第十四章臨床遺傳

1、Clinical genetics第十四章 臨床遺傳運用醫(yī)學遺傳學理論知識，通過家系調(diào)查和各項臨床檢查來診斷、治療和預防遺傳病。遺傳病的診斷遺傳病的治療遺傳病的預防Clinical genetics遺傳病的診斷(diagnosis)診斷的類型及手段 臨癥診斷 癥狀前診斷 出生前診斷（產(chǎn)前診斷） 著床前診斷基因診斷臨癥診斷(Symptomatic diagnosis)遺傳病臨床癥狀出現(xiàn)后所作的診斷。一般手段： 病史、癥狀、體征、常規(guī)的實驗室檢查特殊手段： -系譜分析 -核型分析：染色體分析 -生化分析：酶水平、代謝產(chǎn)物等 -DNA分析：PCR 、 RFLP 、測序 癥狀前診斷 (presympt

2、omatic diagnosis)在某些遺傳病(如Huntington舞蹈病)可疑雜合子個體生育之前作出的診斷。家系調(diào)查和系譜分析基因診斷,見后出生前診斷(prenatal diagnosis)以羊膜穿刺和絨毛取樣術(shù)為主要手段，對羊水細胞及絨毛細胞進行遺傳學分析，以判斷胎兒的染色體或基因是否正常。出生前診斷的對象1、35歲以上的高齡孕婦；2、夫婦之一有染色體?。?、夫婦之一有單基因遺傳??；4、夫婦之一有先天畸形者；5、曾生育過遺傳病患者；6、有習慣性流產(chǎn)史；7、夫婦之一受到致畸因素影響；8、夫婦之一為遺傳病攜帶者。出生前診斷的途徑和方法羊膜穿刺：1418周 比較絨毛取樣術(shù)：79周臍帶穿刺術(shù)：1

3、8周胎兒鏡檢查：1518周超聲診斷儀檢查：任何時候X線照相術(shù)：16周從母血中分離胎兒細胞：1216周著床前診斷(preimplantation diagnosis)胚胎著床前對處于卵裂期的胚胎進行檢測，從而判斷胚胎是否攜帶有致病基因。取樣時間：第3天胚胎或第5天囊胚。輔助生殖時需采用。存在倫理學問題需解決?；蛟\斷(gene diagnosis)定義：通過檢測遺傳病患者的DNA或mRNA作出診斷?；蛟\斷的策略：1）從基因產(chǎn)物入手作診斷2）從基因定位入手作診斷3）從比較正常和異常基因的差異入手作診斷已知基因、已知突變的檢測等位基因特異性寡核苷酸雜交分析(allele-specific olig

4、onucleotide, ASO)：探針雜交基因芯片(gene chip)技術(shù)：快速、高效、敏感、經(jīng)濟、平行化和自動化DNA測序法（DNA Sequencing）：為最基本和最重要的實驗手段 PCR-ASO分析MELAS糖原累積癥突變基因檢出 III2第727位測序結(jié)果 III2第1071位測序結(jié)果abI2第727位測序結(jié)果 I2第1071位測序結(jié)果 cdDNA或RNA序列分析Gilbert發(fā)明的化學測序法和Sanger發(fā)明的雙脫氧終止測序法。以凝膠電泳為基礎(chǔ)的DNA自動測序儀和以毛細管電泳為基礎(chǔ)的DNA自動測序儀。以Roche/454、ABI/SOLiD和Illumina/Solexa為代表

5、的新一代高通量測序技術(shù)（第二代測序）的應用已實現(xiàn)了“10萬美元基因組”的目標?！跋乱淮鷾y序技術(shù)（第三代測序）” 將實現(xiàn)“1001000美元基因組”的目標。限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP) 變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoreris, DGGE) 單鏈構(gòu)型多態(tài)性(single-strand conformational polymorphism, SSCP) 變性高效液相色譜檢測(denaturing high performance liquid chrom

6、atography, DHPLC) 檢測已知基因、未知突變限制性片段長度多態(tài)性(RFLP) ：Lane 1 shows the markers. Lanes 2,5 and 8 show negative control. Lanes 3, 6, and 9 also show control. Lanes 4, 7, and 10 have evidence of gene rearrangement. Lane 11 is a 5% sensitivity control.RFLP用于苯丙酮尿癥的基因診斷根據(jù)異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA解鏈特性的不同，在部分變性條件下，異源雙鏈因有錯配區(qū)

