HPLC常見問題和對(duì)策

1、HPLC色譜常見問題1.用HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間有時(shí)發(fā)生漂移，有時(shí)發(fā)生快速變化，原因何在？如何解決？2.液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？3.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法4.做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？5.我最近更換了另一種牌號(hào)的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時(shí)間不重現(xiàn)，為什么？6.我購(gòu)買的HPLC柱驗(yàn)收測(cè)試時(shí)柱壓過高，請(qǐng)問為什么？7.色譜雙峰產(chǎn)生的可能及判斷和處理8.色譜柱中的流動(dòng)相會(huì)排干嗎？9.使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接頭需要注意什么問題？10.液相色譜梯度洗脫中柱溫的影響有那些？11.為何基線會(huì)漂移

2、12.規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的13.不規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的14.保留時(shí)間漂移的故障排除15.為何出現(xiàn)肩峰或分叉？16.為何出現(xiàn)鬼峰？17.為何出現(xiàn)峰拖尾？18.為何出現(xiàn)峰展寬？19.除了流速外，還有哪些因素能引起壓力改變？20.什么是強(qiáng)溶劑、弱溶劑？21.怎樣才會(huì)使峰位發(fā)生重排？22.除了在線脫氣常用的實(shí)驗(yàn)室脫氣方式還有哪些？23.評(píng)價(jià)一個(gè)色譜柱的最基本指標(biāo)有那些？24.什么是時(shí)間常數(shù)？25.為什么在實(shí)驗(yàn)過程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)倒峰？26.為何會(huì)出現(xiàn)“胖”峰和平頭峰？怎樣避免？27.什么是次級(jí)保留效應(yīng)？28.前延峰的發(fā)生及處理？29.峰變寬的原因？30.柱平衡慢的常見原因有哪些？31.用內(nèi)標(biāo)法

3、實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求有哪些？32.管子切割與安裝注意事項(xiàng)？33.什么是HPLC的“無(wú)限直徑效應(yīng)”？34.如何評(píng)價(jià)一臺(tái)檢測(cè)器？35.如何簡(jiǎn)單判斷比例閥是否內(nèi)漏？1.用HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間有時(shí)發(fā)生漂移，有時(shí)發(fā)生快速變化，原因何在？如何解決？ 關(guān)于漂移問題： 溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定 流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等 柱子未平衡好，需對(duì)柱子進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的平衡 關(guān)于快速變化問題 流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定 泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。 流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合2.液相色譜中

4、峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？ 篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。 存在干擾峰，解決辦法為使用較長(zhǎng)的柱子，改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子 可能柱超載，減少進(jìn)樣量。3.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法 樣品量不足，解決辦法為增加樣品量 樣品未從柱子中流出?？筛鶕?jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子 樣品與檢測(cè)器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長(zhǎng)或改換檢測(cè)器 檢測(cè)器衰減太多。調(diào)整衰減即可。 檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大。解決辦法為降低時(shí)間參數(shù) 檢測(cè)器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。 檢測(cè)池中有氣泡。解決辦法為排氣。 記錄儀測(cè)壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可。 流動(dòng)相流量不合適。調(diào)整流

5、速即可。 檢測(cè)器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測(cè)器，重作校正曲線。4.做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？ 泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理； 比例閥失效，更換比例閥即可； 泵密封墊損壞，更換密封墊即可； 溶劑中的氣泡，解決的辦法是對(duì)溶劑脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法； 系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可； 梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的。5.我最近更換了另一種牌號(hào)的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時(shí)間不能重現(xiàn)，為什么？ 這是因?yàn)楸环治鑫锟赡芫哂行纬蓺滏I的能力。盡管過去幾年來(lái)，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的ODS填料表面硅醇基的濃度不

6、同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號(hào)的ODS柱上的相對(duì)保留時(shí)間就可能不同。在流動(dòng)相中加入少量競(jìng)爭(zhēng)物，如三乙基胺（TEA），將會(huì)使硅醇基的成鍵能力飽和，從而能保證不同牌號(hào)柱子上的相對(duì)保留時(shí)間具有較好的重現(xiàn)性。 如分離情況可以，系統(tǒng)穩(wěn)定，達(dá)到系統(tǒng)適用性要求，就不必保留時(shí)間的重現(xiàn)。6.我購(gòu)買的HPLC柱驗(yàn)收測(cè)試時(shí)柱壓過高，請(qǐng)問為什么？ 柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。 拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查； 把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下

