無(wú)菌工藝驗(yàn)證-培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)的培訓(xùn)講義

1、為什么需要 進(jìn)行培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)？1來(lái)自生產(chǎn)工藝的要求對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行最終滅菌，是降卑微生物污染風(fēng)險(xiǎn)的常用方法。但有大量藥品不適用于最終滅菌而只能采用無(wú)菌生產(chǎn)工藝方法。無(wú)菌生產(chǎn)工藝是制藥領(lǐng)域中最難的工藝之一，確保產(chǎn)品無(wú)菌是該工藝最大的難點(diǎn)。減少無(wú)菌工藝藥品污染風(fēng)險(xiǎn)的兩項(xiàng)重要措施人員培訓(xùn)無(wú)菌工藝驗(yàn)證2最終滅菌工藝與無(wú)菌生產(chǎn)工藝的差異最終滅菌工藝在高潔凈凈環(huán)境下進(jìn)行灌裝和密封通常，產(chǎn)品、容器和密封件的微生物污染水平很低在密封容器中進(jìn)行最終滅菌無(wú)菌生產(chǎn)工藝產(chǎn)品、容器和密封件分別進(jìn)行滅菌，然后進(jìn)行灌封在極高潔凈環(huán)境下進(jìn)行灌裝和密封產(chǎn)品在最終容器中不再做進(jìn)一步的滅菌處理對(duì)各個(gè)組成局部的滅菌工藝需要進(jìn)行嚴(yán)格驗(yàn)證和

2、監(jiān)控在灌封前和灌封過(guò)程中的操作會(huì)帶來(lái)污染風(fēng)險(xiǎn)空瓶滅菌隧道密封件蒸汽滅菌釜除菌過(guò)濾人員半壓塞瓶?jī)龈蓹C(jī)全壓塞瓶3來(lái)自FDA和USP的要求FDA CGMP 無(wú)菌工藝藥品指南2004年版 An aseptic processing operation should be validated using a microbiological growth medium in place of the product. This process simulation, also known as a media fill. USP 31 潔凈室和其它控制環(huán)境的微生物學(xué)評(píng)價(jià) To assure that mi

3、nimal bioburden is achieved, additional information on the evaluation of the microbiological status of the controlled environment can be obtained by the use of media fills. An acceptable media fill shows that a successful simulated product run can be conducted on the manufacturing line at that point

4、 in time.4來(lái)自EU GMP和國(guó)內(nèi)的要求EU GMP 附件1 無(wú)菌藥品的生產(chǎn)2021年2月新版 Validation of aseptic processing should include a process simulation test using a nutrient medium (media fill).中國(guó)藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)附錄1998年修訂SFDA 化學(xué)藥品注射劑根本技術(shù)要求試行 培養(yǎng)基灌裝驗(yàn)證是對(duì)設(shè)備、環(huán)境以及人員操作的一種系統(tǒng)驗(yàn)證,是判斷無(wú)菌保證水平的關(guān)鍵手段 采用無(wú)菌生產(chǎn)工藝的粉針劑，應(yīng)能保證SAL不大于10-3 5無(wú)菌工藝產(chǎn)品的無(wú)菌保證 無(wú)菌工藝產(chǎn)品Perso

5、nnelEnvironment工藝驗(yàn)證人員原料環(huán)境無(wú)菌檢驗(yàn)6作業(yè)環(huán)節(jié)與風(fēng)險(xiǎn)作業(yè)環(huán)節(jié)驗(yàn)證難易度人員依賴程度相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)滅菌易低低房間設(shè)計(jì)N/AN/A中等環(huán)境監(jiān)測(cè)中等可變高消毒難高高更衣難很高很高物品轉(zhuǎn)移難高高無(wú)菌技術(shù)（灌封）難很高很高無(wú)菌裝配難很高很高7培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)的 常規(guī)要求8定義與目的 目的證明生產(chǎn)線采用無(wú)菌工藝生產(chǎn)無(wú)菌產(chǎn)品的能力對(duì)人員進(jìn)行資格確認(rèn)符合cGMP的要求使用培養(yǎng)基模擬藥品進(jìn)行無(wú)菌灌封，對(duì)無(wú)菌工藝進(jìn)行驗(yàn)證。又稱為“工藝模擬試驗(yàn).9工藝模擬試驗(yàn)的通常流程將培養(yǎng)基暴露于設(shè)備、容器膠塞密封系統(tǒng)的外表和關(guān)鍵環(huán)境條件中，并模擬實(shí)際生產(chǎn)完成工藝操作。對(duì)裝有培養(yǎng)基的密閉容器進(jìn)行培養(yǎng)以檢查微生物的生