7、的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時間短于同源雙鏈，表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線。變性高效液相色譜檢測(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)HomoduplexesHeteroduplexes未知基因、未知突變分析候選基因法（傳統(tǒng)法）：選擇與遺傳病相關(guān)聯(lián)的已知基因作為候選基因，通過家系調(diào)查和連鎖分析，確定易感/致病基因。外顯子捕獲或測序技術(shù)(exome capture or sequencing)：用于定位單基因遺傳病的致病基因及多基因遺傳病的易感基因。全基因組掃描法：用于定位多基因/多因素遺傳病的易感基因。標記= 0

8、.00= 0.10= 0.20= 0.30= 0.40D6S289-1.6817360.6964850.7777310.4655420.106374D6S1584-2.8884930.5609760.7286710.5017100.180457D6S422-0.8024740.1721580.3528480.2077980.031536D6S16910.4354981.5716981.2816750.7502940.231349D6S2763.8821253.0591172.1039981.1426860.357661D6S16182.0022782.0055581.5316980.89542

9、60.296443D6S1568-0.1008271.0760880.8411140.4241310.087045D6S2910.6325031.8146341.3696840.7601810.237437D6S1610-1.4724101.0112360.8772290.4412640.060830D6S1562-0.5674010.7903470.5790430.2885420.060859D6S1575-3.2311820.1508540.4412590.2990270.076821強直性脊柱炎的連鎖分析外顯子組捕獲技術(shù)外顯子組捕獲(exome capture and sequencin

10、g )技術(shù)通過全外顯子組掃描，并結(jié)合生物信息分析技術(shù)，以尋找遺傳病患者特有的SNP及單基因病的致病基因。技術(shù)平臺：羅氏公司推出的Nimblegen外顯子捕獲平臺；安捷倫科技公司推出的SureSelect 平臺。Ng等利用外顯子測序方法發(fā)現(xiàn)的導致米勒綜合征致病基因（未知病因遺傳病的致病基因）。采用外顯子捕獲技術(shù)已發(fā)現(xiàn)了近百種遺傳病的致病基因。 GWAS定位多基因病的易感基因全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS)是指在全基因組層面上，開展多中心、大樣本、反復驗證的SNP與疾病的關(guān)聯(lián)研究，以揭示遺傳病的相關(guān)基因。Stahl等應用GWAS法識別了7個

11、新的類風濕性關(guān)節(jié)炎的易感基因，包括IL6ST, SPRED2, RBPJ, CCR6, IRF5, PXK和AFF3。GWAS的優(yōu)點：效率高，重復性強，且適用于不同種族。已有1300余篇采用GWAS方法定位了200余種多基因遺傳病及腫瘤易感基因的論文發(fā)表。遺傳病的治療(treatment)常規(guī)治療單基因病的治療 禁其所忌、去其所余、補其所缺多基因病的治療外科手術(shù)、藥物或二者并用染色體病的治療性染色體病：補充激素常染色體?。簩ΠY治療上海市12種可治性罕見遺傳病的患病率及治療方法疾病患病率治療方法患者數(shù)/年苯丙酮尿癥（含四氫生物蝶呤缺乏癥）1:1.1萬低苯丙氨酸飲食/奶粉，補充BH4，L-多巴、5

12、-羥色氨1016人楓糖尿癥1:20萬限亮氨酸/異亮氨酸/纈氨酸飲食,補充維生素B10-1人酪氨酸血癥1:20萬低苯丙氨酸、酪氨酸飲食，補充1,3-環(huán)已二酮0-1人甲基丙氨酸血癥1:3.5萬限亮氨酸/纈氨酸/甲硫氨酸飲食，補充肉堿、維生素B12、甜菜堿4-5人多種羧化酶缺陷病1:6萬生物素1-3人高氨血癥1:5萬飲食治療，補充精氨酸、瓜氨酸、苯甲酸鈉1-2人肝豆狀核變性1:5萬低銅飲食，青霉胺治療3-4人先天性耳聾1:1萬人工耳蝸，助聽器15-20人戈謝病1:20萬酶替代治療，Cerezyme0-1人法布雷病1:20萬酶替代治療，F(xiàn)abrazyme0-1人粘多糖病1:10萬酶替代治療，Aldur