7、降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查； 將柱子的進(jìn)出口反過來(lái)接在儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，（此時(shí)不要連接檢測(cè)器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查；只用于使用過的柱子。 更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請(qǐng)與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個(gè)在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne 7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。7.色譜雙峰產(chǎn)生的可能及判斷和處理 HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時(shí)間較

8、短的條件下（不包括梯度），峰型應(yīng)對(duì)稱而尖銳。但是，在對(duì)樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理下，會(huì)出現(xiàn)各種意想不到的問題，而對(duì)色譜峰難以作出合理的解釋，尤其對(duì)于新手更是如此。下面根據(jù)本人幾年工作的體會(huì)，提出一些看法，向同仁指教。 色譜雙峰指的是明是一種物質(zhì)，但在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，而表明含二種物質(zhì)。我將這種情況分為四種原因。 1 色譜柱 如果你分析樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)色譜峰都雙峰出現(xiàn)（出峰越快，雙峰的可能性會(huì)減少），尤其采用單一純物質(zhì)時(shí)，可以肯定色譜柱出問題柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進(jìn)樣量少，原來(lái)色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將

9、色譜柱反過來(lái)接，用流動(dòng)相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來(lái)，一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖，正沖有時(shí)也會(huì)正常的。如果峰拖尾，雙峰強(qiáng)弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這是可以將進(jìn)樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù)，同時(shí)不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會(huì)應(yīng)柱效很低而報(bào)廢。 2 溶劑極性及進(jìn)樣量 許多HPLC分析者對(duì)此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻(xiàn)都不會(huì)提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個(gè)很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動(dòng)相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般

10、用與流動(dòng)相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動(dòng)相溶解，但是很多情況是不一致的。當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進(jìn)樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一樣），且拖尾，保留時(shí)間會(huì)提前（相對(duì)進(jìn)樣量少而言），將進(jìn)樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎?。這是樣品的溶劑與流動(dòng)相極性相差太大，而流動(dòng)相來(lái)不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個(gè)原因，另一個(gè)原因是，進(jìn)樣量不一定大，但絕對(duì)量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進(jìn)樣就

11、可以了，這是由于進(jìn)樣量過大，色譜柱過載造成的。 3 樣品的特性 有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無(wú)法分開，而是以一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡存在。在色譜分析時(shí)，在一個(gè)特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LCMS下，用質(zhì)譜檢測(cè)器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯，例如我分析過的農(nóng)藥啶蟲瞇（吡蟲清）。 4 參數(shù) 記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的，例如CR3A數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時(shí)間間隔GC為2ms，HPLC 為5ms，如果記錄間隔

12、時(shí)間縮短，一個(gè)峰將變?yōu)槎€(gè)峰或更多。8.色譜柱中的流動(dòng)相會(huì)排干嗎？ 不少做色譜分離試驗(yàn)的人遇到過這樣的情形：不慎未及時(shí)補(bǔ)充流動(dòng)相，泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會(huì)損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動(dòng)相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實(shí)上，如果泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干，并不會(huì)造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會(huì)將空氣排入色譜柱。因?yàn)楸弥荒茌斔鸵后w，而不能輸送空氣。 相比之下，另一個(gè)更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個(gè)色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個(gè)毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是

13、色譜柱變干需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了?？梢試L試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑（如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇）沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤(rùn)填料表面；已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要（以1mL/min的流速）沖一個(gè)小時(shí)或更多的時(shí)間被徹底浸潤(rùn)，恢復(fù)到正常狀態(tài)。9.使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接頭需要注意什么問題？ 如果經(jīng)常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用PEEK材料制成的管路和接頭會(huì)非常方便。PEEK管路容易連接；PEEK接頭不僅無(wú)需工具，手?jǐn)Q即可固定，而且容易調(diào)節(jié)錐箍之外的管路長(zhǎng)

