獸藥殘留量檢驗(yàn)要點(diǎn)

1、獸藥殘留量檢驗(yàn)要點(diǎn)4.1 獸藥與獸藥殘留研究背景、獸藥殘留產(chǎn)生的原因、類型、危害4.2 水產(chǎn)品中氯霉素的檢驗(yàn)對(duì)蝦中氯霉素含量的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)4.3 豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗(yàn) 豬組織中鹽酸克倫特羅的GS/MS法檢測(cè)、豬組織中鹽酸克倫特羅的ELISA法檢測(cè) 第四章 獸藥殘留量的檢驗(yàn) 內(nèi)容要點(diǎn)： 獸藥：預(yù)防和治療畜禽疾病的藥物；促進(jìn)生長(zhǎng)、提高生產(chǎn)性能、改善動(dòng)物性食品的品質(zhì)；也包括一些化學(xué)的、生物的動(dòng)物保健品或飼料添加劑。 現(xiàn)代化的動(dòng)物集中飼養(yǎng)，經(jīng)常需要使用抗生素或其他藥物來(lái)控制可能爆發(fā)的疾病，同時(shí)有效使用獸藥可以在很大程度上提高動(dòng)物對(duì)飼料的利用率。4.1 獸藥與獸藥殘留1、研究背景1、研究

2、背景 獸藥的使用極易造成動(dòng)物源食品中有害物質(zhì)的殘留，特別是由于養(yǎng)殖人員對(duì)科學(xué)知識(shí)的缺乏以及一味地追求經(jīng)濟(jì)利益，致使濫用獸藥現(xiàn)象在畜牧業(yè)中普遍存在。 獸藥殘留：“獸藥在動(dòng)物源食品中的殘留的簡(jiǎn)稱，是指動(dòng)物產(chǎn)品的任何可食局部所含獸藥的母體化合物及或其代謝物，以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)。 獸藥殘留直接危害人體健康，影響畜牧業(yè)的開展和生態(tài)環(huán)境。隨著人們對(duì)動(dòng)物源食品由需求型向質(zhì)量型的轉(zhuǎn)變，獸藥殘留已逐漸成為全世界關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn)。 抗生素類：氯霉素、四環(huán)素、土霉素、青霉素等； 磺胺類：磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶等； 呋喃類：呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等； 激素和-興奮劑：鹽酸克倫特羅、己烯雌酚、孕酮等； 抗寄生蟲類

3、：左旋咪唑、苯丙咪唑、克并咪唑、克球酚、吡喹酮等。2、獸藥殘留的類型 非法使用違禁或淘汰藥物； 不遵守休藥期規(guī)定； 濫用藥物； 違背有關(guān)標(biāo)簽的規(guī)定； 屠宰前用藥。3、獸藥殘留產(chǎn)生的原因 毒性損害; 引發(fā)過(guò)敏反響； 導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性; 破壞微生態(tài)平衡，導(dǎo)致二重感染; 致畸、致癌、致突變作用; 影響生態(tài)環(huán)境； 影響畜牧業(yè)的開展。4、獸藥殘留的危害 篩選方法 檢測(cè)和確認(rèn)方法：理化檢驗(yàn)技術(shù)GC、HPLC、TLC、GC-MS、HPLC-MS等。微生物檢驗(yàn)（微生物抑制試驗(yàn)）免疫法（免疫檢測(cè)試劑盒）陽(yáng)性5、獸藥殘留的分析方法獸藥殘留的檢驗(yàn)分析方法包括篩選、檢測(cè)和確認(rèn)。 GC靈敏度較高，但易出現(xiàn)假陽(yáng)性、陽(yáng)

