步驟為：1將正常ADA基因與反轉(zhuǎn)錄病毒載體相連，構(gòu)建重組病毒表達(dá)載體。2從患體體內(nèi)分離有免疫缺陷的T淋巴細(xì)胞。3用重組病毒感染體外培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞，使正常ADA基因插入到T淋巴細(xì)胞基因組中。4培養(yǎng)細(xì)胞并確認(rèn)該基因正常表達(dá)。5將含有正常基因的T淋巴細(xì)胞回輸?shù)交颊叩墓撬杞M織中。經(jīng)5-6個(gè)月

17、的基因治療，患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量恢復(fù)到正常水平，體內(nèi)ADA酶幾乎達(dá)到正常水平。免疫功能得到恢復(fù)。2.2 基因治療方案的內(nèi)容 基因治療試驗(yàn)研究的方案包括以下內(nèi)容:第一、進(jìn)行目的基因的制備,可通過(guò)人工合成、基因文庫(kù)分離及逆轉(zhuǎn)錄等方法獲得；第二、慎重地選擇靶細(xì)胞,要選擇那些容易獲得且生存期長(zhǎng),在體外轉(zhuǎn)染后能方便、安全地回輸體內(nèi)，并且在體內(nèi)易成活的靶細(xì)胞；第三、將目的基因?qū)氚屑?xì)胞是基因治療的重要步驟,主要通過(guò)生物和理化方法；第四、目的基因表達(dá)的調(diào)控,包括基因轉(zhuǎn)錄前的調(diào)整、轉(zhuǎn)錄、mRNA 的翻譯及蛋白產(chǎn)物的加工等復(fù)雜過(guò)程；第五、目的基因產(chǎn)物活性與表達(dá)量的鑒定，以判斷治療的效果。 基因治療過(guò)程的示意

18、圖 基因治療的類(lèi)型 1體細(xì)胞基因治療 是指把外源基因?qū)牖颊叩捏w細(xì)胞，以治療或預(yù)防基因接納者個(gè)人的疾病，只有特定的個(gè)體受益，但不能遺傳給后代。目前正在開(kāi)展的基因治療主要是體細(xì)胞基因治療。 2種系細(xì)胞的基因治療 種系細(xì)胞的基因治療是指在生殖細(xì)胞（精子、卵子或未分化的受精卵）中引入正?；蚧蛐迯?fù)缺陷基因以校正遺傳缺陷。如果正?；蚰苷系交蚪M，則引入的外源基因能遺傳給后代。與體細(xì)胞相比，利用種系細(xì)胞轉(zhuǎn)移基因的優(yōu)點(diǎn)是可以把目的基因轉(zhuǎn)移到機(jī)體的所有組織，包括精子和卵子，而被轉(zhuǎn)移基因可以遺傳給后代。但種系細(xì)胞的基因治療尚未在人類(lèi)中開(kāi)展，因?yàn)橐淖內(nèi)祟?lèi)生殖細(xì)胞涉及許多倫理學(xué)問(wèn)題。此外，在技術(shù)上也有很大的

19、困難，一是很難診斷有缺陷的受精卵，二是在生殖細(xì)胞中引入外源基因時(shí)存在引起新的插入突變的危險(xiǎn)。 體細(xì)胞基因治療的策略1.基因的取代或補(bǔ)償1) 取代 導(dǎo)入正常基因順序，替換突變基因順序，使缺陷基因在原位得以校正。使用的方法是同源重組（或叫基因打靶），對(duì)校正基因編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)的突變均適用。這是理想的基因治療，但在技術(shù)上極其困難，一是同源重組率極低，二是所獲得的被校正過(guò)的細(xì)胞可能因分化、死亡而消失。目前此策略的作用還很有限。 2) 補(bǔ)償 將目的基因?qū)胗谢蛉毕莸幕颊哌m當(dāng)?shù)募?xì)胞或組織中，以便為患者提供所缺少的正?；虮磉_(dá)產(chǎn)物。如是發(fā)病機(jī)制尚不清楚的多基因疾病，則是為患者提供可以糾正其表型的基因產(chǎn)物。它