13、azyme1-2人糖原累積癥II型1:20萬酶替代治療，Myozyme1-2人基因治療(gene therapy)定義：應用DNA重組技術(shù)，替代、校正或增補患者細胞中有缺陷的致病基因，恢復這些基因的正常功能，以達到治療遺傳病的目的。種類與策略： 種類：體細胞與生殖細胞兩大類 策略：基因修正、替代、開放、抑 制、免疫基因等?；蛑委煵襟E靶細胞的選擇：干細胞為首選目的基因的克隆目的基因的轉(zhuǎn)移：活體直接轉(zhuǎn)移(in vivo)、在體轉(zhuǎn)移(ex vivo)。方法包括物理、化學和生物法（主要是病毒介導）目的基因的表達: 在重組病毒上裝上啟動子(promoter)或增強子(enhancer)等調(diào)控因子。安全

14、措施：保證轉(zhuǎn)移-表達系統(tǒng)的絕對安全。三種病毒載體特點的比較特點逆轉(zhuǎn)錄病毒慢病毒腺病毒病毒基因組RNA病毒RNA病毒雙鏈DNA病毒能插入的最大目的基因7.07.5 kb7.07.5 kb30 kb基因轉(zhuǎn)移途徑Ex vivoEx/in vivoEx/in vivo是否整合到宿主基因組中是是否感染細胞類型分裂細胞分裂/不分裂細胞分裂/不分裂細胞目的基因在體內(nèi)表達時間短長短引起宿主免疫反應的程度低低高是否可更換特異啟動子不需要可以可以是否會導致插入位點突變會會不會能否得到轉(zhuǎn)基因動物模型較難可以不能Gene therapy年份項目數(shù)各國政府批準的項目類型受試人數(shù)腫瘤基因標記遺傳病艾滋病心血管病其他199

15、62360-2510-153719972125834348.51.4-2000199938769.26.99.112.6-2.23278各國1996-1999年間基因治療臨床試驗項目統(tǒng)計數(shù)基因治療舉例腺苷脫氨酶(ADA)缺乏癥(AR或XR)：患者出現(xiàn)重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，首例ADA基因治療家族性高膽固醇血癥：LDLR基因治療胰囊性纖維化：CFTR基因治療血友病B：F:IX基因治療腫瘤： 免疫效應細胞等；細胞因子等；抑癌基因轉(zhuǎn)移腫瘤細胞等；封閉或切割癌基因等。Gene therapy for first patientAshanti Desilva who affectedSCID i

16、n 1990基因治療的失敗案例1999年賓夕法尼亞大學的科學家開展了鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(ornithine transcarbamylase, 簡稱OTC)缺陷癥的基因治療。該病患者因缺乏OTC基因的正常拷貝，抑制了機體對氨的清除作用。受試者是年僅18歲的JesseGelsinger（來自美國亞利桑那州）的學生?？茖W家構(gòu)建了減毒腺病毒和感冒病毒毒株，并以此為載體將正?？截惖腛TC基因?qū)氲交颊吒闻K。因腺病毒感染導致多器官衰竭(multiorganfailure)而不幸離世。而法國發(fā)生的SCID-X1（嚴重聯(lián)合免疫缺陷）患者接受基因治療后患上白血病，是因為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體插入到造血系統(tǒng)原癌基因LMO

17、2啟動子附近從而將LMO2激活所致。 近年基因治療成功案例疾病疾病類型受益病人數(shù)首次發(fā)表年代X-SCID免疫缺陷癥17/202000ADA-SCID免疫缺陷癥26/372002腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良神經(jīng)系統(tǒng)疾病2/42009Leber氏先天性黑矇全盲28/302008威-奧二氏綜合征免疫缺陷癥8/102010b地中海貧血癥血紅蛋白病1/12010血友病凝血疾病6/62011造血干細胞基因治療b地中海貧血癥遺傳病的預防繼發(fā)性預防(secondary prevention)帶有某種致病基因的個體在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)之前所作的預防。如出生前篩查、新生兒篩查、攜帶者檢出等。原發(fā)性預防(primary prev

