獸藥殘留量檢驗要點

1、獸藥殘留量檢驗要點4.1 獸藥與獸藥殘留研究背景、獸藥殘留產(chǎn)生的原因、類型、危害4.2 水產(chǎn)品中氯霉素的檢驗對蝦中氯霉素含量的競爭性ELISA法檢測4.3 豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗 豬組織中鹽酸克倫特羅的GS/MS法檢測、豬組織中鹽酸克倫特羅的ELISA法檢測 第四章 獸藥殘留量的檢驗 內容要點： 獸藥：預防和治療畜禽疾病的藥物；促進生長、提高生產(chǎn)性能、改善動物性食品的品質；也包括一些化學的、生物的動物保健品或飼料添加劑。 現(xiàn)代化的動物集中飼養(yǎng)，經(jīng)常需要使用抗生素或其他藥物來控制可能爆發(fā)的疾病，同時有效使用獸藥可以在很大程度上提高動物對飼料的利用率。4.1 獸藥與獸藥殘留1、研究背景1、研究

2、背景 獸藥的使用極易造成動物源食品中有害物質的殘留，特別是由于養(yǎng)殖人員對科學知識的缺乏以及一味地追求經(jīng)濟利益，致使濫用獸藥現(xiàn)象在畜牧業(yè)中普遍存在。 獸藥殘留：“獸藥在動物源食品中的殘留的簡稱，是指動物產(chǎn)品的任何可食局部所含獸藥的母體化合物及或其代謝物，以及與獸藥有關的雜質。 獸藥殘留直接危害人體健康，影響畜牧業(yè)的開展和生態(tài)環(huán)境。隨著人們對動物源食品由需求型向質量型的轉變，獸藥殘留已逐漸成為全世界關注的一個焦點。 抗生素類：氯霉素、四環(huán)素、土霉素、青霉素等； 磺胺類：磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶等； 呋喃類：呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等； 激素和-興奮劑：鹽酸克倫特羅、己烯雌酚、孕酮等； 抗寄生蟲類

3、：左旋咪唑、苯丙咪唑、克并咪唑、克球酚、吡喹酮等。2、獸藥殘留的類型 非法使用違禁或淘汰藥物； 不遵守休藥期規(guī)定； 濫用藥物； 違背有關標簽的規(guī)定； 屠宰前用藥。3、獸藥殘留產(chǎn)生的原因 毒性損害; 引發(fā)過敏反響； 導致病原菌產(chǎn)生耐藥性; 破壞微生態(tài)平衡，導致二重感染; 致畸、致癌、致突變作用; 影響生態(tài)環(huán)境； 影響畜牧業(yè)的開展。4、獸藥殘留的危害 篩選方法 檢測和確認方法：理化檢驗技術GC、HPLC、TLC、GC-MS、HPLC-MS等。微生物檢驗（微生物抑制試驗）免疫法（免疫檢測試劑盒）陽性5、獸藥殘留的分析方法獸藥殘留的檢驗分析方法包括篩選、檢測和確認。 GC靈敏度較高，但易出現(xiàn)假陽性、陽

4、性結果需進一步確證；HPLC操作簡單，但靈敏度不高；ELISA簡單、快速、靈敏度，但容易產(chǎn)生假陽性，一般只適用進行樣品粗篩，陽性結果需進行確證；目前靈敏度較高、確證率較好的是GC/MS、GS-MS/MS 。5、獸藥殘留的分析方法 氯霉素chloramphenicol，CAP是由委內瑞拉鏈絲菌產(chǎn)生的一種光譜抗生素。CAP對造血系統(tǒng)有毒性反響，是一種禁用藥。 概述 氯霉素的檢測方法主要有：微生物篩選法、GCECD、HPLCUV、GC-MS、GS-MS/MS、ELISA以及RIA等。4.2 水產(chǎn)品中氯霉素的檢驗 酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA 競爭性ELISA法的根本原理 競爭性ELISA法檢測對蝦中氯

5、霉素含量的實驗設計 課程實驗 分析和討論 4.2.2 對蝦中氯霉素含量的競爭性ELISA法檢測1、酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA 4.2.2 對蝦中氯霉素含量的競爭性ELISA法檢測 免疫檢測技術是以抗原抗體的特異性、可逆性結合反響為根底，結合一些生化或物理方法作為信號顯示或放大系統(tǒng)而建立的測定方法。 酶聯(lián)免疫吸附試驗Enzyme-Linked immunosorbent assay, ELISA是把抗原抗體的免疫反響和酶的高效催化有機地結合起來的一種免疫檢測技術，其根底的是抗原與抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。1、酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA根本原理：使抗原或抗體結合到某種固相載體外表，并保持其