20、適用于基因編碼區(qū)突變或調(diào)控區(qū)突變，也適用于多基因病的表型糾正和腫瘤、傳染病的免疫刺激治療。2. 導(dǎo)入外源基因以抑制或活化內(nèi)源基因表達(dá)1）抑制 導(dǎo)入外源基因的目的是為了降低有關(guān)內(nèi)源基因過(guò)高的表達(dá)水平，以使患者的病狀得以改善。2）活化 導(dǎo)入外源基因的目的在于提高內(nèi)源基因的表達(dá)水平，進(jìn)而達(dá)到治療目的。3導(dǎo)入寡聚核苷酸以抑制內(nèi)源基因 通過(guò)向體細(xì)胞內(nèi)注入寡聚核苷酸來(lái)控制內(nèi)源基因表達(dá)也已被認(rèn)為是一種較有希望的基因治療方法。目前主要見(jiàn)于腫瘤的基因治療研究。1) 反基因方法：注入與特定基因中做為模板轉(zhuǎn)錄合成mRNA的DNA鏈互補(bǔ)的寡聚核苷酸阻斷轉(zhuǎn)錄。2)反義方法：注入與特定mRNA互補(bǔ)的寡聚核苷酸阻斷翻譯。3

21、)注入特定的寡聚核苷酸：做為分子引誘物起作用以隔絕低濃度的轉(zhuǎn)錄因子或做為核酶（ribozyme）起作用切開(kāi)靶RNA。二基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)方法（一）轉(zhuǎn)染（transfection）1. 磷酸鈣共沉淀法 把供體DNA溶解在Hepes溶液中，然后緩慢加入Na2HPO4CaCl2溶液，供體DNA便被包裹在磷酸鈣溶液中，這種共沉淀可被細(xì)胞吞噬，外源基因便導(dǎo)入了受體細(xì)胞。2. DEAE-Dextran法 將DNA溶液溶解在TBS含Tris、K、Na等緩沖液中，與二乙胺乙基葡萄糖（DEAE-Dextran）混合，滴加到受體細(xì)胞表面，供體DNA便會(huì)進(jìn)入受體細(xì)胞。3. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 脂質(zhì)體是由磷脂、膽固醇或其它脂類(lèi)

22、形成的一種可以高效包裝DNA的人造單層膜。由于它的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與細(xì)胞膜極為相似，因而二者易于融合，DNA則由于細(xì)胞的內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞。4. 電穿孔法（electroporation） 將供體DNA與受體細(xì)胞混勻，在高壓電場(chǎng)作用下，給細(xì)胞一個(gè)電脈沖，引起受體細(xì)胞出現(xiàn)瞬間可逆性開(kāi)啟，外源DNA便乘機(jī)通過(guò)膜孔進(jìn)入細(xì)胞。5. 基因槍法 將DNA與人類(lèi)無(wú)明顯毒副作用而對(duì)DNA有良好吸附能力的微細(xì)金粒結(jié)合，在高壓電場(chǎng)的作用下，金粒以極高的速度帶入人體外的細(xì)胞內(nèi)或直接帶入人體內(nèi)。6. 超聲波法 超聲波可對(duì)細(xì)胞膜直接作用，使細(xì)胞膜的通透性增高，DNA 可通過(guò)擴(kuò)散作用進(jìn)入細(xì)胞。本法對(duì)于懸浮和貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞均適用

23、，并且超聲波可通過(guò)培養(yǎng)瓶瓶壁發(fā)揮作用。7. 受體介導(dǎo)法 此方法依賴(lài)于受體和配體間的特異結(jié)合所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用而將外源基因?qū)爰?xì)胞。一般是將DNA與多聚物（如多聚賴(lài)氨酸）結(jié)合而濃縮，在結(jié)合以一定的配體即可用于基因轉(zhuǎn)移。不過(guò)效果仍不理想。 (二) 微注射法 是指通過(guò)顯微鏡注射法把DNA注入細(xì)胞。此法比較適于生殖細(xì)胞的基因治療（如受精卵的注射）。雖然也可以注射到體外培養(yǎng)細(xì)胞，但在單位時(shí)間內(nèi)所能處理的細(xì)胞數(shù)非常有限，因此對(duì)需要大量細(xì)胞的體細(xì)胞基因治療工作不太適用。2.2.1 正?；虻倪x擇和制備 正?；?，即用于糾正靶細(xì)胞基因的外源性目的基因。 2.2.2 細(xì)胞因子基因 （一）干擾素基因 （二）白細(xì)

