dna體外擴增技術總結(jié)

1、dna體外擴增技術總結(jié)目的基因的獲取及體外擴增技術概述在基因的研究及體外人工復制過程中，我們通常把需要研究的 基因稱為目的基因?；蚬こ塘鞒痰牡谝徊骄褪谦@得目的DNA片段, 如何獲得目的DNA片段就成為基因工程的關鍵問題。一般來說，目 的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構(gòu)建感興趣的生物個體的基 因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選 模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克?。涣硪活愂抢?PCR擴增技術甚至化學合成法體外直接合成目的基因，然后將之克 隆表達，常用的方法有PCR法、cDNA法及建立基因文庫等。PCR法技術及原理聚合酶鏈式反應(Polymerase Chai

2、n Reaction)，簡稱 PCR， 是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段。它是一種體外 酶促合成，擴增特定DNA片段的方法。1985年由美國Karray等學 者首創(chuàng)了 PCR技術，并由美國Cetus公司開發(fā)研制。隨著科學技術 的發(fā)展和突破，PCR技術已在多個領域得到廣泛地應用，如微生物 檢測、獸醫(yī)學、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面。PCR技術模擬DNA的天然復制過程，基于DNA的半保留復制原 理，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物，該原理主 要包括3個基本反應過程：變性一一退火一一延伸。變性主要是指 雙鏈DNA的變性，即雙鏈DNA經(jīng)加熱至93C左右，其熱穩(wěn)定性降 低，配對堿基之間的氫鍵

3、斷裂，使雙鏈DNA成為單鏈，以便與引物 結(jié)合。退火是指單鏈DNA在溫度降低時與引物的復性（稱為退火）。 在此過程中，引物與單鏈DNA模板仍然按照堿基互補的方式配對。 延伸是指引物與DNA模板按堿基互補的原則配對后，在TaqDNA聚 合酶的作用下，以dNTP為反應原料，進行體外的半保留復制，合 成一條新的與模板DNA鏈互補的新鏈。經(jīng)重復循環(huán)變性一一退火 延伸3個過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種 新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一次循環(huán)需23min，2 3h就能將目的基因擴增、放大幾百萬倍。一般單一拷貝的基因循 環(huán)253O次，DNA可擴增XXX萬XXX萬倍。由于該技術具有較強的靈敏

4、度，由于產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方 式增加的，能將皮克量級的起始待測模板擴增到微克水平。能從 XXX萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度 可達3個RFU（空斑形成單位）；在細菌學中最小檢出率為3個細 菌。同時對標本的純度要求低，不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞， DNA粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、 體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織cDNA文庫法cDNA為具有與某mRNA（信使RNA）鏈呈互補的堿基序列的單鏈 DNA，或此DNA鏈與具有與之互補的堿基序列的DNA鏈所形成的DNA 雙鏈。與RNA鏈互補的單鏈DNA，以其RNA為模板，在適當引物的 存在下，

5、由依賴RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）的作用而合成，并 且在合成單鏈cDNA后，在用堿處理除去與其對應的RNA以后，以 單鏈cDNA為模板，由依賴DNA的DNA聚合酶或依賴RNA的DNA聚 合酶的作用合成雙鏈cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA， 在遺傳工程方面廣為應用。在這種情況下，mRNA的cDNA，與原來 基因的DNA (基因組DNA)不同而無內(nèi)含子；相反地對應于在原來 基因中沒有的而在mRNA存在的3/末端的多A序列等的核苷序列 上，與exon序列、先導序列以及續(xù)序列等一起反映出mRNA結(jié)構(gòu)。由于真核生物基因組DNA非常龐大，而且含有大量的重復序列， 很難直接分離得到靶