6、免疫活性；使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保存其免疫活性，又保存酶活性；結合物與相應的抗原或抗體反響后，結合的酶仍能催化底物生產(chǎn)有色物質生成，而顏色的深淺可定量抗體或抗原的含量。1、酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA圖4-2 競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗法測抗原的根本原理示意圖2、競爭性 ELISA的根本原理以競爭性ELISA法測定氯霉素抗原為例 酶標抗原與樣品或標準體中的非標記抗原氯霉素具有相同的與抗體結合的能力，兩者競爭與固相載體包被的抗體結合。洗滌多余的酶標抗原，加酶反響的底物顯色后根據(jù)顏色的深淺進行定量。 在整個反響當中，樣品中氯霉素含量越多，反響顯色就越淡。反之，樣品

7、中氯霉素含量越少，那么顯色越深。2、競爭性 ELISA的根本原理以競爭性ELISA法測定氯霉素抗原為例為什么樣品中氯霉素含量與顯色呈反比？ 實驗方案設計：為了到達某種特定的目的，使用多種實驗試劑、儀器和設備，按照可行的實驗原理，列出實驗的操作順序、確定各步驟的操作方法，列出必須的本卷須知。3、競爭性ELISA檢測對蝦中氯霉素含量的實驗設計 4.2.2 對蝦中氯霉素含量的競爭性ELISA法檢測1實驗目的：進一步學習酶聯(lián)免疫試驗法的根本原理和實驗方法，確實掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定蝦肉中氯霉素含量的根本原理、實驗方法和結果的分析。 3、競爭性ELISA檢測對蝦中氯霉素含量的實驗設計 4.2.2 對

8、蝦中氯霉素含量的競爭性ELISA法檢測圖4-2 競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗法測抗原的根本原理示意圖2實驗原理3、競爭性ELISA檢測對蝦中氯霉素含量的實驗設計 氯霉素檢測試劑盒 4.2.2 對蝦中氯霉素含量的競爭性ELISA法檢測 氯霉素檢測試劑盒的組成：微量測試孔；氯霉素標準溶液；10倍濃縮萃取稀釋液；10倍濃縮洗滌液；氯霉素酶標記物；底物溶液；反響終止液。 3、競爭性ELISA檢測對蝦中氯霉素含量的實驗設計3主要試劑：氯霉素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。4主要儀器：簡易的萃取設備、氮吹儀、離心機、酶標分析儀。 3、競爭性ELISA檢測對蝦中氯霉素含量的實驗設計 4.2.2 對蝦中氯霉素含量的競爭性ELI

9、SA法檢測圖4-2 酶標儀4、實驗步驟1實驗準備從冰箱取出試劑盒，將氯霉素標準溶液、濃縮萃取稀釋液、濃縮洗滌液、酶標記物、底物溶液及微量測試孔條置于室溫下回溫30 min。配制原倍萃取稀釋液及洗滌液：用蒸餾水將10倍濃縮萃取稀釋液及濃縮洗滌液分別按1:9的比例稀釋。 4.2.2 對蝦中氯霉素含量的競爭性ELISA法檢測2樣品制備將3g蝦肉剪碎后放入50mL帶塞離心管中，參加6mL乙酸乙酯，用均質機均質約1min，再震蕩約30s。離心3000rpm，10 min，取2mL上清液至玻璃管中，于50下氮氣吹干。于上述玻璃管中參加正己烷2mL，先將剩余物完全溶解后，再參加1mL原倍萃取稀釋液，震蕩約3

10、0s。離心3000rpm，10min，用吸管吸去上層液及中間乳化層局部，棄掉，取下層液備用。假設乳化現(xiàn)象較嚴重，那么先將大局部上層液取出后，再將玻璃管置入80水中，隔水加熱約510min。 4.2.2 對蝦中氯霉素含量的競爭性ELISA法檢測3操作步驟 取一定的微量測試孔條，于適當微孔中分別參加100L標準溶液。 在另外的微孔中參加100L已完成前處理的樣品溶液。 在每一微孔中參加50L酶標記物。 輕敲盤子四周，使其充分混合后室溫下避光靜置溫育1h。 甩掉反響液，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復3次。 最后一次甩掉洗液后，在吸水紙上拍干。 每一微孔中參加底物溶液100L，輕敲盤子四周。 于室溫

11、下避光靜置溫育20min。 于每一微孔中參加100L反響終止液，用酶標儀于波長450nm下判讀 。 4.2.2 對蝦中氯霉素含量的競爭性ELISA法檢測5、結果處理所測得的標準吸光值和樣品吸光值B除以第一個標準零標準的吸光值B0再乘以100。以B/B0的百分數(shù)值為縱坐標，以標樣濃度ppb為橫坐標，繪制標準半對數(shù)曲線。根據(jù)每個樣品的B/B0的百分數(shù)值就可從曲線上讀出相對應樣品的濃度ppb。根據(jù)標準曲線所得出的樣品濃度乘以樣品稀釋倍數(shù)計算出樣品中氯霉素的實際濃度，最后的結果用“g/kg單位表示。 4.2.2 對蝦中氯霉素含量的競爭性ELISA法檢測 6、本卷須知使用前先將取出置于室溫下，回溫30m