24、胞介素類(lèi)基因 （三）腫瘤壞死因子(TNFa) （四）粒細(xì)胞-集落刺激因子(GM CSF) 2.2.3 病毒基因 病毒基因的作用是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的抗原表達(dá),使腫瘤細(xì)胞膜表達(dá)某些病毒抗原，使腫瘤細(xì)胞更具“異己性”,從而加速腫瘤消退的免疫反應(yīng)。 2.2.4 抑癌基因 目前在抑癌基因中以Rb和p53在抗腫瘤基因治療中研究較多。 2.2.5 腫瘤藥物基因（一）腫瘤藥物敏感基因(又稱(chēng)藥敏自殺性基因)。（二）腫瘤藥物增敏基因。 （三）腫瘤藥物耐受基因。 2.2.6 主要組織相容性復(fù)合體(MHC)基因 該基因通過(guò)促進(jìn)腫瘤抗原表達(dá),提高機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫力來(lái)治療腫瘤。 2.3 靶細(xì)胞的選擇 基因治療的靶細(xì)胞可以是生

25、殖細(xì)胞也可以是體細(xì)胞。 在各種靶細(xì)胞中，造血干細(xì)胞是最受重視和最常用的靶細(xì)胞。 2.4 基因轉(zhuǎn)移 基因轉(zhuǎn)移方法可分為直接體內(nèi)法(in vivo) 和間接體內(nèi)法(ex vivo)。 基因轉(zhuǎn)移技術(shù)按載體又可分為四大類(lèi):病毒載體法非病毒性生物載體法非生物性載體法非載體法。 2.4.1 直接體內(nèi)法 直接體內(nèi)法是將外源基因直接導(dǎo)入人體內(nèi) 通過(guò)體內(nèi)（in vivo）基因轉(zhuǎn)移的途徑 體內(nèi)（又稱(chēng)直接體內(nèi)）基因轉(zhuǎn)移是一種將插入目的基因的表達(dá)載體稍加處理后就直接導(dǎo)入體內(nèi)的方法。皮膚、肌肉、肝、血流、肺等可能作為基因轉(zhuǎn)移的靶子位點(diǎn)。在上述基因轉(zhuǎn)移技術(shù)中，脂質(zhì)體法、基因槍法、受體介導(dǎo)法等均可應(yīng)用于直接體內(nèi)法。所用的D

26、NA材料可以是：1) 插入了目的基因的表達(dá)載體的裸露DNA，將其溶解于PBS，生理鹽水或高滲蔗糖中即可直接用于注射；2) 將DNA或RNA先與脂質(zhì)、多聚體或顆粒金等介質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物形式，再通過(guò)直接注射或用基因槍導(dǎo)入體內(nèi)；3)在一定的包裝細(xì)胞系中包裝好的復(fù)制缺陷型病毒顆粒。 此種方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、省時(shí)省力，能很快觀察到外源基因的表達(dá)及作用，因此人們樂(lè)于采納和應(yīng)用。但缺點(diǎn)和不足也很多，比如DNA在體內(nèi)不易進(jìn)入細(xì)胞，易被降解，以病毒顆粒的形式導(dǎo)入人體則易引起免疫反應(yīng)和被補(bǔ)體滅活。這些對(duì)外源基因的轉(zhuǎn)移效率和持續(xù)表達(dá)都是不利的。2.4.2 間接體內(nèi)法 間接體內(nèi)法是指先從病人身上取得靶細(xì)胞, 將外源基因在

27、體外轉(zhuǎn)染病人細(xì)胞后, 再將轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞輸回病人體內(nèi)。 通過(guò)回體（ex vivo）基因轉(zhuǎn)移的治療途徑 通過(guò)回體（又稱(chēng)間接體內(nèi)）基因轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞基因治療的基本途徑是：從個(gè)體供者中收集組織或細(xì)胞移植物，進(jìn)行組織培養(yǎng)以確立原始的細(xì)胞培養(yǎng)物；2) 把實(shí)驗(yàn)的治療基因或標(biāo)記基因轉(zhuǎn)移到這些細(xì)胞（上述基因轉(zhuǎn)移方法多可應(yīng)用）；3) 把轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞進(jìn)行選擇或富集培養(yǎng)幾天至23周；4) 自體移植這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或受試病人的靶器官。2.4.3 非載體間接體內(nèi)法 （1）體外電穿孔法 （2）顯微注射法 （3）磷酸鈣共沉淀法 （4）同源重組 2.4.4 病毒性載體轉(zhuǎn)移技術(shù) 人的外源基因包裝在缺陷型病毒中感染細(xì)胞，經(jīng)