6、基因片段，而cDNA則來自反轉(zhuǎn)錄的RNA，不 含冗余序列，通過特異性探針篩選cDNA文庫，可以較快的分離得 到相關基因。同時由于RNA分子敏感脆弱，自然狀態(tài)下難以被擴增， 因此為了研究mRNA所包含的信息，一般將其反轉(zhuǎn)錄為穩(wěn)定的雙螺 旋DNA分子(即cDNA)在插到自我復制的載體中即可。此過程包含5個階段：總RNA的提取。細胞中總RNA包含mRNA，rRNA，tRNA以 及一些小RNA (sRNA)，一個典型的動物細胞總RNA含量中，rRNA 占 XX%XX%，tRNA 和 sRNA 約占 XX%XX%，而 mRNA 只占 1%5%。 同時由于mRNA為單鏈，容易受核酸酶攻擊被破壞，因此要保證

7、環(huán) 境和實驗器皿沒有被RNA酶污染。從而保證被提取物良好的存活率。 思想?yún)R報專題總RNA抽提方法有很多種，目前實驗室常用的方法是 用異硫氰酸胍一苯酚抽提法，使用Trizol試劑進行。除此之外還 有硅膠模純化柱法等。mRNA的純化。真核細胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征 是具有5端的帽子結(jié)構(gòu)和3端的polyA尾巴，此結(jié)構(gòu)為真核生 物mRNA的提取提供了極為方便的選擇性標志。試驗中常用寡聚纖 維素色譜柱法獲得高純度的mRNA，在高鹽緩沖液下，mRNA被特異 性結(jié)合到色譜柱上，再用低鹽或蒸餾水洗脫，經(jīng)兩次色譜柱純化后 即可得高濃度mRNA。目前許多商業(yè)試劑盒也可以用作mRNA的純化， 并且有相當好的

8、效果。操作簡便，快捷且靈敏度較高。cDNA的合成。cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈的合成。 第一鏈是一 mRNA為模版，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA.該酶和成DNA時需 要引物引導，常用的引物為oligodT。第二鏈cDNA的合成是以第 一鏈為模板，以DNA聚合酶催化。cDNA文庫的構(gòu)建。由于cDNA的長度一般在0.58kb， 常用噬菌體類載體和質(zhì)粒做載體，將cDNA重組到載體上。合成的cDNA與載體 DNA進行連接一般有3種方法： 借助于末端轉(zhuǎn)移酶的3 -OH端合成均聚物的能力，雙鏈 cDNA和線性化載體DNA的3 -OH端分別加上均聚核苷酸鏈；通過粘性末端連接。然后重組的載體DNA分

9、子在一定條件下轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，形 成攜帶質(zhì)粒的菌株。當不同重組的DNA含有不同的cDNA基因時，整個轉(zhuǎn)化子含 有來自mRNA群體的各種cDNA基因，這樣的轉(zhuǎn)化子群體構(gòu)成該 mRNA全部遺傳信息的cDNA基因文庫。（5）基因文庫的篩選。基因文庫的篩選是指通過某種特殊的 方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆過程。用于從cDNA文 庫中篩選和鑒定目的cDNA的方法主要有核酸雜交，免疫學雜交檢 測，cDNA同胞選擇，PCR篩選法等。化學合成法自然界中有些組織特異性mRNA含量很低，很難用cDNA法克隆; 同時有些基因比較短，如：生長激素釋放抑制激素基因、腦啡肽基 因、胰島素基因、干擾

10、素基因等，采用基因文庫方法合成過程比較 復雜而且時間成本比較高，相比采用化學的方法合成成本更低，這 就需要我們采用化學的方法對其進行合成。化學合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個 個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應，包括：基團保護、分 離、縮合、分離、去保護五大操作單元。同時DNA化學合成不同于 酶促的DNA合成過程從5-3方向延伸，而是由3端開始，其合 成法的前提必須是已知目的基因的DNA序列，一般情況下化學合成 的DNA片斷一般局限在200bp以內(nèi)。從反應機理上來講，DNA化學合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、 亞磷酰胺三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。 目