14、度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。 使用此類材料的管路需要注意的是：PEEK對(duì)鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解PEEK材料的明顯跡象，但PEEK遇到上述溶劑會(huì)變脆。另一個(gè)西藥考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多數(shù)HPLC應(yīng)用系統(tǒng)壓力不會(huì)超過3000psi）。使用PEEK接頭時(shí)則無(wú)需擔(dān)心接頭耐溶劑性能，因?yàn)榻宇^幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手?jǐn)Q固定的PEEK接頭壓力限低于不銹鋼管，因而壓力太高時(shí)，可能會(huì)使接頭在管路上滑動(dòng)而產(chǎn)生死體積或漏液。10. 液相色譜梯度洗脫中柱溫的影響 許多色譜工作者在操作液相色譜時(shí)

15、，色譜柱是在室溫環(huán)境下工作的。如果實(shí)驗(yàn)室的溫度能保持不變的話，不會(huì)有什么大問題。但大多數(shù)的工作環(huán)境溫度是不斷變化的，因此若想將在某實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的一種液相色譜方法應(yīng)用到其他實(shí)驗(yàn)室的話，溫度的差別就會(huì)引起較復(fù)雜的問題。溫度的影響在所有的色譜分析方式中都是存在的，本文就來(lái)討論液相色譜方法中的梯度洗脫方式受溫度影響的問題。 等度保留 大多數(shù)色譜工作者知道等度洗脫時(shí)溫度會(huì)影響保留時(shí)間。圖1顯示了三個(gè)不同溫度下的分離結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度升高時(shí)所有的色譜峰都前移了，等度洗脫時(shí)一般溫度每升高一攝氏度保留時(shí)間會(huì)縮短1-3%，在圖1中，保留時(shí)間變化率約為2%/。 擁有溫控系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室一般都有全天候溫控設(shè)置，但這種設(shè)

16、置可能引起室溫顯著變化，這對(duì)整夜運(yùn)行的色譜系統(tǒng)就會(huì)有一些影響，例如我們實(shí)驗(yàn)室的夜間溫度就設(shè)為4-7。在不同的季節(jié)，實(shí)驗(yàn)室的夜間溫度可能比正常工作日的溫度高或低，這種溫度的變化就會(huì)使色譜峰離開“保留時(shí)間窗”，造成連續(xù)進(jìn)樣中產(chǎn)生一系列的無(wú)效數(shù)據(jù)。 還有一個(gè)可能的溫度影響因素就是色譜儀器在實(shí)驗(yàn)室的位置。當(dāng)色譜柱正對(duì)著空調(diào)的送風(fēng)口時(shí)，雖然整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的溫度非常穩(wěn)定，但色譜系統(tǒng)的溫度就會(huì)不斷的變化。這就是我們要使用柱溫箱的原因之一。 梯度保留 溫度變化對(duì)梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢(shì)是一樣的。圖2是苯胺和苯酸在三個(gè)溫度條件下的色譜圖。圖1中，20的溫度變化引起保留因子的變化大約為兩倍，然而在圖2中，40的變

17、化使保留改變了約20%。平均來(lái)說，圖2中的色譜保留變化約為0.2%/。由此可見，溫度變化對(duì)梯度洗脫的影響要小于對(duì)等度洗脫的影響（假定本例具有普遍代表意義）。即便如此，若梯度洗脫時(shí)不控制溫度的話，保留值一般都會(huì)有較大的變化。 選擇性的變化 比較圖1和圖2會(huì)發(fā)現(xiàn)溫度變化能引起選擇性顯著變化。圖1中，25時(shí)第二個(gè)峰和第一個(gè)峰很接近，但當(dāng)溫度升高后，第二個(gè)峰卻遠(yuǎn)離第一個(gè)峰，接近第三個(gè)峰。從三個(gè)圖來(lái)看，對(duì)于前三個(gè)峰的最佳分離條件是35。值得注意的一個(gè)有趣現(xiàn)象是，選擇性的變化是和成分相關(guān)的，例如圖1中當(dāng)溫度變化后最后三個(gè)峰的相對(duì)位置幾乎不變。 在圖2的梯度洗脫示例中，也有選擇性變化。峰1、2、4和5的相對(duì)

