《基因工程概論》課件chapt6

1、基因工程概論第一章 導(dǎo) 論第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的載體第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表達(dá)第六章 基因工程的基本技術(shù)第六章 基因工程的基本技術(shù)第一節(jié) DNA的提取和檢測第二節(jié) DNA切割、連接與細(xì)胞轉(zhuǎn)化第三節(jié) DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第四節(jié) Southern雜交技術(shù)第五節(jié) DNA的序列分析第六節(jié) 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)質(zhì)粒DNA的小量制備 將含有質(zhì)粒DNA的大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基中（含有相應(yīng)抗生素），在37下震蕩培養(yǎng)過夜，這樣質(zhì)粒DNA便隨著細(xì)菌的繁殖而得到了大量的擴(kuò)增。當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)物生長到對數(shù)晚期時(shí)，我們就可獲得很高產(chǎn)量的質(zhì)粒DNA。通過離心收集細(xì)菌，用堿性溶液處理使得細(xì)菌細(xì)胞

2、裂解，釋放出其中的質(zhì)粒DNA分子。在堿性條件下，宿主的線狀染色體DNA發(fā)生變性，但是閉環(huán)質(zhì)粒DNA雙鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開，所以當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確復(fù)位成為超螺旋分子。通過離心去掉細(xì)胞碎片、染色體DNA和其它雜質(zhì)，并將水相的質(zhì)粒DNA用乙醇沉淀出來，最后溶于TE緩沖液或純水中備用。SDS法小量制備植物基因組DNA的原理 在含有去污劑，如SDS或CTAB的溶液中，植物細(xì)胞會(huì)被裂解釋放出細(xì)胞核中的基因組DNA，通過氯仿/異戊醇的抽提和離心去除掉裂解液中的細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)以及其它雜質(zhì)，這時(shí)的基因組DNA分配在水相中。 然后用乙醇(或異丙醇)將水相的DNA分子沉淀出

3、來，最后溶于TE緩沖液或純水中備用。剪取新鮮的植物葉片約20mg，剪碎置于1.5ml離心管中；向離心管中緩慢加入液氮冷凍植物葉片；在液氮蒸發(fā)去2/3時(shí)，用自制研杵迅速磨碎葉片；立即加入300uL 65預(yù)熱的提取液搖勻，于65水浴約1hr，其間搖動(dòng)數(shù)次；加等體積氯仿/異戊醇（24:1）混勻，于12000 rpm離心5分；轉(zhuǎn)移上清液到另一干凈1.5ml離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻后靜置2min，14000rpm離心5min；傾去上清液并用200uL預(yù)冷乙醇（70%）清洗DNA沉淀，14000rpm離心5min；用槍頭小心吸去乙醇，自然風(fēng)干DNA后溶于50uL ddH2O中，置-20保

4、存?zhèn)溆?。植物基因組DNA的小量快速制備方案 DNA提取液的配方Ingredient of the genomic DNA extracting solution成 分Ingredient工作濃度working concentrationTrisCl（pH8.0）100mMEDTA（pH8.0）5mMNaCl500mMSDS1.25%PVP1%DNA的凝膠電泳檢測 通常，瓊脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺 (polyacrylamide)凝膠被用于核酸的分離研究、鑒定和純化DNA分子。也可以用于蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究。在電場當(dāng)中，帶電分子會(huì)以一定的速度移向相應(yīng)的電極，而且其遷移速度同電場的

5、強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，同分子的摩擦系數(shù)成反比的。所以，通過電泳就可以利用分子大小、構(gòu)型、形狀以及所帶凈電荷的不同而將混合物中的各成分分離。在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)。所以，在電場中核酸分子向正極泳動(dòng)。在特定電場強(qiáng)度下，DNA分子的電泳遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。 溴化乙錠(ethidiumbromide，簡稱EB)是一種核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的堿基之間，并在300nm波長的紫外光照射下放射出橘紅色的熒光，可用來顯現(xiàn)凝膠中的核酸分子。在凝膠電泳中，溴化乙錠染料可對核酸分子染色，在紫外光下便可以十分敏感而方便地檢測出凝膠介質(zhì)中DN