11、前，一般DNA合成都采用固相亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，此 方法具有高效、快速偶聯(lián)等優(yōu)點，已在DNA化學合成中廣泛使用。其合成方式根據(jù)所合成DNA片段的大小一般分成三種：（1）小片段粘接法：分別合成12-15bp的單鏈DNA小片段。 片斷之間有互補區(qū)，混合退火形成有斷點的雙鏈，再由T4 DNA ligase連接成完整雙 鏈。（2）補釘延長法：分別合成12-15bp的單鏈DNA小片段及 20-30bp的單鏈DNA中片段。片斷之間有局部互補區(qū)，可相互作為另一個片斷延長的引 物，用Klenow酶延伸成完整雙鏈。（3）大片段酶促法：分別合成40-50bp的單鏈DNA大片段。 片斷之間有局部互補區(qū)，可

12、相互作為另一個片斷延長的引物，用Klenow酶延伸成完整 雙鏈。三種方法各有利弊：小片段粘接法中化學合成DNA的單鏈片段 愈短，收率愈高；但化學合成的份額較大，成本較高，由于大片段 化學合成的收率極低，如合成50bp的DNA單鏈大片段的總收率僅 XX.X%。故一般采用大片段酶促法，其化學合成的份額較小，成本 較低；隨著生命科學和分子生物學等相關基礎學科的發(fā)展，分子生物 相關領域也在不斷創(chuàng)新。生物基因工程，雜交育種，DNA檢測等一 系列技術也越來越多的應用到了我們的生活中，包括工業(yè)，農(nóng)業(yè)， 畜牧醫(yī)療等行業(yè)，而目的基因的獲取作為這些工作的第一步，尤其 顯得重要。近年來，越來越多的基因技術被用在醫(yī)療

13、診斷，藥物研 發(fā)治療領域，尤其癌癥，艾滋等一系列惡性疾病的診斷與治療中， 相信隨著分子生物這一學科領域的持續(xù)發(fā)展，這些惡性疾病被攻克 為期不遠。參考文獻：1李瑩.DNA體外擴增技術一聚合酶鏈式反應(PCR) J -沈陽師范學院學報(自然科學版).20XX,18(4) 2鄧小紅，任 海芳.PCR技術詳解及分析J-重慶工商大學學報(自然科學 版).20XX,24(1) 3鄭景生，呂蓓.分子植物育種J-分子 植物育種20XX,1(3)朱玉賢，李毅，鄭曉峰.現(xiàn)代分子生物學(第3版).北 京:高等教育出版社，20XX： 167176毛新國，景蕊蓮，孔秀英，趙光耀，賈繼增.幾種全長 cDNA文庫構(gòu)建方法比

14、較J-遺傳.20XX,28(7) 6李鵬，劉 文忠，栗艷.三種獲取目的基因的PCR方法J-乳業(yè)科學與技 術.20XX,(4) : 195198 7張京生，董自政.化學合成DNA片 段的鑒定及純化J-軍事醫(yī)學科學院院刊.1990,(04)8段海燕，章錦才，黃萍，張?zhí)N惠.四種方法獲取DNA用 于檢測IL-1基因多態(tài)性的比較分析J-華西口腔醫(yī)學雜志20XX,19(1)9孫春曉，于常海.基因克隆的常用方法介紹J -生理 科學進展.20XX,31(1)篇二：核酸體外擴增技術創(chuàng)新助手報告主題分析報告創(chuàng)新助手平臺提供北京萬方軟件股份有限公司20XX-06-27報告目錄報告核心要素I一、主題簡介1二、主題相關

15、科研產(chǎn)出總體分析12.1文獻總體產(chǎn)出統(tǒng)計12.2學術關注趨勢分析2三、主題相關科技論文產(chǎn)出分析23.1中文期刊論文23.1.1近十年中文期刊論文分布列表23.1.2中文期刊論文增長趨勢33.1.3發(fā)文較多期刊43.1.4發(fā)文較多的機構(gòu)43.1.5發(fā)文較多的人物53.1.6核心期刊分布數(shù)量對比53.1.7最近相關中文期刊論文63.1.8被引較多的相關期刊論文.73.2學位論文83.2.1近十年學位論文年代分布列表83.2.2學位論文增長趨勢93.2.3碩博學位論文數(shù)量對比.103.2.4發(fā)文較多的機構(gòu)103.2.5發(fā)文較多的人物103.2.6最近相關學位論文103.3中文會議論文103.3.1近

