酶的分離純化c

1、Chapter 3 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme第三章 酶的分離純化1Contents of chapter 33.1、酶的提取與分離純化技術(shù)路線3.2、生物原始材料的制備與細(xì)胞破碎3.3、酶的提取與酶溶液的凈化、脫色3.4、酶的分離方法GoGoGoGo3.5、酶的組合分離純化策略Go3.6、酶的濃縮、干燥與結(jié)晶Go2細(xì)胞結(jié)構(gòu)與酶分布3分離純化方法的設(shè)計(jì)考慮的因素 原料、背景知識的了解； 操作溫和、環(huán)境； 溶液中各個參數(shù)及使用的輔助試劑； 靈敏、特異的檢測手段； 純化手段的選擇。4酶分離純化的特點(diǎn) 酶在生物細(xì)胞中的含

2、量很低，分離純化很難； 通過測定活力的方法可以跟蹤酶，能迅 速找出分離純化過程的關(guān)鍵；5 酶活性測定 酶活力(Enzyme Activity)也稱酶活性，指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活性是研究酶的特性、分離純化以及酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用時的一項(xiàng)不可缺少的指標(biāo)。 酶活力是用在一定條件下，它所催化某一反應(yīng)的反應(yīng)初速度來表示。 酶反應(yīng)速度(指初速度)可用單位時間內(nèi)單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。其單位為mol/s。6比活力 比活力(性)(Specific Activity)是酶純度的量度，即指：單位重量的蛋白質(zhì)中所具有酶的活力單位數(shù)，一般用IU/mg蛋白質(zhì)來表示。一 般來說，酶的比活力越高，

3、酶越純。酶活力與底物濃度、酶濃度、pH、溫度、激活劑、抑制劑的濃度以及緩沖液的種類和濃度都密切相關(guān)。 酶活性測定可用終止反應(yīng)法或連續(xù)反應(yīng)法。7（1）酶法 酶法是用其他純酶將產(chǎn)物直接或間接轉(zhuǎn)變成一個可用分光光譜儀或熒光光譜儀測定的化合物。通常采用偶聯(lián)法，例如葡萄糖氧化酶催化的下列反應(yīng)： 葡萄糖+O2葡萄糖內(nèi)脂+H2O2 欲測定葡萄糖內(nèi)脂和H2O2均較困難，可在該反應(yīng)中加入過氧化物酶和木酚，使發(fā)生下列反應(yīng):8 (2)化學(xué)法 化學(xué)法是利用化學(xué)反應(yīng)使產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成一個可用某種物理方法測出NH3和CO2，然后用比色法、滴定法、氣體體積量度法等方法測出酶活性。（3）放射性化學(xué)法 是由具有放射性的產(chǎn)物上測出全放

4、射量，再算出產(chǎn)物量，從而計(jì)算出酶的活性。9（4）一般的連續(xù)法 包括光譜吸收、電化學(xué)、量氣、量熱、旋光法等，其中以光譜吸收較為準(zhǔn)確。光譜吸收主要指分光光度和熒光法。該法適用于一些反應(yīng)速度較快的酶，自動記錄儀的普遍使用使該法更容易被人們所接受。（5）偶聯(lián)的連續(xù)法 是將指示酶直接加到待測酶反應(yīng)系統(tǒng)中，將其產(chǎn)物直接或間接轉(zhuǎn)變成可用光譜吸收儀檢測的化合物。連續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)必須在酶反應(yīng)相同條件（pH、溫度等）下進(jìn)行，且加入的指示酶以及其他各種物質(zhì)不能干擾原來的酶活力。10具體應(yīng)用的實(shí)例Novo Nordisk（諾維信公司）采用平皿法 ： 二甲基酪蛋白和明膠 蛋白質(zhì)水解樣品 測定D大小 標(biāo)準(zhǔn)品D大小 11四個

5、階段 預(yù)處理（pretreatment） 粗分級分離（rough fractionation） 細(xì)分級分離（fine fractionation） 成品加工（concentration and desiccation） 12A 純化階段B分析方法MaterialExtractionProteinfractionationAmmoniumsulfateChromatographyGel filtration/Ion exchangeAffinity chromatography/HPLCElectrophoresisPure enzymeBackground knowledge about ma