18、ention)異?；蛐统霈F(xiàn)以前所作的預防。如遺傳咨詢等。遺傳咨詢類型前瞻性遺傳咨詢回顧性遺傳咨詢強制性遺傳咨詢指令性遺傳咨詢教育性遺傳咨詢/非指令性遺傳咨詢遺傳咨詢對象未婚青年的婚姻指導： 一方或雙方的家庭里可能有遺傳病患者，近親婚配？已婚夫婦的生育指導： 一方或雙方的家庭里有遺傳病患者，或該夫婦已出生過遺傳病患兒。遺傳咨詢步驟 明確診斷 家系調(diào)查和分析遺傳方式 估計再顯危險率：高、中、低三級 婚姻和生育指導避孕或絕育：10%禁止結(jié)婚：見婚姻法存在一定風險的咨詢對象生育遺傳病患者風險很小或病情很輕的咨詢對象希望領(lǐng)養(yǎng)、或輔助生殖的咨詢對象 制訂防治措施、定期隨訪單基因病再顯危險率的估計親代基因

19、型能推定AD: Aaaa 1/2AR: Dd Dd 1/4 2/3(雜合子)XD: XH YXhXh, XhY XHXhXR: XDY XDXd親代基因型能推定時再顯風險估計Recurrence risk of single-gene disorders Genotype of the couple being disclosedMode of inheritanceMating typeSeg. Freq. among progenyNormalCarrierAffectedADAaaa1/2-1/2AaAa1/4-3/4ARAAaa-1-Aaaa- 1/21/2AaAa1/42/41/4

20、Segregation frequencies among progeny under X-linked inheritanceMode of inheritanceMating typeSeg. freq. among progenyMaleFemaleNormalAffectedNormalAffectedCarrierXDXHYXX1-1-XYXHX1/21/21/21/2-XRXhYXX1-1XYXhXh-1-1XYXhX1/21/21/2-1/2XhYXhX1/21/2-1/21/2親代基因型能推定時再顯風險估計有信息提供能否定親代是雜合子的證據(jù)如血友病A (XR)家系：親代基因型不

21、確定時再顯風險估計Bayes逆概率定理前概率(prior probability)：按孟德爾分離律得出的理論概率。條件概率(conditional probability)：在某種特定遺傳假設的條件下，產(chǎn)生該特定情況的概率。聯(lián)合概率(joint probability)：前概率與條件概率所說明的兩個事件同時出現(xiàn)的概率。后概率(posterior probability)：是一個相對概率。是在假設特定的條件下，某一聯(lián)合概率在所有聯(lián)合概率中所占的比率。血友病家系(XR)概率II-5為HHII-5為Hh 前概率1/21/2條件概率14=1(1/2)4 = 1/16聯(lián)合概率16/321/32后概率16

22、/171/17血友病家系(XR)III-2為雜合子機會為1/34III-1與III-2兒子得病風險1/341/2=1/68；子代1/136Huntington舞蹈病家系(AD)43歲以前的發(fā)病風險為64%，25歲以前的發(fā)病風險為8%Huntington舞蹈病家系(AD)概率II-2為UuII-2為uu 前概率1/2=0.51/2=0.5條件概率1-0.64=0.361聯(lián)合概率0.180.5后概率0.260.74Huntington舞蹈病家系(AD)概率III-1為UuIII-1為uu 前概率 0.130.87條件概率1-0.08=0.921聯(lián)合概率0.120.88后概率0.120.88III-

23、1目前的發(fā)病風險為0.12酪氨酸血癥家系(AR)概率III2為HHIV2當然為HHIII2為HhIII2為HhIV2可能為HHIV2可能為Hh前概率(1/2)(1)=1/2(1/2)(1/2)=1/4(1/2)(1/2)=1/4條件概率12=112=1(1/2)2=1/4聯(lián)合概率(1/2)(1)=8/16(1/4)(1)=4/16(1/4)(1/4)=1/16后概率8/134/131/13再生一胎風險為1/131/2=1/26Hurler綜合征家系(AR)Hurler綜合征家系(AR)概率II-2和II-3為雜合子其它組成 前概率2/97/9條件概率(3/4)2=9/161聯(lián)合概率9/7256

24、/72后概率9/6556/65(9/65)(1/4) = 9/260染色體病再顯危險率的估計親代核型均正常：就是群體發(fā)病率雙親之一為染色體平衡易位攜帶者或嵌 合體，子代的再顯危險率就較高。如母親的核型為45,XX,-14,-21,+t(14q21q)其生殖細胞可有6種類型： 22,X,-14,-21,+t(14q21q) 23,X 23,X,-14,+t(14q21q) 22,X,-21 23,X,-21,+t(14q21q) 22,X,-1414與21平衡易位攜帶者子代的再顯危險率染色體病再顯危險率的估計如與正常的男性生殖細胞（23,X)受精后可出現(xiàn)下列情況：46,XX 正常45,XX,-1