16、十年中文會議論文年代分布列表103.3.2中文會議論文增長趨勢.113.3.3中文會議論文主辦單位分布123.3.4發(fā)文較多的機構(gòu)123.3.5發(fā)文較多的人物123.3.6最近相關中文會議論文123.4外文期刊論文123.4.1近十年外文期刊論文年代分布列表123.4.2 外文期刊論文增長趨勢133.4.3最近相關外文期刊論文.133.5外文會議論文13I篇三：核酸體外擴增技術綜述核酸體外擴增技術研究進展摘要體外核酸快速擴增技術是一種可使微量核酸在體外高 效快速擴增的技術，自問世以來，被廣泛應用于分子生物學、醫(yī)學 和法理鑒定等領域，并被不斷改進，以使其功能和適應性更為廣泛。 核酸體外擴增是分子

17、生物學研究的基礎。隨著生物技術的發(fā)展，出 現(xiàn)了越來越多的核酸體外擴增技術。就現(xiàn)有的核酸擴增技術的原理、 特點及應用進行介紹。關鍵詞 核酸體外擴增 聚合酶鏈式反應（PCR） 等溫擴增核酸是由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，為生命的最 基本物質(zhì)之一。核酸廣泛存在于所有動物、植物細胞、微生物內(nèi)。核酸大 分子可分為兩類：脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），在蛋 白質(zhì)的復制和合成中起著儲存和傳遞遺傳信息的作用。核酸不僅是 基本的遺傳物質(zhì)，而且在蛋白質(zhì)的生物合成上也占重要位置，蛋白 質(zhì)是生命活動的表達物質(zhì)，基因則是編碼蛋白質(zhì)的特異的核苷酸序 列，因而核酸在生長、遺傳、變異等一系列重大生命現(xiàn)象中

18、起決定 性的作用。而在1983年人類第一次能夠在體外擴增DNA之后，對 核酸的操作和利用進入了一個全新的革命性的階段，直到現(xiàn)在，體 外核酸擴增技術仍然在不斷地改進和完善，新的核酸擴增模式也不 斷涌現(xiàn)1。一、聚合酶鏈式反應（PCR）PCR （Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈式反應，是指 在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點， 通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的 子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術，能快速特異地在 體外擴增任何目的DNA?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序列分析，基因表 達調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方

19、面2。聚合酶鏈式反應技術（PCR）自1985年問世以來，以其靈敏性、 特異性和快速性在醫(yī)學和分子生物等領域得到廣泛的應用，由此可 見核酸擴增技術的重要性。近年來隨著分子生物學的飛速發(fā)展以及 生物物理技術的大量應用，新的核酸擴增模式也不斷涌現(xiàn)。已經(jīng)建 立起來的方法大體可分為兩大類，靶核酸的直接擴增與信號放大擴 增。前者包括聚合酶鏈式反應（PCR）、鏈替代擴增（SDA）、連接 酶鏈式反應（LCR）和依賴核酸序列的擴增（NASBA）等，這些方法 都具有很高的靈敏度。信號放大擴增包括技術核酸（bDNA）、雜交 捕獲、侵染（Invader）和通過擴增替代分子來檢測靶核酸等方法。而滾環(huán)增（RCA）是一種既

20、能直接擴增靶核酸，又能實現(xiàn)信號放大擴增的方法。二、核酸等溫擴增技術1=1等溫擴增技術(Isothermal Amplification Technology)是核 酸體外擴增技術，其反應過程始終維持在恒定的溫度下，通過添加 不同活性的酶和各自特異性引物來達到快速核酸擴增的目的。近年 新發(fā)展起來的核酸等溫擴增技術，無論是在實際操作還是儀器要求 方面，都比PCR技術更為簡單方便，它擺脫了對精良設備的依賴， 在臨床和現(xiàn)場快速診斷中顯示了其良好的應用前景。在眾多等溫擴 增技術中，環(huán)介導等溫擴增目前已在一定范圍內(nèi)得到了應用，其他 一些新發(fā)展起來的等溫擴增技術，如鏈替代等溫擴增、滾環(huán)等溫擴 增、依賴解旋酶