18、位置沒有十分明顯的變化，但是，當(dāng)溫度升高時(shí)，峰3會(huì)移近峰4。峰位置的相對(duì)變化和溫度的變化是有規(guī)律可循的。當(dāng)條件確定以后，這個(gè)規(guī)律就是可預(yù)測(cè)的。例如，在圖2中當(dāng)溫度升至77以上時(shí)，峰3和峰4將會(huì)合并。而當(dāng)溫度更高時(shí)，峰3將會(huì)移到峰4之后。溫度引起的選擇性變化的多年來(lái)一直未受重視。最近，施耐德等人發(fā)現(xiàn)能夠?qū)囟茸鳛橐粋€(gè)調(diào)整選擇性的有力工具。圖1中的樣品在35時(shí)可以達(dá)到最佳選擇性（峰之間的距離最大），而圖2中的樣品在38時(shí)可達(dá)到最佳選擇性（這兩份樣品的最優(yōu)溫度近似純屬巧合）。 溫度控制 從實(shí)踐出發(fā)，圖1和2的例子說明為了獲得一致的結(jié)果我們必須要控制柱溫，使用柱溫箱是最好的辦法。目前商業(yè)化的柱溫箱有兩

19、種形式：直接加熱色譜柱和通過空氣傳熱，每種設(shè)計(jì)都有其優(yōu)缺點(diǎn)，而且不同廠商設(shè)計(jì)的LC系統(tǒng)也有不同的限制。在直接加熱型柱溫箱中色譜柱是被夾在金屬加熱器中或被加熱器包裹起來(lái)；而在空氣傳熱型的柱溫箱和氣相色譜柱溫箱很相像，色譜柱是被懸掛在靜止或流動(dòng)的空氣中，通過加熱空氣來(lái)保持柱溫。第三種設(shè)計(jì)是把色譜柱浸在液體中（比如水浴中），這在實(shí)驗(yàn)室中很容易搭建，但通常這種設(shè)計(jì)也并不比其他設(shè)計(jì)省力。 如果沒有柱溫箱，最有效的辦法就是將色譜柱隔絕在一個(gè)溫度波動(dòng)最小的地方。例如，可把色譜柱置于泡沫塑料套中或色譜包裝盒中，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室溫度基本不變時(shí)效果很好，但這種方法必須要允許保留有一些波動(dòng)。隔絕色譜柱也可以避免結(jié)果受環(huán)境溫

20、度影響。 溫度平衡 我們知道，為了保證分離的重現(xiàn)性，色譜柱在梯度洗脫狀態(tài)下的必須有平衡過程。當(dāng)一次梯度洗脫分離完成后，一定要用10-15倍柱體積的流動(dòng)相來(lái)沖洗柱子以恢復(fù)柱子的平衡。例如，如果使用B溶劑5-100%的梯度，柱子為150mm4.6mm（柱體積為1.5ml），當(dāng)流動(dòng)相從100%的B溶劑換回到5%的B溶劑時(shí)，大概需要保持1.5ml/min的流速10分鐘來(lái)恢復(fù)系統(tǒng)平衡，在進(jìn)行下一次梯度變換之前如果系統(tǒng)沒有平衡,那么保留時(shí)間的重現(xiàn)性就會(huì)很差。 正如柱子不能完全平衡將導(dǎo)致保留時(shí)間的重現(xiàn)性差一樣，柱溫不平衡也會(huì)導(dǎo)致不理想的后果，這個(gè)問題在峰寬上的影響尤其明顯。當(dāng)溫度變化時(shí)除了選擇性和保留時(shí)間的

21、變化之外，峰寬也會(huì)發(fā)生變化。升高溫度通常會(huì)使理論塔板數(shù)（N）升高，峰寬變窄，由于峰面積不變，峰越窄就會(huì)越高，因此升高溫度可以達(dá)到更小的檢測(cè)限。（這篇文章里的色譜圖不是按同一個(gè)y軸比例來(lái)畫的，所以峰高的變化沒有表示出來(lái)） 不用平衡的流動(dòng)相充分的沖洗柱子會(huì)導(dǎo)致化學(xué)不平衡狀態(tài)，但是當(dāng)柱子在程序升溫的環(huán)境中我們?cè)鯓哟_定不平衡問題呢？答案取決于柱子中的流動(dòng)相，如果柱子是在室溫條件下，溶劑瓶、泵和自動(dòng)進(jìn)樣器也在室溫下，那么整個(gè)系統(tǒng)中的溫度就應(yīng)該是穩(wěn)定的。但是，如果柱子是熱的，系統(tǒng)的其他部分和溶劑是室溫，柱頭將比柱尾涼。柱子里的溫度變化將會(huì)影響峰形。 圖3所示色譜圖中柱溫為38，進(jìn)柱的溶劑為室溫（約22），