6、terialProtein/ activity analysisElectrophoresis:Native/ SDS/ Gradient PAGEKinetic studyMolecular weight/ Sedimentation coefficientQuaternary structure/ Isoelectric focusingPeptide mappingAmino acid analysisAmino acid sequencingExtinction coefficientAntibody productionImmunoassays:ELISA/ Immunoblotti

7、ngimmunoelectrophoresiscrystalX-Ray/crystallographySpectroscopic method13酶提取分離純化技術(shù)路線發(fā)酵培養(yǎng)動物器官植物組織微生物提取胞內(nèi)酶胞外酶細(xì)胞破碎研磨酶分離純化離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。酶濃縮酶貯存本章目錄14生物原始材料的制備動物器官植物組織微生物15微生物發(fā)酵液的預(yù)處理 發(fā)酵液的相對純化 無機(jī)離子的去除、 雜蛋白質(zhì)的去除、 色素及其他物質(zhì)的去除 發(fā)酵液的固液分離 離心分離、 過濾16不同類型的過濾機(jī)17細(xì)胞破碎 胞外酶 胞內(nèi)酶1）機(jī)械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解

8、破碎JY92-II D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型 電動玻璃勻漿機(jī)18機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法 物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法 化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理19超聲波破碎法1、工作原理：利用超聲波發(fā)生器所發(fā)出的聲波或超聲波的作用，使

9、細(xì)胞膜產(chǎn)生空穴作用（cavitation）引起的沖擊波和剪切力而使細(xì)胞破碎的方法稱為超聲波破碎法。2、過程：超聲波空穴泡速迅閉合極強(qiáng)的沖擊波粘滯性的細(xì)胞剪切應(yīng)力引起胞內(nèi)液流細(xì)胞破碎203、影響因素：聲頻、聲能、處理時間、細(xì)胞濃度、菌種類型。4、特點(diǎn)： 1）適應(yīng)于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的應(yīng)用（操作簡單、液量損失少，可加冰或加冷水）（大規(guī)模操作時，聲能傳遞和散熱困難）。 2）易失活物質(zhì)不宜用（超聲波可促使產(chǎn)生一些化學(xué)自由基因使酶失活）。 3）G-桿菌破碎效果好，酵母菌效果差。21本章目錄22酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┗蛉芤褐械倪^程。也稱為酶的抽提。酶提取時首

10、先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。3.3 酶的提取23提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。 為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值、提取液體積等提取條件。 酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。24溫度：提高溫度，可以提高酶的溶解度。一般在00C100C。pH：在酶的穩(wěn)

11、定范圍內(nèi)，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)pH。緩沖液：常用0.15mol/L氯化鈉、 0.020.05mol/L磷酸緩沖液。 提取液體積：一般為原料體積的1-5倍。 保護(hù)劑：底物、輔酶、某些抗氧化劑、 表面活性劑等。25表面活性劑對葡萄糖異構(gòu)酶抽提效果的影晌26酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.020.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶27

12、大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。 28提高鹽濃度可以增加溶解度29酶溶液的凈化與脫色 細(xì)胞、細(xì)胞碎片等固形物質(zhì)和蛋白質(zhì)、粘多糖、脂類和核酸等大分子物質(zhì)，通常應(yīng)通過離心或過濾而凈化。 當(dāng)細(xì)胞或細(xì)胞碎片的大小很小并且物理特性接近時，通常需要使用絮凝劑（Floccul ation）后才能凈化。 絮凝是利用顆粒的不穩(wěn)定性，使小顆粒聚集。3031 無機(jī)絮凝劑：如鉛鹽、鐵鹽等水解后生成氫氧化物的凝膠微粒具有吸附作用和電荷作用，產(chǎn)生絮凝下降。如醋酸鈣、磷酸鈣等鈣鹽及鋅鹽也具有包圍吸附沉淀作用。有機(jī)絮凝劑： 一些聚合物，多為水溶性直鏈狀的大