6、A譜帶。安全警示：EB是一種強(qiáng)的DNA誘變劑，使用時(shí)盡量避免觸及皮膚。電泳時(shí)有時(shí)使用到較高的電壓，要小心觸電。DNA的凝膠電泳檢測 瓊脂糖 是一種線性多糖，從紅色海藻瓊脂中提取的良好電泳介質(zhì)，其密度由瓊脂糖的濃度決定?；瘜W(xué)修飾的低熔點(diǎn)(LMP)瓊脂糖，因此在較低的溫度下便會(huì)熔化，可用于DNA片段回收制備電泳。聚丙烯酰胺凝膠 過硫酸胺與TEMED (N、N、N、N-四甲基乙二胺) 是單體丙烯酰胺的催化劑和誘變劑，它們使單體丙烯酰胺聚合成長鏈，長鏈與長鏈間就交聯(lián)成凝膠，鏈長和交聯(lián)的程度就決定了凝膠的孔徑，同時(shí)也決定了分離DNA的能力。DNA的凝膠電泳檢測 DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測 +-儀器 電泳

7、儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、移液槍；藥品 Agarose、 loading buffer、 TAE buffer、 EB（溴化乙錠）;上樣緩沖液（6X）配方 0.25% 溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯氰醇、 40%蔗糖；水溶液4保存。瓊脂糖and聚丙烯酰胺凝膠電泳 豆粕DNA質(zhì)粒DNA第六章 基因工程的基本技術(shù)第一節(jié) DNA的提取和檢測第二節(jié) DNA切割、連接與細(xì)胞轉(zhuǎn)化第三節(jié) DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第四節(jié) Southern雜交技術(shù)第五節(jié) DNA的序列分析第六節(jié) 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)第二節(jié) DNA切割、連接與細(xì)胞轉(zhuǎn)化DNA分子的酶切與凝膠電泳分離電泳紫外分析37 1h加反應(yīng)液CKMBuffer (10X) 2.

8、0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTTDNA分子的酶切與凝膠電泳分離DNA分子的連接POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH連接酶連接酶連接酶堿性磷酸酶2Pi寄主修復(fù)缺口載體自連或產(chǎn)生二具體等DNA分子的連接與細(xì)菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（competent cell）的制備在不含抗生素的LB平板上涂布大腸桿菌DH5，于37培養(yǎng)過夜(16-20h)；挑一個(gè)單菌落接種于25mL無菌的LB 培養(yǎng)液中, 37中速震蕩培養(yǎng)3h；將上述菌液冰浴5分鐘,然后在4 ,400

9、0rpm 離心10分鐘;將細(xì)菌沉淀用5mL 預(yù)冷的CaCl2（0.1M）重懸，冰浴一會(huì)后于4 4000rpm離心10分鐘；將細(xì)菌沉淀用1mL 預(yù)冷的CaCl2（0.1M）重懸，取200uL用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化,其余菌液加入20%的無菌甘油,搖勻后于-20保存?zhèn)溆? 轉(zhuǎn)化CK-重組菌落CK+DNA分子的連接與細(xì)菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的程序用冷的無菌槍頭吸取200uL感受態(tài)細(xì)胞到一新的離心管中,加入質(zhì)粒DNA后冰浴30分鐘；立即將轉(zhuǎn)化用的離心管置入42水浴中靜置90秒；迅速將離心管移入冰水混合物中冰浴1-2分鐘;加入800uL的LB培養(yǎng)基,混勻后于37水浴5分鐘；將離心管側(cè)向固定在搖床上,37緩慢震

10、蕩培養(yǎng)45分鐘;于室溫1000rpm離心5分鐘,棄取約800uL的培養(yǎng)液,再將剩余的培養(yǎng)液和細(xì)菌重懸,然后涂布到含有抗生素的LB平板上37選擇培養(yǎng)過夜(16h);檢測選擇平板上的抗性菌落, 并提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行鑒定. DNA片段的回收與純化 1、用干凈的刀片將單一目標(biāo)DNA條帶從瓊脂糖凝膠上切下，盡量切除多余的凝膠，放入1.5ml離心管中，稱取重量。2、加3倍體積的溶膠緩沖液PN（如果凝膠重為0.1g，其體積可視為100l，則加入300l溶膠液。如凝膠更大，可按比例加大溶膠液用量），56水浴10min，不斷溫和上下翻轉(zhuǎn)離心管，確保膠塊溶解，如果還有未溶解的膠塊，可再加入部分溶膠緩沖液或繼續(xù)放置