28、培養(yǎng)后再輸入病人體內(nèi)進(jìn)行治療 （一） 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（Retrovirus，RV） （二）腺病毒載體（Adenovirus, AV） 病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 1反轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus, RV) 反轉(zhuǎn)錄病毒被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)基因治療最有希望的載體之一，其主要優(yōu)點(diǎn)是：基因轉(zhuǎn)移的效率高，細(xì)胞宿主范圍較廣泛，DNA整合效率高于其它病毒載體等。用于基因治療的反轉(zhuǎn)錄病毒載體是把源于莫洛尼氏小鼠白血病病毒（Mo-MLV）前病毒DNA經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)母脑觳⒉迦胭|(zhì)粒后構(gòu)建而成。這種改造原則上應(yīng)當(dāng)保留病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)順序（long terminal repeat, LTR）和病毒包裝時(shí)必須的順序（y），但基因組中編

29、碼組特異抗原（sequences encoding group-specific antigens, GAG）也即病毒內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白（internal structure proteins）的基因、編碼反轉(zhuǎn)錄酶（sequences encoding reverse transcriptase， POL）以及編碼病毒封皮蛋白（sequences encoding the envelope proteins ，ENV）的基因可以去除。 載體中可插入以治療或?qū)嶒?yàn)為目的的基因（最好帶有自己的調(diào)控順序）及藥物選擇基因（如能產(chǎn)生對(duì)新霉素抗性的氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因neo）。這樣的重組體在轉(zhuǎn)化普通細(xì)胞后并不

30、能產(chǎn)生病毒顆粒（因?yàn)橹荒墚a(chǎn)生病毒載體RNA而不能產(chǎn)生病毒蛋白），只有在轉(zhuǎn)染特定的反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系后才能產(chǎn)生病毒顆粒。包裝細(xì)胞系中已經(jīng)整合了經(jīng)過(guò)改造的反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒基因組（稱(chēng)為助病毒），最重要的改造是除去了病毒包裝所必須的y順序。包裝細(xì)胞對(duì)于反轉(zhuǎn)錄病毒載體的安全性和高效性至關(guān)重要。自從1983年麻省理工學(xué)院Mulligan研究組構(gòu)建第一個(gè)反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系-2以來(lái)，人們?cè)谠龃笾亟M反轉(zhuǎn)錄病毒宿主范圍、提高病毒滴度及降低產(chǎn)生有復(fù)制能力病毒危險(xiǎn)性等方面不斷改進(jìn)。概括地說(shuō)，反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系可分為以下三代。 包裝細(xì)胞第一代包裝細(xì)胞系以-2為代表，細(xì)胞中整合的莫洛尼氏白血病病毒（MLV）前病毒基

31、因組缺失了包裝信號(hào)，它能夠提供包裝蛋白，自身因缺乏了包裝信號(hào)而不能形成病毒顆粒。但是，在有外源性RV（具有包裝信號(hào)）感染的情況下，只要前者與包裝細(xì)胞中已整合的MLV基因組發(fā)生一次與包裝信號(hào)有關(guān)的重組，即可產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒，安全性較差。由于-2細(xì)胞是由缺失了包裝信號(hào)的單向性（ectropic）MLV前病毒基因組轉(zhuǎn)化而來(lái)，以此包裝細(xì)胞系包裝出來(lái)的病毒顆粒僅能感染小鼠及相近的嚙齒類(lèi)，因此在人類(lèi)的基因治療中受到限制。 第二代包裝細(xì)胞以PA317為代表。Miller等對(duì)雙向性（amphotropic）反轉(zhuǎn)錄病毒（Am-MLV）前病毒基因組進(jìn)行了改建，剪除了包裝信號(hào)、與前病毒形成有關(guān)的env終止密碼子

32、3端部分順序，及與前病毒整合有關(guān)的5LTR的5末端，3LTR區(qū)的部分順序由SV40的polyA信號(hào)順序取代，用改建的多病毒基因組轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞后得到了穩(wěn)定整合的pA317包裝細(xì)胞系。由于有了這些突變，pA317需與RV發(fā)生至少兩次重組后才可能產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒，安全性明顯好于-2。由PA317包裝的重組反轉(zhuǎn)錄病毒能感染鼠、兔、豬、犬、猴及人等廣泛宿主。 第三代包裝細(xì)胞由兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化而成， gag-pol和env分別由不同質(zhì)粒攜帶，均缺乏包裝信號(hào)，3LTR的部分順序均由SV40的polyA信號(hào)順序取代，因此包裝細(xì)胞中的前病毒基因組順序必須與RV間獨(dú)立地發(fā)生四次以上的重組才能產(chǎn)生有復(fù)制能力的重