13、分子，按其鏈上所帶基團(tuán)不同而分為陽離子型、陰離子型和非離子型三種。其中以聚丙烯酰胺使用最廣泛，也有用陰離子型和非離子型的絮凝劑。天然高分子絮凝劑： 主要有殼聚糖。殼聚糖與鈣鹽或鋁鹽可增進(jìn)分離效果。32工業(yè)用絮凝劑人工合成有機(jī)絮凝劑水溶性，平均相對分子量1035X106，含有聚合電解質(zhì)。 絮凝步驟：中和表面電荷；聚集成大的聚集體。 影響選擇的因素： 培養(yǎng)基、聚合物、工程參數(shù)、 成本、后續(xù)的分離性能、過程的穩(wěn)定性及 收率。 33脫色：工業(yè)上用酶需脫色； 酶提取的哪個階段脫色；活性炭： 用量0.1%-1.5%、氯化鋅法制備的、 離子交換樹脂本章目錄343.4 酶的分離方法1、沉淀分離2、離心分離3、

14、萃取分離4、層析分離GoGoGoGo5、電泳分離Go6、過濾與膜分離Go本章目錄35常用的蛋白質(zhì)、酶和重組蛋白的純化技術(shù)分離原理分離方法特點(diǎn)用途分子大小電荷等電點(diǎn)疏水特性生物親和性凝膠過濾離子交換色譜聚焦疏水作用親和分辨率適中；分級分離時流速較慢8h）；脫鹽時流速快；容量受限于樣品體積。分辨率較高；流速較快容量大，樣品體積不受限。 分辨率較高；流速較快容量大，樣品體積不受限。 分辨率較高；流速較快容量大，樣品體積不受限。 分辨率較高；流速較快容量大，樣品體積不受限。 分級分離，脫鹽可以用于大規(guī)模純化的最后一步，用于去除雜質(zhì)聚合體；適于早期純化，大體積蛋白且純度較低時使用。純化最后適于任何階段；

15、特別適于樣品離子強(qiáng)度較高，如沉淀、離子交換后。適于任何階段；特別適于樣品濃度小，雜志含量多時使用。361、沉淀分離沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。 沉淀分離方法 分離原理 鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離 有機(jī)溶劑 沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，

16、通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離 復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性 沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離37在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象。 在一定的溫度和pH值條件下（為常數(shù)），通過改變離子強(qiáng)度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法稱為Ks分段鹽析；而在一定的鹽和離子強(qiáng)度的條件下（KsI為常數(shù)），通過改變溫度和pH值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法，稱為分段鹽析。 鹽析沉淀法38 在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨

17、、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。然而用硫酸銨進(jìn)行鹽析時，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。在鹽析時，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度表示。通常飽和度為20%-80%。 3940影響因素 蛋白質(zhì)濃度pH值溫度 技術(shù)特點(diǎn) 操作簡便、中性鹽對蛋白有一定的保護(hù)作用；分辨率低，純化倍數(shù)低、必須要脫鹽。41有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出主要是由于有機(jī)溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。其次是使酶蛋白脫水而發(fā)生沉淀。 有機(jī)溶劑法42 影響有機(jī)溶劑

18、沉 淀法分離的因素 溫度 pH 離子強(qiáng)度 蛋白質(zhì)濃度 常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、 異丙醇、甲醇等 。 用量一般為酶體積的2倍左右，終濃度為70 加入量依下式計(jì)算： V=Vo(S2S1)/(SS2)選擇有機(jī)溶劑的標(biāo)準(zhǔn)必須與水完全混溶;不與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)； 要有較好的沉淀效應(yīng)； 溶劑蒸汽要無毒，且不易燃。43陰 極陽 極pH=pIpHpI帶正電荷帶負(fù)電荷凈電荷為零導(dǎo)電率溶解度滲透壓粘度達(dá)到最低等電點(diǎn)沉淀法原因:在等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)分子以雙極離子存在，總凈電荷為零, 顆粒無電荷間的排斥作用,易凝集成大顆粒，因而最不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀析出。 電泳分離沉淀分離44 pH=pI 溶解度