11、幾分鐘，以使膠塊溶解。3、取一個(gè)新的離心吸附柱，放入2ml廢液收集管中，將上一步所得溶液加入離心管吸附柱，12000rpm離心30s-60s，倒掉廢液收集管中的廢液。4、在離心吸附柱中加入700l漂洗液，12000rpm離心30s-60s，棄掉收集管中的廢液。5、在離心吸附柱中加入500l漂洗液，12000rpm離心30s，棄掉廢液收集管中的廢液，如果樣品中雜質(zhì)蛋白及鹽類較多可多重復(fù)一次。6、12000rpm離心2min，盡量除去漂洗液，然后可在37溫箱中烘烤10min，使酒精徹底揮發(fā)。7、取出離心吸附柱，放入一個(gè)干凈的離心管中，加入適量的65-70水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液，室溫放置2-5min，

12、12000rpm離心1min，如要想得到更多的DNA，可將所得的溶液重新加入離心吸附柱，重復(fù)此步操作。8、取1-3l得到的溶液，瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度與純度。第六章 基因工程的基本技術(shù)第一節(jié) DNA的提取和檢測第二節(jié) DNA切割、連接與細(xì)胞轉(zhuǎn)化第三節(jié) DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第四節(jié) Southern雜交技術(shù)第五節(jié) DNA的序列分析第六節(jié) 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)第三節(jié) DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)The polymerase chain reaction (PCR) is an enzymatic synthesis approach to DNA. It allows the rapid manufacture

13、of large quantities of specific DNA sequences without the need for cloning in E. coli, growth of the bacteria and isolation of the DNA. The reaction can take place on just one single molecule of target DNA and has found application in many areas of science, from DNA cloning and sequencing to Forensi

14、c science and biosystematics. PCR技術(shù)是一種模擬DNA體內(nèi)復(fù)制過程的體外DNA復(fù)制過程，在一個(gè)離心管的緩沖液體系中，加入DNA模板，dNTPs, 引物和DNA聚合酶，然后通過變性、退火、延伸三個(gè)溫度的不斷循環(huán)，使得目標(biāo)DNA得到快速大量的復(fù)制。 PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和醫(yī)療事業(yè)，比如DNA的克隆，序列分析，醫(yī)學(xué)診斷以及生物系統(tǒng)發(fā)生科學(xué)的研究等。 反應(yīng)需要兩條合成的寡核苷酸片段和耐熱的DNA聚合酶。一般用Taq DNA聚合酶，是從棲熱水生菌（Thermus aquaticus ）中提取出來的。 兩條引物分別和正義鏈和反義鏈的 3 端結(jié)合，然后朝著彼此的3

15、-OH 方向延伸。Polymerase Chain Reaction（PCR） The reaction requires two synthetic oligonucleotide primers and a thermostable DNA polymerase. The latter is usually the thermostable DNA polymerase from the thermophile, Thermus aquaticus, known as Taq. The primers are chosen to match the 3 end of the sense s

16、trand of the target sequence, and the 3 end of the antisense strand. This means that they will have their 3-OH groups oriented towards each other. Polymerase Chain Reaction（PCR） Polymerase Chain Reaction（PCR） 947256 反應(yīng)的第一步是加熱 DNA 到95C 進(jìn)行變性（denature） 使雙鏈解離為單鏈，解除變性條件后在較低的溫度50C下引物退火（annealed）結(jié)合到目標(biāo)序列上，然

17、后在72C下， 在dNTPs存在的情況下， DNA 聚合酶運(yùn)用使引物序列延伸（ extends ） 。熱穩(wěn)定的酶不僅可以使DNA快速合成, 而且在較寬的溫度范圍內(nèi)都能催化DNA合成。 三個(gè)步驟：變性, 退火 和 延伸 PCR循環(huán): 一般 25-40 個(gè)循環(huán). 每個(gè)循環(huán)都使目標(biāo)序列翻倍從而PCR可以快速擴(kuò)增Polymerase Chain Reaction（PCR） 947256 The first step of the reaction is to heat the DNA to around 95C to denature it and separate the two strands.