22、最后一個(gè)峰有很明顯的變形。把溶劑瓶、泵、自動(dòng)進(jìn)樣器加熱至與柱溫相同是不現(xiàn)實(shí)的，所以溶劑預(yù)熱器是最好的選擇。我們用1米長(zhǎng)，0.25mm內(nèi)徑的不銹鋼管作為預(yù)熱器，把這個(gè)不銹鋼管盤成直徑大約10cm的平面緊貼在柱溫箱里的預(yù)熱器上，再讓流路垂直以便預(yù)熱器能夠位于自動(dòng)進(jìn)樣器和柱子之間，這樣，涼的溶劑從自動(dòng)進(jìn)樣器里出來(lái)到柱子之前經(jīng)過這個(gè)預(yù)熱盤升高了溫度。圖3中的上面一個(gè)色譜圖就是增加了預(yù)熱器使峰形得到改善。有一些商品柱溫箱就包括這個(gè)預(yù)熱器。 當(dāng)流動(dòng)相和柱子之間的溫差增大時(shí)，由溫度不平衡而導(dǎo)致的峰變形就會(huì)加劇。比較圖3-5你會(huì)發(fā)現(xiàn)這個(gè)問題很富戲劇性。在77時(shí)后一個(gè)峰變形很大以至于會(huì)認(rèn)為它是兩個(gè)成份或者認(rèn)為柱

23、子有了死體積。在上述情況下當(dāng)使用了預(yù)熱盤以后峰型都變得很漂亮。雖然由于比例不同我們無(wú)法看出，其實(shí)圖3-5中所有對(duì)應(yīng)成份的峰面積都是不變的。 為什么會(huì)看到這些峰變形了呢？這很容易從峰展寬的角度來(lái)解釋。前段的溫度比尾部的溫度高，所以前段走的快。當(dāng)前面比后面走的快的時(shí)候就會(huì)產(chǎn)生展寬的峰。這種現(xiàn)象和梯度洗脫中有種情況是相對(duì)的，就是在一開始使用弱極性溶劑小流速后用強(qiáng)極性大流速。雖然使用預(yù)熱器來(lái)改善峰形是一個(gè)很著名的結(jié)論（見參考文獻(xiàn)3）但峰變形的原因仍然很復(fù)雜。在理想梯度洗脫中，每個(gè)峰都應(yīng)該在相同的環(huán)境中出來(lái)而且以相同的速度通過柱子，最后得到相同的峰寬。但是很奇怪后出的峰變形問題比先出的峰要嚴(yán)重，正如圖4

24、所示。或許讀者對(duì)這個(gè)現(xiàn)象會(huì)有簡(jiǎn)單的解釋。 結(jié)論 我們發(fā)現(xiàn)柱溫在液相色譜梯度洗脫過程中扮演了一個(gè)重要的角色，首先，提高柱溫可以縮短保留時(shí)間，其次，我們看到柱溫還可以影響選擇性，最后，溫度的不平衡會(huì)導(dǎo)致峰扭曲變形。這些提醒我們，如果想得到穩(wěn)定可靠的分離結(jié)果，色譜柱的溫度變化是不可忽視的。11.為何會(huì)基線漂移 原因 柱溫波動(dòng)。（即使是很小的溫度變化都會(huì)引起基線的波動(dòng)。通常影響示差檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、較低靈敏度的紫外檢測(cè)器或其它光電類檢測(cè)器。） 流動(dòng)相不均勻。（流動(dòng)相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。） 流通池被污染或有氣體 檢測(cè)器出口阻塞。（高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線） 流動(dòng)相配比

25、不當(dāng)或流速變化 柱平衡慢，特別是流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí) 流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成 樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)（高K值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線。 使用循環(huán)溶劑，不提倡。未調(diào)整檢測(cè)器。 檢測(cè)器沒有設(shè)定在最大吸收波長(zhǎng)處。解決方法 控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，在檢測(cè)器之前使用熱交換器 使用HPLC級(jí)的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動(dòng)相在使用前進(jìn)行脫氣，使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣。 用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用鹽酸） 取出阻塞物或更換管子。參考檢測(cè)器手冊(cè)更換流通池窗。 更改配比或流速。為避免這個(gè)問題可定期檢查流動(dòng)相組成及流速。 用中等強(qiáng)度的