4、性結(jié)果需進(jìn)一步確證；HPLC操作簡(jiǎn)單，但靈敏度不高；ELISA簡(jiǎn)單、快速、靈敏度，但容易產(chǎn)生假陽(yáng)性，一般只適用進(jìn)行樣品粗篩，陽(yáng)性結(jié)果需進(jìn)行確證；目前靈敏度較高、確證率較好的是GC/MS、GS-MS/MS 。5、獸藥殘留的分析方法 氯霉素chloramphenicol，CAP是由委內(nèi)瑞拉鏈絲菌產(chǎn)生的一種光譜抗生素。CAP對(duì)造血系統(tǒng)有毒性反響，是一種禁用藥。 概述 氯霉素的檢測(cè)方法主要有：微生物篩選法、GCECD、HPLCUV、GC-MS、GS-MS/MS、ELISA以及RIA等。4.2 水產(chǎn)品中氯霉素的檢驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA 競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法的根本原理 競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)對(duì)蝦中氯

5、霉素含量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 課程實(shí)驗(yàn) 分析和討論 4.2.2 對(duì)蝦中氯霉素含量的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA 4.2.2 對(duì)蝦中氯霉素含量的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè) 免疫檢測(cè)技術(shù)是以抗原抗體的特異性、可逆性結(jié)合反響為根底，結(jié)合一些生化或物理方法作為信號(hào)顯示或放大系統(tǒng)而建立的測(cè)定方法。 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)Enzyme-Linked immunosorbent assay, ELISA是把抗原抗體的免疫反響和酶的高效催化有機(jī)地結(jié)合起來(lái)的一種免疫檢測(cè)技術(shù)，其根底的是抗原與抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA根本原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體外表，并保持其

6、免疫活性；使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保存其免疫活性，又保存酶活性；結(jié)合物與相應(yīng)的抗原或抗體反響后，結(jié)合的酶仍能催化底物生產(chǎn)有色物質(zhì)生成，而顏色的深淺可定量抗體或抗原的含量。1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA圖4-2 競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)抗原的根本原理示意圖2、競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA的根本原理以競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法測(cè)定氯霉素抗原為例 酶標(biāo)抗原與樣品或標(biāo)準(zhǔn)體中的非標(biāo)記抗原氯霉素具有相同的與抗體結(jié)合的能力，兩者競(jìng)爭(zhēng)與固相載體包被的抗體結(jié)合。洗滌多余的酶標(biāo)抗原，加酶反響的底物顯色后根據(jù)顏色的深淺進(jìn)行定量。 在整個(gè)反響當(dāng)中，樣品中氯霉素含量越多，反響顯色就越淡。反之，樣品

7、中氯霉素含量越少，那么顯色越深。2、競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA的根本原理以競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法測(cè)定氯霉素抗原為例為什么樣品中氯霉素含量與顯色呈反比？ 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)：為了到達(dá)某種特定的目的，使用多種實(shí)驗(yàn)試劑、儀器和設(shè)備，按照可行的實(shí)驗(yàn)原理，列出實(shí)驗(yàn)的操作順序、確定各步驟的操作方法，列出必須的本卷須知。3、競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)對(duì)蝦中氯霉素含量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 4.2.2 對(duì)蝦中氯霉素含量的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)1實(shí)驗(yàn)?zāi)康模哼M(jìn)一步學(xué)習(xí)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)法的根本原理和實(shí)驗(yàn)方法，確實(shí)掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定蝦肉中氯霉素含量的根本原理、實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果的分析。 3、競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)對(duì)蝦中氯霉素含量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 4.2.2 對(duì)

8、蝦中氯霉素含量的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)圖4-2 競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)抗原的根本原理示意圖2實(shí)驗(yàn)原理3、競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)對(duì)蝦中氯霉素含量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 氯霉素檢測(cè)試劑盒 4.2.2 對(duì)蝦中氯霉素含量的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè) 氯霉素檢測(cè)試劑盒的組成：微量測(cè)試孔；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液；10倍濃縮萃取稀釋液；10倍濃縮洗滌液；氯霉素酶標(biāo)記物；底物溶液；反響終止液。 3、競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)對(duì)蝦中氯霉素含量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3主要試劑：氯霉素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。4主要儀器：簡(jiǎn)易的萃取設(shè)備、氮吹儀、離心機(jī)、酶標(biāo)分析儀。 3、競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)對(duì)蝦中氯霉素含量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 4.2.2 對(duì)蝦中氯霉素含量的競(jìng)爭(zhēng)性ELI