18、The primers are annealed to their target sequences at a lower temperature, usually around 50C and the DNA polymerase then extends the primer sequence using dNTPs at 72C. The thermostable enzyme not only allows fast DNA synthesis, but can withstand the temperatures used to denature the DNA. These thr

19、ee steps：denaturation, annealing and extension form a PCR cycle: A typical amplification will have around 25-40 cycles. Each cycle will double the amount of the target sequence resulting in a very rapid amplification:Polymerase Chain Reaction（PCR） PCR 擴(kuò)增過程中片段增殖的計(jì)算 隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，長鏈目標(biāo)片段增加的值為 2(n+1), 而短鏈目

20、標(biāo)片段則以幾何倍數(shù)增加值為 2(n+1) 2(n+1)。 20個(gè)循環(huán)后, 目標(biāo)片段大約增加 1 百萬倍。 PCR 擴(kuò)增過程中片段增殖的計(jì)算 The amplification cycles increase the number of long strands arithmetically 2(n+1), whereas the short target sequences increase exponentially 2(n+1) 2(n+1). After 20 cycles, the target sequence has been amplified over 1 million-fo

21、ld. PCR 使用的引物需特異性與目標(biāo)序列匹配， 如果引物與DNA分子的其他部位結(jié)合, 非特異擴(kuò)增將產(chǎn)生。 引物與目標(biāo)序列的特異性結(jié)合取決于溫度, 每對引物最適的溫度要通過實(shí)驗(yàn)獲得。 寡核苷酸引物的長度一般為 20-25 個(gè)堿基，GC 含量一般為 50% 左右，這樣退火溫度在52-58C之間。很長的寡核苷酸引物或高的GC含量 需要很高的溫度，而短的寡核苷酸引物或低的GC含量則需要較低的溫度。對于 17-25 個(gè)堿基的引物, Tm的計(jì)算為: 最適的退火溫度一般比 Tm低3-5C。 Primer design and cycle optimization The primers used in

22、PCR need to be specific to the target sequence. If the primers anneal to other parts of the DNA molecule, then non-specific templates will be synthesised and compete with the desired target sequence in the amplification. The specificity of primer annealing is primarily determined by temperature, and

23、 the optimum temperature for any given pair of primers is determined experimentally. Oligonucleotide primers of around 20-25 bases long with a %GC content of around 50% will specifically anneal at 52-58C. Longer oligonucleotides or higher GC content will need higher temperatures, whilst shorter olig

24、onucleotides and lower GC contents need lower temperatures. For an oligonucleotide 17-25 bases long, the melting temperature is given by: The optimum annealing temperature is usually 3-5C below the melting temperature. Primer design and cycle optimization 1、所設(shè)計(jì)引物長度范圍為18-27堿基，最長不超過38，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致延伸溫度大于74，

25、不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。 2、引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則會(huì)容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)率增加。引物退火溫度在50-70之間，上下引物之間退火溫度相差不超過5。 3、GC含量在40-60%之間，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。 4、3末端最好不是A，3末端為A的錯(cuò)配效率明顯高于其它三個(gè)堿基。引物設(shè)計(jì)原則PCR反應(yīng)體系的確立WaterBuffer（10）Mg+（25mM）dNTPs（10mM）Primer1（10uM）Primer2（10uM）Taq（5U/uL）Te

26、mplets12.821.60.4110.21128201641010220uL反應(yīng)體系中各成分的母液濃度及加入量PCR擴(kuò)增程序舉例Tem.9494567272Time00:08:0000:00:3000:00:4000:01:0000:07:00Cycles35PCR反應(yīng)的應(yīng)用 廣泛應(yīng)用于科研和實(shí)際檢測中，用于DNA 研究、序列分析、基因表達(dá)測定、從cDNA庫放大特定克隆、構(gòu)建基因圖、進(jìn)化分析、生物證據(jù)分析、醫(yī)學(xué)研究與臨床檢驗(yàn)、性別控制、轉(zhuǎn)基因生物檢測等。PCR擴(kuò)增結(jié)果分析舉例 M 1 2 3 4 5 6 7 MM, marker;1-2, PCR for CP4-EPSPS gene; 3