19、最小等電點(diǎn)沉淀與分離大部或全部沉淀下來pHpI蛋白質(zhì)的分離沉淀出來的蛋白質(zhì)可保持天然構(gòu)象，能再溶解于水并具有生物活性。本節(jié)目錄452、離心分離 離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。 在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。離心的形式： 離心沉降 離心過濾 離心分離和超離心46離心機(jī)的種類常速離心機(jī)又稱為低速離心機(jī), 其最大轉(zhuǎn)速在8000 r/min以內(nèi)，相對離心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。也用于酶的結(jié)晶等

20、較大顆粒的分離。 高速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速為（12.5）104 r/min ，相對離心力達(dá)到 11041105 g ，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機(jī)。超速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速達(dá) (2.512)104 r/min，相對離心力可以高達(dá) 5105 g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。47超速離心機(jī)高速離心機(jī)沉降離心機(jī)4849差速離心50密度梯度離心513、萃取分離萃取分離是利用物質(zhì)在兩

21、相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個液相。有時也可采用其它流體。按照兩相的組成不同，萃取可以分為：有機(jī)溶劑萃取雙水相萃取超臨界萃取反膠束萃取 52萃取相Extract萃余相Raffinate料液A+BFeed萃取劑Solvent混合澄清槽Mixer-settler萃取的基本過程CTL離心萃取機(jī)53 有機(jī)溶劑萃取 常用的溶劑：醇、酮、丁醇、苯酚等。 萃取條件：00C100C。接觸時間盡可能短。54在溶劑萃取中使用的有機(jī)溶劑，除了考慮萃取率高、選擇性好以外，還有以下的基本要求：不能與水相混溶，也不與水發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。與水比較有足夠大的密度差，與水相容易分離，不易乳化

22、。 粘度小，有利于與水相攪拌均勻，并容易分相。 沸點(diǎn)要高，在室溫條件下的揮發(fā)性要小。 不易燃燒和爆炸。 折光率與水有差異，有機(jī)相與水相分離后界面清晰。 溶劑對光的吸收應(yīng)當(dāng)與溶劑中溶質(zhì)對光的吸收不重疊，以 利于采用分光光度法進(jìn)行分析。 烯烴含量小于2 %，不易被氧化；對酸、堿的化學(xué)穩(wěn)定性好； 無毒，安全。 容易制備，價格便宜。 55雙水相萃取 （two-aqueous phase system extraction）以兩種不相溶的水溶性高分子聚合物的水溶液混合，當(dāng)聚合物濃度達(dá)到一定值，體現(xiàn)自然分成互不相容的兩相，構(gòu)成雙水相。 利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。 影響分配的因素： 雙水相的性

23、質(zhì)、分離物質(zhì)的性質(zhì)、 離子性質(zhì)、環(huán)境因素 56聚合物Q或鹽%聚合物P(%) 雙水相系統(tǒng)相圖57各種雙水相系統(tǒng)聚合物P 聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉58雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)： 富含70%以上的水；處理量大； 所需設(shè)備簡單； 操作條件溫和、方便、快速； 不需特殊處理，就可與后續(xù)純化步驟銜接； 發(fā)展。59超臨界萃取 （supercritical fluid extraction

24、）以接近或超過臨界點(diǎn)的低溫、高壓、高密度氣體作為溶劑，從液體或固體中萃取所需組分，通過溫度和壓力的調(diào)節(jié)來控制與溶質(zhì)的親和性而實(shí)現(xiàn)分離的，然后采用等壓變溫或等溫變壓等方法，將溶質(zhì)與溶劑分離的單元操作。 超臨界萃取的基本原理分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同而分離。常用的超臨界流體：二氧化碳、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷和氨、正戊烷、甲苯等。60某些超臨界流體的超臨界點(diǎn)和超臨界密度流體名稱臨界溫度()臨界壓力(Mpa)臨界密度（g/ml）乙烷C2H632.34.880.203丙烷C3H896.94.260.220丁烷C4H10152.03.800.228戊烷C5H12296.73.280.232乙