21、等溫擴增、依賴核酸序列等溫擴增、單引物等溫擴 增和核酸快速等溫檢測放大等技術，也在不斷發(fā)展與完善之中3。1、鏈替代擴增技術鏈替代擴增，又叫鏈置換擴增，是一種基于酶促反應的DNA體 外等溫擴增技術，主要利用限制性內(nèi)切酶剪切DNA識別位點的能力 和DNA聚合酶在切口處向3延伸并置換下游序列的能力，在等溫 條件下進行擴增。被替換下來的DNA單鏈可與引物結(jié)合并被DNA聚 合酶延伸成雙鏈。該過程不斷反復進行，使靶序列被高效擴增。SDA 的基本系統(tǒng)包括一種限制性核酸內(nèi)切酶、一種具有鏈置換活性的 DNA聚合酶、兩對引物、dNTP以及鈣、鎂離子和緩沖系統(tǒng)。整個過 程由準備單鏈DNA模板、生成兩端帶酶切位點的目

22、的DNA片段、SDA 循環(huán)擴增3個步驟組成。2、滾環(huán)擴增技術滾環(huán)核酸擴增(rolling circleamolification，RCA)是通過 借鑒病原生物體滾環(huán)復制DNA的方式而提出的，可分為線性擴增與 指數(shù)擴增兩種形式。線性RCA是引物結(jié)合到環(huán)狀DNA上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，產(chǎn)物是具有大量重復序列(與環(huán)狀DNA完全 互補)的線狀單鏈。線性RCA用于靶核酸擴增僅限于一些具有環(huán)狀 核酸的病毒、質(zhì)粒和環(huán)狀染色體。指數(shù)RCA原理與線性RCA相同， 采用與環(huán)狀DNA序列完全一致的第二種引物，該引物與第一次線性 RCA產(chǎn)物結(jié)合并酶促延伸，其產(chǎn)物又作為第一種探針的模板，這樣 一來在很短的時

23、間內(nèi)，產(chǎn)物呈指數(shù)遞增。3、依賴解旋酶DNA擴增依賴解旋酶DNA等溫擴增技術是美國NEB公司于20XX年發(fā)明 的一種新型核酸等溫擴增技術。該技術模擬體內(nèi)DNA復制的自然過 程，利用解旋酶在恒溫下解開DNA雙鏈，再由DNA單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn) 定已解開的單鏈為引物提供模板，然后在DNA聚合酶的作用下合成 互補的雙鏈，繼而不斷重復上述循環(huán)擴增過程，最終實現(xiàn)靶序列的 指數(shù)式增長。4、依賴核酸序列擴增依賴核酸序列擴增技術是一項以核酸序列中RNA為模板，由兩 個引物介導的、連續(xù)均一的特異性體外等溫擴增核苷酸序列的酶促 過程4。5、環(huán)介導等溫擴增環(huán)介導等溫擴增其擴增原理是基于DNA在65C左右處于動態(tài) 平衡狀態(tài)，

24、任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸 時，另一條鏈就會解離，變成單鏈，在此前提下利用4種不同的特 異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域，在鏈置換型DNA聚合酶的作 用下，以外側(cè)引物區(qū)段的3末端為起點，與模板DNA互補序列配 對，啟動鏈置換DNA合成5-6。6、單引物等溫擴增技術單引物等溫擴增技術的核心是一條混合引物及可以切割 DNA/RNA雜合鏈中RNA部分的RNA酶，由由3端DNA部分和5 端RNA部分組成。切割酶作用后暴露出模板上與引物RNA部分結(jié)合 的位點，然后新引物結(jié)合上去進行鏈置換合成，經(jīng)過RNA降解、新 引物結(jié)合、鏈置換的循環(huán)過程，實現(xiàn)模板互補序列的快速擴增。7、快速等溫檢測放大技術快速等溫檢測放大技術最早由中科院研究人員于20XX年發(fā)明。 技術的核心是在待檢測樣品的核酸中加入含有切刻內(nèi)切酶識別位 點的單鏈檢測探針及切刻內(nèi)切酶，檢測探針