27、-4, PCR for 35S Promoter; 5-6, PCR for lectin gene; 7, Negtive control.第六章 基因工程的基本技術(shù)第一節(jié) DNA的提取和檢測第二節(jié) DNA切割、連接與細(xì)胞轉(zhuǎn)化第三節(jié) DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第四節(jié) Southern雜交技術(shù)第五節(jié) DNA的序列分析第六節(jié) 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)第四節(jié) Southern雜交技術(shù) 雜交原理：在特定的條件下，含有互補(bǔ)序列的兩條核苷酸單鏈或是單鏈DNA與RNA可以通過堿基互補(bǔ)配對而變成雙鏈結(jié)構(gòu)，即生成較為穩(wěn)定的DNA/DNA或DNA/RNA雜種分子。所以，可以利用被標(biāo)記的一段核苷酸序列作為探針來分析被檢測DNA中

28、是否含有和探針同源的目標(biāo)序列。 凝膠電泳分離：多數(shù)核酸雜交試驗(yàn)中，都先要將經(jīng)凝膠電泳分離的DNA或RNA分子轉(zhuǎn)移到濾漠上，然后再進(jìn)行雜交分析。常用的濾膜有尼龍濾膜和硝酸纖維素濾膜等。 核酸印跡轉(zhuǎn)移(Nucleic acid blotting)：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固定支持物濾膜上則稱核酸印跡轉(zhuǎn)移法，常見的有電泳凝膠核酸印跡轉(zhuǎn)移法和菌落或噬菌斑印跡法等。轉(zhuǎn)膜 采用毛細(xì)管洗脫法將RNA自凝膠轉(zhuǎn)移至尼龍膜。操作步驟如下：1、以玻璃板作平臺，放在托盤上，濾紙用10 SSC蘸濕后平鋪在玻璃板上，往托盤中加入10 SSC，使液面稍低于平臺表面，濾紙潤濕后，用玻璃棒趕出濾紙與玻璃板間的氣泡。2、用l0 SSC浸

29、泡凝膠30min，把浸泡好的凝膠翻轉(zhuǎn)置于平臺上濕潤的濾紙中央。3、在凝膠上方放置濕潤的尼龍膜，趕出濾膜與凝膠之間的氣泡。4、用DEPC水浸濕與凝膠同樣大小的濾紙，濕潤的濾紙放置在濕潤的尼龍膜上方，趕出其間滯留的氣泡，上面再放置3層同樣大小的濾紙。5、切一疊稍小于濾紙的吸水紙，將其放置在濾紙的上方，并在吸水紙的上方放一塊玻璃板，然后用500g的重物壓實(shí)。6、使上述RNA轉(zhuǎn)移持續(xù)48h，紙巾浸濕后，及時(shí)更換新的紙巾。7、轉(zhuǎn)移結(jié)束后，在尼龍膜上用鉛筆標(biāo)記凝膠加樣孔及加樣的順序。8、將尼龍膜放在兩層濾紙中間，80烘烤2h，室溫保存尼龍膜待用。預(yù)雜交 1、配置預(yù)雜交液：于50ml大離心管中分別加入9ml

30、 ddH2O、3ml 5 HSB、1.5ml Denhardts，混勻后置65水浴。2、Carrier DNA（鮭精DNA：10mg/ml）變性：將盛有Carrier DNA的離心管放入沸水中煮7min，變性后迅速放于冰浴中。3、待50ml大離心管中的預(yù)雜交液澄清后，加入500l變性后的Carrier DNA，混勻后倒入雜交管中。4、雜交膜用2 SSC潤濕，正面朝里，反面接觸管壁，放入雜交管中，使預(yù)雜交液浸潤雜交膜。蓋好蓋子后置于65溫箱中，振蕩預(yù)雜交56h（新膜）或2h（舊膜）。標(biāo)記探針1、離心管中加25ng探針，補(bǔ)充ddH2O到15l后在沸水浴7 min，變性后迅速放于冰浴中。2、依次加入