33、組病毒，安全性進(jìn)一步提高。此代包裝細(xì)胞系有- CRE、-CRIP、GPE86、GPam12以及幾種人源性的RV包裝細(xì)胞系，即以293細(xì)胞為基礎(chǔ)的雙嗜性包裝細(xì)胞系stable human(293)based amphotropic packaging cell lineUSVg、Kat等。 重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體在轉(zhuǎn)染反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞后可獲得重組病毒顆粒（圖），用于感染靶細(xì)胞或組織，達(dá)到轉(zhuǎn)移基因的目的。 運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行基因治療也存在許多缺點(diǎn)，如只能感染處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞，載體容量?。?kb），目的基因在未分化的細(xì)胞中常丟失等。此外轉(zhuǎn)移基因的隨機(jī)整合也可能有導(dǎo)致癌基因活化以及功能基因失活的潛

34、在危險(xiǎn)。2腺病毒(Adenovirus, AV) 腺病毒載體也是近幾年發(fā)展較快應(yīng)用較廣泛的病毒載體之一，其原因之一是AV比較安全，它在進(jìn)入細(xì)胞后不能整合到染色體上，因此沒(méi)有激活原癌基因和使功能基因失活的危險(xiǎn)。AV的另一重要優(yōu)點(diǎn)是其不需要宿主細(xì)胞的分裂增殖就能進(jìn)入細(xì)胞，這一特性允許它可在分化的以及有最低（或無(wú)）分裂能力的細(xì)胞中進(jìn)行感染并使轉(zhuǎn)基因得以表達(dá)。 AV載體的缺點(diǎn)是其免疫原性較強(qiáng)，易受機(jī)體免疫系統(tǒng)的中和作用而失活，不能整合到宿主細(xì)胞基因組也使得外源基因表達(dá)持續(xù)的時(shí)間很有限，AV載體插入外源DNA的能力也有限（7kb）。在缺乏AV的情況下，AAV顯示出一種潛伏的感染圖案，當(dāng)用AAV和AV共感

35、染時(shí)，導(dǎo)致裂解感染，產(chǎn)生AAV粒子。潛伏的AAV感染已被證明對(duì)在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA到各種細(xì)胞型（無(wú)論分裂的和未分裂的細(xì)胞）都是有效的。AAV的一個(gè)重要特性是其基因組整合到人基因組中時(shí)具有高度特異性，在人染色體19q13.4-ter部位有一個(gè)單一的整合位點(diǎn)。這一發(fā)現(xiàn)說(shuō)明，AAV載體在人類(lèi)基因治療中可能被使用來(lái)進(jìn)行位點(diǎn)特異的整合?？梢哉f(shuō)AAV具有AV基因轉(zhuǎn)移的高效性和RV基因表達(dá)的持續(xù)性，而且減少了RV隨機(jī)整合可能導(dǎo)致的危險(xiǎn), 因此在基因治療研究中的應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣泛。AAV的缺點(diǎn)是其轉(zhuǎn)基因的裝載能力。完全的病毒基因組僅有4.7 kb DNA， 插入外源DNA的長(zhǎng)度自然也非常有限。（三）腺相關(guān)病毒載體(

36、Adeno-associated Virus, AAV)圖：腺病毒相關(guān)病毒載體系統(tǒng) HSV是嗜神經(jīng)組織的，有把基因轉(zhuǎn)移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的潛能，可能會(huì)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療中發(fā)揮作用，因而受到人們重視。 HSV基因組是長(zhǎng)152kb的雙股DNA分子。此病毒融合到神經(jīng)元的膜上并被轉(zhuǎn)運(yùn)到核。復(fù)制周期由潛伏期和裂解期組成。在潛伏期，病毒基因組被壓縮并且至少兩個(gè)潛伏相關(guān)的啟動(dòng)子（latency-associated promoters, LAPs）被活化。在裂解期，病毒被復(fù)制并產(chǎn)生病毒粒子。 （四）單純皰疹病毒載體（Herpes Simplex Virus, HSV） HSV基因組中約30 kb的DNA可