6、長(zhǎng)。評(píng)價(jià)結(jié)果，確定實(shí)際生產(chǎn)中如灌裝前的調(diào)試、參加無(wú)菌原輔材料、無(wú)菌連接、灌裝和密封產(chǎn)品污染的可能性。 10培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)的時(shí)機(jī) 初始驗(yàn)證與再驗(yàn)證初始驗(yàn)證需要重復(fù)屢次，以確保結(jié)果的一致性和有效性。有差異的屢次實(shí)驗(yàn)結(jié)果工藝過(guò)程失控的象征定期再驗(yàn)證定期進(jìn)行，評(píng)估無(wú)菌工藝的受控情況。應(yīng)綜合考慮每一班次及班次變化過(guò)程中有代表性的活動(dòng)及干預(yù)。對(duì)人員的資格再確認(rèn)應(yīng)納入到定期再驗(yàn)證中。11培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)的時(shí)機(jī) 增補(bǔ)性培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)變更及其評(píng)估對(duì)產(chǎn)品或生產(chǎn)線的每一種變更，均應(yīng)根據(jù)書面的變更控制系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估 。如果通過(guò)評(píng)估認(rèn)為此項(xiàng)變更會(huì)影響到無(wú)菌生產(chǎn)工藝產(chǎn)品的無(wú)菌保證水平，那么需要進(jìn)行增補(bǔ)性培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)。比方，

7、設(shè)施或設(shè)備的變化、生產(chǎn)線配置的變動(dòng)、人員重要變動(dòng)、環(huán)境監(jiān)控結(jié)果異常、容器-膠塞系統(tǒng)變更、停車時(shí)間延長(zhǎng)、無(wú)菌檢查結(jié)果陽(yáng)性等。12實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度的選擇選擇時(shí)的本卷須知適應(yīng)廣譜微生物生長(zhǎng)，包括細(xì)菌和真菌較好的澄明度，較小的粘度易于除菌過(guò)濾常用培養(yǎng)基：3大豆胰蛋白肉湯TSB厭氧培養(yǎng)基僅在特殊情況下使用培養(yǎng)溫度FDA - 20-35，目標(biāo)值2.5，不少于14天；如選擇兩個(gè)溫度，那么每一溫度下至少培養(yǎng)7天，從低溫開始。PIC - 20-25下至少14天，或，先20-25下7天， 然后30-35下7天。13灌裝體積與數(shù)量灌裝體積每只容器的灌裝體積不少于總?cè)莘e的1/3同樣，灌裝體積也不宜過(guò)大既要考慮到

8、瓶倒轉(zhuǎn)或旋轉(zhuǎn)時(shí)，培養(yǎng)基能充分接觸到容器和密封件的內(nèi)外表，又要保證容器內(nèi)有足夠的氧氣支持微生物生長(zhǎng)。灌封數(shù)量綜合考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)要求和實(shí)際生產(chǎn)批量。FDA (5000瓶)：如果正常生產(chǎn)的批次量低于5000瓶，那么培養(yǎng)基灌封至少應(yīng)為實(shí)際生產(chǎn)線的最大批次量。PIC (3000瓶)：如果正常生產(chǎn)的批次量低于3000瓶，那么培養(yǎng)基灌封至少應(yīng)為實(shí)際生產(chǎn)線的最大批次量。14灌封時(shí)間與批次量控制灌裝時(shí)間對(duì)于初始性驗(yàn)證，培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)應(yīng)安排在一周內(nèi)的不同時(shí)間進(jìn)行。對(duì)于再驗(yàn)證，可選擇在一周結(jié)束或其它最差條件下進(jìn)行。灌封時(shí)間要涵蓋實(shí)際生產(chǎn)班次。批次量控制初次驗(yàn)證，至少要連續(xù)成功灌封3個(gè)批次。再驗(yàn)證至少需要成功灌封1個(gè)批次