9、SA法檢測(cè)圖4-2 酶標(biāo)儀4、實(shí)驗(yàn)步驟1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備從冰箱取出試劑盒，將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃縮萃取稀釋液、濃縮洗滌液、酶標(biāo)記物、底物溶液及微量測(cè)試孔條置于室溫下回溫30 min。配制原倍萃取稀釋液及洗滌液：用蒸餾水將10倍濃縮萃取稀釋液及濃縮洗滌液分別按1:9的比例稀釋。 4.2.2 對(duì)蝦中氯霉素含量的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)2樣品制備將3g蝦肉剪碎后放入50mL帶塞離心管中，參加6mL乙酸乙酯，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)約1min，再震蕩約30s。離心3000rpm，10 min，取2mL上清液至玻璃管中，于50下氮?dú)獯蹈?。于上述玻璃管中參加正己?mL，先將剩余物完全溶解后，再參加1mL原倍萃取稀釋液，震蕩約3

10、0s。離心3000rpm，10min，用吸管吸去上層液及中間乳化層局部，棄掉，取下層液備用。假設(shè)乳化現(xiàn)象較嚴(yán)重，那么先將大局部上層液取出后，再將玻璃管置入80水中，隔水加熱約510min。 4.2.2 對(duì)蝦中氯霉素含量的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)3操作步驟 取一定的微量測(cè)試孔條，于適當(dāng)微孔中分別參加100L標(biāo)準(zhǔn)溶液。 在另外的微孔中參加100L已完成前處理的樣品溶液。 在每一微孔中參加50L酶標(biāo)記物。 輕敲盤子四周，使其充分混合后室溫下避光靜置溫育1h。 甩掉反響液，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復(fù)3次。 最后一次甩掉洗液后，在吸水紙上拍干。 每一微孔中參加底物溶液100L，輕敲盤子四周。 于室溫

11、下避光靜置溫育20min。 于每一微孔中參加100L反響終止液，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450nm下判讀 。 4.2.2 對(duì)蝦中氯霉素含量的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)5、結(jié)果處理所測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)吸光值和樣品吸光值B除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)零標(biāo)準(zhǔn)的吸光值B0再乘以100。以B/B0的百分?jǐn)?shù)值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣濃度ppb為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)半對(duì)數(shù)曲線。根據(jù)每個(gè)樣品的B/B0的百分?jǐn)?shù)值就可從曲線上讀出相對(duì)應(yīng)樣品的濃度ppb。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度乘以樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出樣品中氯霉素的實(shí)際濃度，最后的結(jié)果用“g/kg單位表示。 4.2.2 對(duì)蝦中氯霉素含量的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè) 6、本卷須知使用前先將取出置于室溫下，回溫30m

12、in?；販睾螅〕鏊栉⒘繙y(cè)試孔條，將剩余板條立即放回鋁箔袋中用膠帶封好，置于4保存。 濃縮萃取稀釋液和濃縮洗滌液使用前必須稀釋。 每次吸取不同的液體時(shí)一定要換移液槍的吸頭。 加樣時(shí)必須小心勿濺出微孔外，以免造成其他微孔的污染，加樣品或試劑時(shí)槍頭請(qǐng)勿接觸微孔，不可產(chǎn)生氣泡。 洗滌必須充分，重復(fù)3次。 溫育時(shí)，要蓋上塑料片或標(biāo)簽紙，置于暗處，溫育時(shí)間不夠不要隨意取出；顯色后盡快比色。 試劑盒較貴且量很少，準(zhǔn)確量取，不要造成浪費(fèi)。7、分析與討論酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒應(yīng)該如何選擇？加底物進(jìn)行溫育反響后不顯色的原因？洗滌不徹底會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？為什么？標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離線性不好，包括斜率偏大和偏小