31、5l 5 OLB，2l牛血清蛋白（BSA），1l Klenow酶（5U/l），稍微離心后，混勻。加入2l-32PdCTP，小心地用槍頭吸幾次，混勻。3、37，溫育2h。4、標(biāo)記好的探針中加入等體積的1 TE（25l），1/10體積的3mol/L的NaOH（5l），混勻后變性5min。5、加入500l的預(yù)雜交液。雜交、洗膜和放射自顯影雜交：將標(biāo)記好的探針，加入到已充分與膜預(yù)雜交好的預(yù)雜交液中，混勻，65，雜交過夜。洗膜和放射自顯影：1、用42的洗脫液（2 SSC，0.5% SDS）和洗脫液（0.2 SSC，0.5% SDS）分別洗脫1-2次，每次15min。2、洗膜后用濾紙將膜吸干，然后用保鮮膜

32、包好，注意除去氣泡。放至于磷屏（BIO-RAD）中，曝光2-5天后，用磷屏儀掃描。第四節(jié) Southern雜交技術(shù)Southern DNA印跡雜交X顯像圖片檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù)第六章 基因工程的基本技術(shù)第一節(jié) DNA的提取和檢測第二節(jié) DNA切割、連接與細(xì)胞轉(zhuǎn)化第三節(jié) DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第四節(jié) Southern雜交技術(shù)第五節(jié) DNA的序列分析第六節(jié) 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)雙脫氧末端終止法DNA序列分析的原理 在用DNA聚合酶復(fù)制核苷酸鏈時(shí)，如果在反應(yīng)物中加入一定量的某一種2，3-雙脫氧核苷酸, 如ddTTP，就會(huì)在應(yīng)當(dāng)摻入dT的位置摻入ddT。由于ddT核苷酸的3碳原子不含有羥基而不能和下一

33、個(gè)核苷酸的5碳原子上的磷酸根結(jié)合形成磷酸二脂鍵，所以DNA鏈就不能繼續(xù)向后延伸。 Sanger據(jù)上述原理設(shè)計(jì)了DNA測序的末端終止法。測序時(shí)要進(jìn)行4個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)中有一種ddNTP用32P標(biāo)記，并且在4個(gè)反應(yīng)中分別加入一定比例的dATP, dTTP, dGTP和dCTP。 這樣反應(yīng)一段時(shí)間后，每個(gè)反應(yīng)中都會(huì)生成一系列由對應(yīng)的那種ddNTP結(jié)尾的長短不一的DNA片段，而且這些片段的5端序列是相同的。最后，將反應(yīng)物變性后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經(jīng)放射自顯影后就可以讀出DNA的堿基順序。535A G C TATCAGCGAAT末端終止法DNA序列的分析原理示意圖第六章 基因工程的基本技術(shù)第

34、一節(jié) DNA的提取和檢測第二節(jié) DNA切割、連接與細(xì)胞轉(zhuǎn)化第三節(jié) DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第四節(jié) Southern雜交技術(shù)第五節(jié) DNA的序列分析第六節(jié) 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)第六節(jié) 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)1、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展2、植物表達(dá)載體的構(gòu)建3、植物轉(zhuǎn)基因的過程4、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定作物轉(zhuǎn)基因育種的發(fā)展優(yōu)勢擴(kuò)大了作物育種的基因庫 轉(zhuǎn)基因育種打破了常規(guī)育種的物種界限，來源于動(dòng)植物和微生物的有用基因都可以導(dǎo)入作物，培育成具有某些特殊性狀的新型作物品種。提高了作物育種的效率 縮短育種年限，單一性狀改良減輕了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對環(huán)境的污染 可以減少化學(xué)殺蟲劑對棉農(nóng)及天敵的傷害，大幅度降低用于購買農(nóng)藥和蟲害防治的費(fèi)用。另外，