9、。15培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)的合格標(biāo)準(zhǔn)FDA指南2004版與EU GMP 附件1標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一灌封量10000瓶時(shí)，假設(shè)有1瓶污染，需徹底調(diào)查；假設(shè)有兩瓶污染，必須進(jìn)行徹底調(diào)查，并重新驗(yàn)證3批。注：歐盟標(biāo)準(zhǔn)將自2021年3月起執(zhí)行。16培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)的合格標(biāo)準(zhǔn)2021年3月以前歐盟通用標(biāo)準(zhǔn)：污染率低于0.1%計(jì)算公式：實(shí)際污染率 = (95%置信限值)/(灌封容器數(shù)) 100%污染瓶數(shù)與95%置信限值間的關(guān)系污染瓶數(shù)01234567891095%置信限值34.746.37.759.1510.5111.8413.1514.4315.7116.9617培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)的合格標(biāo)準(zhǔn)SFDA 化學(xué)藥品注射劑根本技術(shù)要求

10、試行培養(yǎng)基灌裝試驗(yàn)的批量與判斷合格的標(biāo)準(zhǔn)批量（瓶）3000475063007760允許污染的數(shù)量（瓶）0 1 2 318不同劑型的特殊要求19凍干制劑對(duì)培養(yǎng)基灌封的要求凍干制劑的典型生產(chǎn)流程配制灌裝凍干加塞軋蓋第一種方式，模擬裝載/卸載過(guò)程，縮短放置時(shí)間首選容器內(nèi)灌封好培養(yǎng)基，以半壓塞狀態(tài)裝入凍干機(jī)凍干機(jī)內(nèi)局部抽真空500mbar，在室溫放置一定的時(shí)間，不得冷凍。用無(wú)菌空氣破真空不使用惰性氣體，全壓塞軋蓋注意，假設(shè)所使用的容器透明度不高，應(yīng)將內(nèi)容物倒出進(jìn)行檢查。凍干制劑培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)的特殊性對(duì)產(chǎn)品在凍干機(jī)內(nèi)放置步驟的模擬20凍干制劑對(duì)培養(yǎng)基灌封的要求第二種方式，模擬凍干時(shí)間半壓塞產(chǎn)品在凍干機(jī)腔

11、室內(nèi)的放置時(shí)間同于正常工藝。缺點(diǎn)：耗時(shí)長(zhǎng)第三種方式，以經(jīng)稀釋的培養(yǎng)基模擬凍干過(guò)程容器內(nèi)灌封好經(jīng)稀釋的培養(yǎng)基diluted medium，以半壓塞狀態(tài)裝入凍干機(jī)模擬凍干過(guò)程，直到容器內(nèi)的培養(yǎng)基大致到達(dá)正常濃度f(wàn)ull strength為止。缺點(diǎn)：耗時(shí)長(zhǎng)，需開發(fā)特殊的凍干程序，營(yíng)養(yǎng)支持性不均一，影響微生物的存活力。21粉針劑對(duì)培養(yǎng)基灌封的要求第一種方法在灌裝線上直接灌裝液體培養(yǎng)基，灌裝后壓塞-軋蓋或熔封。第二種方法先灌裝干粉培養(yǎng)基，再參加注射用水第三種方法先灌裝惰性劑，再參加液體培養(yǎng)基要點(diǎn)采用第二、三種方法時(shí)，所用惰性劑或干粉培養(yǎng)基需事先經(jīng)過(guò)輻射滅菌。常用惰性劑有聚乙二醇8000、羧甲基纖維素、乳

12、糖。22混懸劑/半固體制劑對(duì)培養(yǎng)基灌封的要求懸浮劑需要模擬攪拌或循環(huán)流動(dòng)的過(guò)程。如果有無(wú)菌添加過(guò)程，也應(yīng)進(jìn)行模擬。半固體制劑需要將液體培養(yǎng)基增稠到適當(dāng)粘度?？蛇x用瓊脂或羧甲基纖維素作為增稠劑，也可選用其它試劑，但要證明其沒(méi)有抑制細(xì)菌或真菌的作用。在培養(yǎng)結(jié)束后，需將培養(yǎng)基從塑料或金屬管中擠出檢查其混濁度和真菌菌落，也可進(jìn)行無(wú)菌檢查實(shí)驗(yàn)。如果選擇顯色培養(yǎng)基遇到污染物變色的方法，那么需要對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。23方案與報(bào)告24制訂培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)方案的考慮因素一生產(chǎn)線最長(zhǎng)運(yùn)行時(shí)間及其造成的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)干預(yù)的次數(shù)、類型和復(fù)雜程度是否有凍干工序設(shè)備的無(wú)菌裝配總?cè)藬?shù)和所從事的操作無(wú)菌參加和無(wú)菌轉(zhuǎn)移的次數(shù)班次更換、暫停和