37、被外源DNA替代而不顯著影響復(fù)制、包裝和感染活力。 因此估計(jì)外源基因的最大插入為20kb或略長(zhǎng)些）。但HSV基因組較大的尺寸使得它較難進(jìn)行遺傳操作。 HSV載體不能整合到宿主細(xì)胞基因組，因此表達(dá)持續(xù)的時(shí)間有一定限度。 此外，HSV基因組中包含大量功能基因，在基因治療中使用重組HSV載體的安全水平尚待進(jìn)一步觀察。5痘病毒（Poxvirus, PV） 痘病毒在人類(lèi)歷史上已經(jīng)廣泛應(yīng)用，因此使用痘病毒做為基因轉(zhuǎn)移載體的安全性是勿容置疑的。痘病毒基因組DNA長(zhǎng)達(dá)186 kb, 推測(cè)外源基因的容量可達(dá)30 kb。痘病毒可感染非分裂的細(xì)胞，因此可適用的細(xì)胞型比較廣泛。其缺點(diǎn)是不能整合入細(xì)胞基因組，故外源基因

38、表達(dá)的時(shí)間不能持久，載體過(guò)大，受免疫系統(tǒng)的影響也較大。近年來(lái)出現(xiàn)了更多的病毒載體,如桿狀病毒、EBV、牛痘病毒、VSV 和CMV 等。 腺病毒多賴(lài)氨酸DNA復(fù)合體 2.4.5 非病毒性生物載體 （1）線粒體DNA （2）哺乳動(dòng)物人工染色體（mammalian artificial chromosome, MAC) （3）人類(lèi)人工染色體(human artificial chromosome, HAC) （4）人類(lèi)天然小染色體(human micro chromosome, HMC) 2.5 目的基因的表達(dá)調(diào)控 2.5.1 組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控2.5.2 誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控2.5.3 增強(qiáng)子、靜

39、息子 2.5.4 反式激活效應(yīng) 第三節(jié) 基因治療的策略 3.1 基因修正（Gene correction） 是正常外源基因瞄準(zhǔn)缺陷基因，通過(guò)同源重組，特異性原位修復(fù)基因缺陷，而對(duì)靶基因組不加任何改變。這是一種理想的基因治療方法，但由于技術(shù)困難，重組率低（10-510-7）而應(yīng)用受限。 3.2 基因修補(bǔ)（Gene augmentation） 也稱(chēng)基因增加或追加，是目前應(yīng)用最多的一種可行方案。將正常外源基因?qū)氚屑?xì)胞。如酶類(lèi)、具有治療意義的生物活性物質(zhì)基因，以彌補(bǔ)體內(nèi)缺陷的基因成分或其表達(dá)。 3.3 基因替換（Gene replacement） 用正常的基因原位替換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的

40、DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)。這種治療方法最為理想，但目前由于技術(shù)原因尚難達(dá)到。 3.4 基因失活（Gene inactivation） 利用反義技術(shù)能特異性地封閉基因表達(dá)，抑制一些有害基因的表達(dá)，達(dá)到治療疾病的目的。如利用反義RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化。用此技術(shù)還可封閉腫瘤細(xì)胞的耐藥基因的表達(dá)，增加化療效果。 3.5 基因添加根據(jù)治療的需要，可以向靶細(xì)胞輸入原本沒(méi)有的基因類(lèi)型，改變靶細(xì)胞的細(xì)胞識(shí)別，或改變細(xì)胞內(nèi)代謝途徑，或通過(guò)產(chǎn)物調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平等等。 3.6 基因治療的分子機(jī)理 3.6.1 免疫調(diào)節(jié)（Immune adjustment）

41、3.6.2 RNA干擾（RNA Interference，RNAi） 3.7 基因藥物靶向治療 基因藥物是指利用基因序列數(shù)據(jù)，經(jīng)生物信息學(xué)分析、高通量基因表達(dá)、高通量功能篩選和體內(nèi)外藥效研究開(kāi)發(fā)得到新藥候選物。 3.7.1 基因疫苗 基因疫苗是指用編碼抗原的基因制成的疫苗。利用基因槍將基因疫苗直接給機(jī)體接種后可在機(jī)體內(nèi)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)作為抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異的免疫反應(yīng)，使機(jī)體獲得對(duì)該抗原的免疫力。 3.7.2 反義RNA 藥物 反義RNA（antisense RNA）是一類(lèi)能與特異mRNA互補(bǔ)的小分子量、可擴(kuò)散的DNA轉(zhuǎn)錄物，它能夠從翻譯水平、轉(zhuǎn)錄水平和核酸復(fù)制水平上高度特異地抑制靶基因表達(dá)。 3.7.3 三鏈DNA 藥物 脫氧寡核苷酸能與雙螺旋dsDNA專(zhuān)一性序列結(jié)合，形成三鏈DNA，來(lái)阻止基因轉(zhuǎn)錄或DNA復(fù)制，此脫氧寡核苷酸被稱(chēng)