25、4,-21,+t(14q21q) 攜帶者46,XX,-21,+t(14q21q) 很少成活45,XX,-14 致死45,XX,-21 致死46,XX,-14,+t(14q21q) 易位型21三體21三體綜合征的再顯危險率患者核型父親母親再顯危險率D/G易位正常攜帶者0.100.15攜帶者正常0.0521/21易位正常攜帶者1.00攜帶者正常1.0021/22易位正常攜帶者0.100.15攜帶者正常0.0521三體型正常正常0.01嵌合體正常正常小多基因病再顯危險率的估計多基因遺傳病的再顯危險率是由遺傳因素、環(huán)境因素共同作用決定的。因此只能通過群體發(fā)病率和家系中受累者的多少來加以估計。見表14-

26、17。Edwards公式：qr = qg（h2=70%80%, qg=0.1%1.0%）出生前篩查 通過測定母體血清和羊水甲胎蛋白(AFP) 篩查胎兒神經(jīng)管缺陷。遺傳篩查(genetic screening)遺傳篩查(genetic screening) 對35歲以上的孕婦，通過羊水細胞或 絨毛膜細胞的檢查，以篩查胎兒的染色體 畸變，如DOWN綜合征。新生兒篩查 在新生兒期對一些遺傳病進行群體篩查。 如苯丙酮尿癥、先天性甲狀腺功能減退癥、 先天性耳聾等。Guthrie細菌生長抑制試驗檢測新生兒血液中苯丙氨酸水平新華醫(yī)院遺傳性代謝病的篩查和診治體系新生兒疾病篩查中心遺傳性代謝病診治中心產(chǎn)院新生兒

27、篩查標本全國遺傳性代謝病檢測協(xié)作網(wǎng)標本美國CDC、衛(wèi)生部質(zhì)控遺傳性代謝病DNA庫遺傳性代謝病的診斷技術(shù)平臺串聯(lián)質(zhì)譜檢測GC-MS檢測HPLC檢測酶學測定基因診斷臨床治療與隨訪遺傳篩查(genetic screening)攜帶者檢出攜帶者：表型正常，但帶有某種致病基因或異常染色體的個體。AR遺傳病的雜合子個體XR遺傳病的雜合子女性AD遺傳尚未外顯的雜合子個體染色體平衡易位的攜帶者個體線粒體基因病表現(xiàn)型正常的雜質(zhì)攜帶者等遺傳登記和隨訪遺傳登記(genetic register) 是指某一地區(qū)的遺傳保健服務機構(gòu)對該地區(qū)某些嚴重的遺傳病家系進行登記的一項工作。遺傳隨訪(genetic follow-u

28、p) 是對已確診的遺傳病患者及其家屬作定期的門診檢查或家訪，以便動態(tài)地觀察患者及其家屬各成員的變化情況，同時給予必要的醫(yī)療服務。遺傳保健(Genetic care)遺傳保健 是遺傳病最根本的原發(fā)性預防。 它是指正常人群通過自身保護或醫(yī)療衛(wèi)生來避免和防止遺傳病的發(fā)生。防止環(huán)境污染糾正不良生活習慣：吸煙、酗酒等Healthy living style4 Nos living style No smoking; No excessive drinking No mould food; No sexual life when drunk4 Lows living style Low salt; Low sugar Low fat; Low cholesterol臨床遺傳服務中的倫理原則遺傳服務(genetic service) ：也是一種醫(yī)學服務，它是將遺傳學的知識和技術(shù)應用于解決人類自身的生、老、病、死的問題。因此，是一種應用遺傳知識和技術(shù)的醫(yī)學實踐。遺傳倫理學(genetic ethics)是規(guī)范遺傳服務中人與人之間的關(guān)系和行為的學科。 臨床遺傳服務的內(nèi)容 按照遺傳咨詢的要求，與病人及其家屬進行談話，并提供防治意見和婚育建議；按照遺傳病特殊檢查的指證，給患者進行染色體檢查或基因檢測，以明確診斷；根據(jù)基因治療的原則，給有條