13、必要的更衣無(wú)菌設(shè)備的拆卸與連接環(huán)境監(jiān)測(cè)25制訂培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)方案的考慮因素二生產(chǎn)線的配置和運(yùn)行速度產(chǎn)品重量檢查容器/密封系統(tǒng)與無(wú)菌操作相關(guān)的各種特殊規(guī)定總?cè)藬?shù)和所從事的操作總的原那么綜合考慮生產(chǎn)線可能造成污染的各種因素 盡可能模擬實(shí)際生產(chǎn)的無(wú)菌操作 可能時(shí)，應(yīng)包括最差條件的模擬測(cè)試26驗(yàn)證開始前的準(zhǔn)備工作設(shè)備確認(rèn)通風(fēng)系統(tǒng)HVAC確實(shí)認(rèn)設(shè)備的在線清洗和滅菌CIP,SIP滅除菌工藝驗(yàn)證濕熱、干熱滅菌工藝除菌過(guò)濾空氣過(guò)濾器的完好性檢測(cè)容器/膠塞密封完好性測(cè)試人員培訓(xùn)潔凈室環(huán)境到達(dá)設(shè)計(jì)要求27培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)方案的內(nèi)容舉例定義被模擬的工藝定義使用的房間，灌封線和設(shè)備使用的容器和密封件的類型灌裝線的速度灌

14、封數(shù)量模擬過(guò)程中的干擾和中斷的數(shù)目和類型參與的人員數(shù)目使用的培養(yǎng)基灌封到容器內(nèi)培養(yǎng)基的體積選擇的最差條件及其原理培養(yǎng)條件，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時(shí)間所進(jìn)行的環(huán)境監(jiān)測(cè)批記錄復(fù)印件職責(zé)說(shuō)明所有工作的合格標(biāo)準(zhǔn)列舉最終報(bào)告中需要的文件本次模擬的持續(xù)時(shí)間28方案的執(zhí)行與記錄一培養(yǎng)基灌封的日期和時(shí)間使用的房間和設(shè)備容器膠塞的型號(hào)和尺寸培養(yǎng)基種類和滅菌方式每容器中的灌裝體積灌裝速度灌封的瓶數(shù)，燈檢丟棄的瓶數(shù)和原因培養(yǎng)的瓶數(shù)，陽(yáng)性的數(shù)量培養(yǎng)時(shí)間和溫度29方案的執(zhí)行與記錄二環(huán)境監(jiān)測(cè)的數(shù)據(jù)參與培養(yǎng)基灌封的人員培養(yǎng)基靈敏度檢查的結(jié)果有無(wú)陽(yáng)性結(jié)果。如有，要給出微生物鑒定的結(jié)果。如發(fā)生異常情況，需給出調(diào)查報(bào)告。30培養(yǎng)基灌封實(shí)

15、驗(yàn)中的環(huán)境監(jiān)測(cè)環(huán)境監(jiān)測(cè)按照相應(yīng)的規(guī)程進(jìn)行，包括：空氣粒子數(shù)沉降碟浮游菌外表監(jiān)測(cè)人員監(jiān)測(cè)對(duì)無(wú)菌生產(chǎn)區(qū)環(huán)境的評(píng)估31培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)中的靈敏度檢查實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基靈敏度檢查實(shí)驗(yàn)： 使用完成14天培養(yǎng)的灌封前期培養(yǎng)基樣品用枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠球菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉和環(huán)境菌作為陽(yáng)性菌將每個(gè)菌種準(zhǔn)備含100cfu/0.1ml的菌液，每個(gè)菌種接種2支培養(yǎng)基樣品，同時(shí)并平板計(jì)數(shù)雙份對(duì)真菌在20-25C下培養(yǎng)，對(duì)細(xì)菌在30-35 C下培養(yǎng)，每天檢查，5天內(nèi)需有生長(zhǎng)跡象32再驗(yàn)證與增補(bǔ)性驗(yàn)證的要求再驗(yàn)證對(duì)每條生產(chǎn)線，每年進(jìn)行兩次再驗(yàn)證，間隔時(shí)間為5-7個(gè)月 。人員至少每年參加一次再驗(yàn)證，以進(jìn)行資格