12、in?；販睾螅〕鏊栉⒘繙y試孔條，將剩余板條立即放回鋁箔袋中用膠帶封好，置于4保存。 濃縮萃取稀釋液和濃縮洗滌液使用前必須稀釋。 每次吸取不同的液體時一定要換移液槍的吸頭。 加樣時必須小心勿濺出微孔外，以免造成其他微孔的污染，加樣品或試劑時槍頭請勿接觸微孔，不可產(chǎn)生氣泡。 洗滌必須充分，重復3次。 溫育時，要蓋上塑料片或標簽紙，置于暗處，溫育時間不夠不要隨意取出；顯色后盡快比色。 試劑盒較貴且量很少，準確量取，不要造成浪費。7、分析與討論酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒應該如何選擇？加底物進行溫育反響后不顯色的原因？洗滌不徹底會對結果產(chǎn)生怎樣的影響？為什么？標準曲線偏離線性不好，包括斜率偏大和偏小

13、的原因有哪些？樣品吸光值高于標準吸光值的原因？ 4.2.2 對蝦中氯霉素含量的競爭性ELISA法檢測 鹽酸克倫特羅 clenbuterol，CLB是一種選擇性2-腎上素受體沖動劑簡稱-興奮劑，是國家按興奮劑管理的藥品，為人、畜呼吸系統(tǒng)藥物氨哮素、克喘素 。 -(叔丁氨基)甲基-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽 鹽酸克倫特羅概述 鹽酸克倫特羅可促進動物生長，加速脂肪轉化，提高瘦肉率，被俗稱為“瘦肉精。4.3 豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗 鹽酸克倫特羅概述 鹽酸克倫特羅加速脂肪轉化？胰高血糖素促甲狀腺激素cAMP脂肪酶激活激活 非法使用鹽酸克倫特羅作為飼料添加劑，使用量大是治療劑量的5-10倍，使

14、用時間長持續(xù)添加時間一般3周以上 ，代謝慢，因而容易在動物體內尤其是眼 、肺、肝、腎 殘留。 鹽酸克倫特羅通過食物鏈進入人體，產(chǎn)生蓄積中毒，如頭暈、乏力、心律失常等。 因此，國內外已經(jīng)禁止-腎上腺素沖動劑在動物生產(chǎn)中的應用。 鹽酸克倫特羅概述 克倫特羅的檢驗方法：HPLC、GC-MS、毛細管區(qū)帶電泳法和免疫分析法。 感官識別：健康肉淡紅色，肉質彈性好，無“出汗現(xiàn)象；“問題肉特別鮮紅，脂肪非常薄，瘦肉纖維疏松，有“出汗現(xiàn)象。 鹽酸克倫特羅概述 GB/T 5009.192-2003?動物性食品中克倫特羅殘留量的測定?，提出了從ELISA篩選、HPLC定量到GC-MS確證和定量對動物性食品中克倫特羅

15、殘留量進行監(jiān)測。4.3.2 豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗GS/MS法 根本原理：固體樣品剪碎，用高氯酸溶液勻漿。假設為液體試樣，那么參加高氯酸溶液，進行超聲加熱提取，用異丙醇+乙酸乙酯40+60萃取，有機相濃縮，經(jīng)弱陽離子交換柱進行別離，用乙醇+濃氨水98+2溶液洗脫，洗脫液濃縮，經(jīng)N,O-雙三甲級硅烷三氟乙酰胺衍生后于氣質聯(lián)用儀上進行測定，以美托洛爾為內標，進行定量。 GB/T 5009.192-2003?動物性食品中克倫特羅殘留量的測定?第一法GC/MS法。4.3.3 豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗ELISA法 根本原理：微孔板包被有針對克倫特羅IgG的抗抗體；參加克倫特羅抗體，經(jīng)過溫育和洗滌后

16、；參加酶標記物、標準或樣品溶液，克倫特羅與酶標記物競爭與抗體結合；沒有連接的克倫特羅酶標記物在被洗滌除去；參加酶底物和發(fā)色劑并且溫育，結合的酶標記物將無色的發(fā)色劑為藍色的產(chǎn)物，參加反響終止液使顏色有藍轉變?yōu)辄S色。在450nm處比色測定。 GB/T 5009.192-2003?動物性食品中克倫特羅殘留量的測定?第三法GC/MS法。 酶聯(lián)免疫實驗設計4.3.3 豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗ELISA法4.3.3 豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗ELISA法 實驗的關鍵操作： 試劑盒的選擇和準備； 試樣的處理；加樣； 洗滌； 比色。1試劑盒的選擇和準備 固相載體： 吸附性能，孔底透明度，板、孔性能差異； 包被物：純度； 儲存條件：2-8 ； 室溫平衡：試驗用試劑應提前1-2h從冰箱中取出，待溫度與室溫平衡后使用；及時保存：試劑完畢后不需用的局部應及時放回冰箱保存。4.3.3 豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗ELISA法 實驗的關鍵操作2試樣的處理 盡可能使用新鮮樣本； 進行必要的前處理。3加樣 加樣前樣本必須混合均勻； 加在板孔底部，防止加在孔壁上部； 不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