35、農(nóng)用化肥的利用率將極大地提高，這對于有效減少農(nóng)田土壤中的化肥污染具有積極的意義。拓寬了作物生產(chǎn)的范疇 轉(zhuǎn)基因作物提供的農(nóng)產(chǎn)品范圍得到了極大的拓寬，各種有價(jià)值的蛋白產(chǎn)品都可以利用植物反應(yīng)器進(jìn)行高效生產(chǎn)，番茄、馬鈴薯、萵苣和香蕉等作物已被成功用于生產(chǎn)口服疫苗。另外，轉(zhuǎn)基因作物還可以用來生產(chǎn)各種工業(yè)原料，比如纖維素、海藻糖和可降解塑料等。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因槍法植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)花粉管通道法其它方法優(yōu)點(diǎn)：低成本易操作、轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)低、導(dǎo)入片段的確定性好。缺點(diǎn)：受作物基因型的影響較大優(yōu)點(diǎn)：低成本易操作、不受基因型影響、不需要經(jīng)過組織培養(yǎng)可以獲得轉(zhuǎn)基因種子。缺點(diǎn)：導(dǎo)入片段的確定性差、轉(zhuǎn)化效率很低。優(yōu)點(diǎn)：不受作

36、物基因型的限制。缺點(diǎn)：成本高、轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)高、導(dǎo)入片段的確定性差聚乙二醇法、顯微注射法、激光介導(dǎo)法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法植物轉(zhuǎn)基因的原理Agrobacterium-mediated plant transformation基因槍法植物轉(zhuǎn)基因的原理Plant transformation via microprojectal bombardment第四節(jié) 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)1、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展2、植物表達(dá)載體的構(gòu)建3、植物轉(zhuǎn)基因的過程4、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定pCAMBIA1301質(zhì)粒T-Border(right)Nos 3Gus35S5NcoI35S5Hyg(R)T-Border(left)3

37、5S3HinDIIISalIBamHIEcoRIBstEIIpCAMBIA130111837bpLac ZpCAMBIA1301pBS-RSP1/235SHyg(R)T3 PGusRSP2LacZNcoIpCAM-GusBam HIHind IIIKpnIBam HIKpnIHyg(R)T7 PGusRSP1KpnIBamHIGusNos3pCAM-RSP1/2-GusHyg(R)35S35S35SRSP2RSP1KpnI用KpnI和BamHI雙酶切后連接BamHINos3Nos3LBRB(1715 bp)First intron(1182 bp)LBLBRBRB水稻蔗糖合酶基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Gu

38、s基因的表達(dá)載體構(gòu)建第四節(jié) 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)1、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展2、植物表達(dá)載體的構(gòu)建3、植物轉(zhuǎn)基因的過程4、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定基因槍轟擊子彈的制取 1、稱20mg（0.02g）PVP放入一干燥潔凈的1.5ml離心管內(nèi)，加入1ml無水乙醇，使其溶解，濃度為20mg/ml的母液。 吸出12.5l母液，稀釋至5 ml，使其終濃度為0.05mg/ ml。3、稱2.mg 1M金粉，放入一干燥潔凈的1.5ml離心管內(nèi)用1ml無水乙醇進(jìn)行3次清洗（渦旋，短暫離心，吸出。注意：此時(shí)有少量金粉被粘在管壁上）。加入100l 0.05mol/L 亞精胺，渦旋混勻，超聲波處理510s（去除電荷）。5、加入5l質(zhì)粒D

39、NA（2g/l）混勻。邊渦旋邊加入100l 1mol/L CaCl2，室溫靜置10min。6、用1ml乙醇清洗5次，方法同上。7、用3ml 0.05mg/ml PVP將金粉稀釋在一個(gè)10ml的大離心管中。8、打開N2總閥，調(diào)整減壓閥，使N2壓力在0.4左右，用純度為99.997% N2干燥管15min。停止N2氣流，然后切割管，使其長于平臺10cm。9、將切割的管的一端與注射器相連，渦旋金粒子溶液并迅速將該溶液轉(zhuǎn)入該切割的管，使其每一末端均留有6cm的空隙。10、迅速將上步盛有溶液的管置于支持物上并使溶液在管中停留3min，標(biāo)記其充滿的位置。用注射器緩慢移動(dòng)溶液剛好經(jīng)過右側(cè)標(biāo)記。使管旋轉(zhuǎn)180，將溶液全部倒出。11、使管旋轉(zhuǎn)30s，打開N2在0.350.4rpm，旋