16、再確認(rèn)。每條生產(chǎn)線輪流使用最大和最小規(guī)格的容器，變換生產(chǎn)線的速度。增補(bǔ)性驗(yàn)證根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)程度決定培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)的批數(shù)。通常為1-3批。33培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)的總結(jié)報(bào)告最終報(bào)告中應(yīng)包括以下內(nèi)容模擬的最差條件事件清單環(huán)境監(jiān)測(cè)結(jié)果微生物鑒別結(jié)果培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果培養(yǎng)條件、結(jié)果讀取日、結(jié)果讀取人、每位參與者的灌裝瓶數(shù)等信息。結(jié)論結(jié)果是否可以接受合格證書工藝驗(yàn)證/再驗(yàn)證合格證書人員資格確認(rèn)證書34難點(diǎn)討論35培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的調(diào)查 (一)調(diào)查的范圍應(yīng)包括環(huán)境微生物監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，空氣懸浮粒子監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)CIP設(shè)備，清潔、消毒程序的執(zhí)行情況培養(yǎng)基、設(shè)備和零件的滅菌工藝，滅菌釜的校正情況高效過(guò)濾器檢測(cè) (空氣懸浮

17、粒子水平，過(guò)濾器檢漏，風(fēng)速測(cè)量，密封系統(tǒng)檢查，使用年限等)除菌過(guò)濾器完好性房間氣流型式與壓差人員操作技術(shù)培訓(xùn)情況36培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的調(diào)查 (二)調(diào)查的范圍還應(yīng)包括以往產(chǎn)品無(wú)菌檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果人員衛(wèi)生狀況監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)培養(yǎng)基灌裝實(shí)驗(yàn)中的干預(yù)方式分析該區(qū)域近期是否有過(guò)維修活動(dòng)，生產(chǎn)線的改造情況該生產(chǎn)線培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)歷史數(shù)據(jù)已滅菌物品的儲(chǔ)存條件培養(yǎng)基灌封過(guò)程中的異常事件陽(yáng)性污染菌與環(huán)境監(jiān)測(cè)污染菌的鑒別37培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的調(diào)查 (三)調(diào)查結(jié)論與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效暫停生產(chǎn)，直至確定污染來(lái)源并采取有效的糾偏措施。再驗(yàn)證合格后，產(chǎn)品方可放行。對(duì)培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)后和此前所生產(chǎn)的產(chǎn)品，進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)

18、估培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效重新進(jìn)行培養(yǎng)基灌封實(shí)驗(yàn)條件1無(wú)菌灌裝區(qū)的物理?xiàng)l件不滿足要求條件2人員未按照正常生產(chǎn)程序操作38培養(yǎng)基灌封后的生產(chǎn)培養(yǎng)基灌封后可以進(jìn)行生產(chǎn)，但要等培養(yǎng)基灌封合格后產(chǎn)品才能放行產(chǎn)品有報(bào)廢的風(fēng)險(xiǎn)。無(wú)效的培養(yǎng)基灌封后可以進(jìn)行生產(chǎn)，但所生產(chǎn)的批次要在成功培養(yǎng)基灌封前方可放行。培養(yǎng)基灌封失敗 生產(chǎn)線不能用來(lái)生產(chǎn)，根據(jù)調(diào)查結(jié)果斷定培養(yǎng)基灌封的次數(shù)和數(shù)量，培養(yǎng)基灌封合格后，才能生產(chǎn)。39討論：最差條件 Worst Case最差條件高于或低于正常范圍的條件限度，與正常生產(chǎn)條件相比最有可能造成工藝或生產(chǎn)失敗的條件。注意如果某些做法會(huì)帶來(lái)污染的風(fēng)險(xiǎn)，那么不允許用培養(yǎng)基灌封的結(jié)果為它的不合理的進(jìn)行辯護(hù) 40最差條件的設(shè)計(jì)1儲(chǔ)存時(shí)間Holding time灌封設(shè)備、灌封部件、儲(chǔ)罐、無(wú)菌物料、藥液在實(shí)際灌封前能夠放置的最長(zhǎng)時(shí)間1. 灌封設(shè)備、灌封部件、儲(chǔ)罐、無(wú)菌物料需要再滅菌除菌的時(shí)間間隔Worst case: 用超出保存時(shí)間的灌封設(shè)備、灌封部件、儲(chǔ)罐、無(wú)菌物料參與培養(yǎng)基灌封2. 產(chǎn)品從無(wú)菌過(guò)濾到灌封加塞完成所需要的時(shí)間Worst case：無(wú)菌過(guò)濾后存放在儲(chǔ)罐內(nèi)的培養(yǎng)基模擬實(shí)際生產(chǎn)時(shí)產(chǎn)品的最大儲(chǔ)存時(shí)間后