13、的原因有哪些？樣品吸光值高于標(biāo)準(zhǔn)吸光值的原因？ 4.2.2 對(duì)蝦中氯霉素含量的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè) 鹽酸克倫特羅 clenbuterol，CLB是一種選擇性2-腎上素受體沖動(dòng)劑簡(jiǎn)稱-興奮劑，是國(guó)家按興奮劑管理的藥品，為人、畜呼吸系統(tǒng)藥物氨哮素、克喘素 。 -(叔丁氨基)甲基-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽 鹽酸克倫特羅概述 鹽酸克倫特羅可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，加速脂肪轉(zhuǎn)化，提高瘦肉率，被俗稱為“瘦肉精。4.3 豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗(yàn) 鹽酸克倫特羅概述 鹽酸克倫特羅加速脂肪轉(zhuǎn)化？胰高血糖素促甲狀腺激素cAMP脂肪酶激活激活 非法使用鹽酸克倫特羅作為飼料添加劑，使用量大是治療劑量的5-10倍，使

14、用時(shí)間長(zhǎng)持續(xù)添加時(shí)間一般3周以上 ，代謝慢，因而容易在動(dòng)物體內(nèi)尤其是眼 、肺、肝、腎 殘留。 鹽酸克倫特羅通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，產(chǎn)生蓄積中毒，如頭暈、乏力、心律失常等。 因此，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)禁止-腎上腺素沖動(dòng)劑在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用。 鹽酸克倫特羅概述 克倫特羅的檢驗(yàn)方法：HPLC、GC-MS、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法和免疫分析法。 感官識(shí)別：健康肉淡紅色，肉質(zhì)彈性好，無(wú)“出汗現(xiàn)象；“問(wèn)題肉特別鮮紅，脂肪非常薄，瘦肉纖維疏松，有“出汗現(xiàn)象。 鹽酸克倫特羅概述 GB/T 5009.192-2003?動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留量的測(cè)定?，提出了從ELISA篩選、HPLC定量到GC-MS確證和定量對(duì)動(dòng)物性食品中克倫特羅

15、殘留量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。4.3.2 豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗(yàn)GS/MS法 根本原理：固體樣品剪碎，用高氯酸溶液勻漿。假設(shè)為液體試樣，那么參加高氯酸溶液，進(jìn)行超聲加熱提取，用異丙醇+乙酸乙酯40+60萃取，有機(jī)相濃縮，經(jīng)弱陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行別離，用乙醇+濃氨水98+2溶液洗脫，洗脫液濃縮，經(jīng)N,O-雙三甲級(jí)硅烷三氟乙酰胺衍生后于氣質(zhì)聯(lián)用儀上進(jìn)行測(cè)定，以美托洛爾為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行定量。 GB/T 5009.192-2003?動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留量的測(cè)定?第一法GC/MS法。4.3.3 豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗(yàn)ELISA法 根本原理：微孔板包被有針對(duì)克倫特羅IgG的抗抗體；參加克倫特羅抗體，經(jīng)過(guò)溫育和洗滌后

16、；參加酶標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液，克倫特羅與酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合；沒(méi)有連接的克倫特羅酶標(biāo)記物在被洗滌除去；參加酶底物和發(fā)色劑并且溫育，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無(wú)色的發(fā)色劑為藍(lán)色的產(chǎn)物，參加反響終止液使顏色有藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm處比色測(cè)定。 GB/T 5009.192-2003?動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留量的測(cè)定?第三法GC/MS法。 酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.3.3 豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗(yàn)ELISA法4.3.3 豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗(yàn)ELISA法 實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵操作： 試劑盒的選擇和準(zhǔn)備； 試樣的處理；加樣； 洗滌； 比色。1試劑盒的選擇和準(zhǔn)備 固相載體： 吸附性能，孔底透明度，板、孔性能差異； 包被物：純度； 儲(chǔ)存條件：2-8 ； 室溫平衡：試驗(yàn)用試劑應(yīng)提前1-2h從冰箱中取出，待溫度與室溫平衡后使用；及時(shí)保存：試劑完畢后不需用的局部應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。4.3.3 豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗(yàn)ELISA法 實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵操作2試樣的處理 盡可能使用新鮮樣本； 進(jìn)行必要的前處理。3加樣 加樣前樣本必須混合均勻； 加在板孔底部，防止加在孔壁上部； 不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