25、烯C2H49.95.120.227氨NH3132.411.280.236二氧化碳 CO231.17.380.46二氧化硫 SO2157.67.880.525水H2O374.322.110.326笑氣N2O36.57.170.451氟里昂C28.83.900.57861萃取器分離器PP壓縮機(jī)膨脹閥T1T2等溫變壓流程等壓變溫流程萃取器分離器PP泵加熱器T1T2等溫等壓吸附流程萃取器分離器PP泵T1T2吸收劑吸附劑62反膠束( reversed micelle) 是雙親物質(zhì)在非極性有機(jī)溶劑中自發(fā)聚集體,又稱為反膠團(tuán)、逆膠束。1977 年,Luisi 等首先發(fā)現(xiàn)胰凝乳蛋白酶可以溶解于雙親物質(zhì)(表面活

26、性劑) 的有機(jī)溶劑中,超離心數(shù)據(jù)顯示有機(jī)相中反膠束的存在,同時,光譜分析表明這一過程未引起酶的變性。反膠束技術(shù)目前仍限于實(shí)驗(yàn)室研究,沒有商品化產(chǎn)品.反膠束萃?。╮eversed micelle extraction）本節(jié)目錄634、層析分離層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)并使各組分以不同速度移動，從而達(dá)到分離。64是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來源豐富、價格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡單。吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附

27、柱中，裝置成吸附層析柱。層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。 吸附層析65 洗脫方式物質(zhì)濃度洗脫液體積 溶劑洗脫法的洗脫曲線物質(zhì)濃度洗脫液體積 置換洗脫法的洗脫曲線物質(zhì)濃度洗脫液體積 前緣洗脫法的洗脫曲線66吸附劑與洗脫劑的選擇吸附劑的選擇洗脫劑的選擇 極性、洗脫劑的種類有：醇、酮、酚、醚、鹵代烷、水等。洗脫劑的選擇要注意下列各點(diǎn)：洗脫劑不會與吸附劑起化學(xué)反應(yīng)，不會使吸附劑溶解；洗脫劑對混合液中的各組分的溶解度大，粘度小，流動性好，容易與被洗脫的組分分離；洗脫劑要求一定的純度，以免雜

28、質(zhì)對分離帶來不利影響。67是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。 離子交換層析6869又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。 凝膠層析70常用的凝膠： 葡聚糖凝膠、瓊脂凝

29、膠與瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠 凝膠層析的基本原理 ： 大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。 較小的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)出于一個個顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動的速度比大分子的速度慢。 為了定量地衡量混合液中各組分的流出順序，常常采 用分配系數(shù)Ka來量度。 Ka =（ Ve - Vo）/VI71是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。酶與底物,酶與競爭性抑制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，酶RNA與互補(bǔ)的RNA分子或片段,RNA與互補(bǔ)的DNA分子或片段等之間，都是具有專一

30、而又可逆親和力的生物分子對。 親和層析72親和層析的四個要素73常用的親和介質(zhì)及專一性配體74根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性,親和層析可以分為：共價親和層析疏水層析金屬離子親和層析免疫親和層析染料親和層析凝集素親和層析 75分配層析分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固

31、定相流動，稱為流動相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動相的帶動流經(jīng)固定相時，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動態(tài)分配。 紙上層析分配薄層層析分配氣相層析 76疏水層析與反相層析的基本原理77層析方法分離依據(jù)分辨率和速度 容量應(yīng)用離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的高快很大，不受限早期階段，可以處理大體積樣品，也可分批。凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離中等慢受樣品體積限制純化的后期親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化很高快視配體可大可小，不受限不適于早期，可分批吸附層析聚

32、焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離高快大，且不受體積限制純化最后階段疏水作用極性高快大，且不受體積限制任何階段，尤其是離子交換和鹽沉淀后。本節(jié)目錄785、電泳分離帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為：紙電泳 薄層電泳 薄膜電泳 凝膠電泳 自由電泳 等電聚焦電泳 顆粒在電場中的移動速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場強(qiáng)度、溶液pH值、離子強(qiáng)度及支持體的特性等外界條件的影響。 79制備式電泳通常以不含 SDS 的原態(tài) disc 進(jìn)行，以便回收具有活性的蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)樣本要先經(jīng)過部分純化，否則效果不佳，并先以分析式電泳確定所要色帶的位置。80本節(jié)目錄816、過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì) 膜過濾：采用各種高分子膜為