26、溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動(dòng)相時(shí)，在分析前用10-20倍體積的新流動(dòng)相對(duì)柱子進(jìn)行沖洗。使用離子對(duì)試劑、緩沖鹽更應(yīng)注意平衡柱。 檢查流動(dòng)相的組成。使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級(jí)的溶劑 改變分析條件。使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。 重新設(shè)定基線。使用新的流動(dòng)相。 將波長(zhǎng)調(diào)整至最大吸收波長(zhǎng)處。重選檢測(cè)波長(zhǎng)。 12.規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的原因 在流動(dòng)相、檢測(cè)器或泵中有空氣（尖銳峰） 漏液 。 流動(dòng)相混合不完全 。 溫度影響（柱溫過高，檢測(cè)器未加熱） 在同一條線上有其他電子設(shè)備（偶然噪聲） 泵振動(dòng) 。解決方法 流動(dòng)相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測(cè)器或泵中的空氣。 檢查管

27、路接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。 用手搖動(dòng)使混合均勻或使用低粘度的溶劑 減少差異或加上熱交換器 斷開LC、檢測(cè)器和記錄儀，檢查干擾是否來(lái)自于外部，加以更正。 采用精密級(jí)穩(wěn)壓電源。 在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器 13.不規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的原因 漏液。 流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成 流動(dòng)相各溶劑不相溶 檢測(cè)器/記錄儀電子元件的問題 系統(tǒng)內(nèi)有氣泡 檢測(cè)器內(nèi)有氣泡 流通池污染（即使是極少的污染物也會(huì)產(chǎn)生噪音。） 檢測(cè)器燈能量不足 色譜柱填料流失或阻塞 流動(dòng)相混合不均勻或混合器工作不正常解決方法 檢查接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音

28、。如有必要，更換密封。檢查流通池是否漏液。 檢查流動(dòng)相的組成。 選擇互溶的流動(dòng)相 斷開檢測(cè)器和記錄儀的電源，檢查并更正。 用強(qiáng)極性溶液清洗系統(tǒng) 清洗檢測(cè)器，在檢測(cè)器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器 用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池 更換燈 更換色譜柱 維修或更換混合器，在流動(dòng)相不走梯度時(shí)，建議不使用泵的混合裝置 14.保留時(shí)間漂移的故障排除 保留時(shí)間不重現(xiàn)有兩種不同的情況：既保留時(shí)間漂移和保留時(shí)間波動(dòng)。前者是指保留時(shí)間僅沿單方向發(fā)生變化，而后者指保留時(shí)間無(wú)固定規(guī)律的波動(dòng)。將此兩種情況區(qū)分開來(lái)對(duì)找到問題的原因往往很有幫助。如，保留時(shí)間的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留時(shí)間的無(wú)規(guī)律波動(dòng)。事實(shí)

29、上，保留時(shí)間漂移的多半原因是不同機(jī)理的色譜柱老化，如固定相流失（例如通過水解），色譜柱污染（由樣品或流動(dòng)相所致）等。保留時(shí)間漂移的幾種最常見的原因如下： 一 色譜柱平衡 如果我們觀察到保留時(shí)間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動(dòng)相完全平衡。通常平衡需要10-20個(gè)柱體積的流動(dòng)相，但如果在流動(dòng)相中加入少量添加劑（如離子對(duì)試劑）則需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)平衡色譜柱。 流動(dòng)相污染也可能是原因之一。溶于流動(dòng)相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時(shí)間的漂移。應(yīng)注意：水是很容易污染的流動(dòng)相成分。 二 固定相穩(wěn)定性 固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的PH范圍內(nèi)使用，固定相也會(huì)慢慢水解。例如，硅膠基

30、質(zhì)在pH4時(shí)水解穩(wěn)定性最好。水解速度與流動(dòng)相類型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)定；長(zhǎng)鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定；烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。 經(jīng)常清洗色譜柱亦會(huì)加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解，如氨基鍵合相等。 三 色譜柱污染 保留時(shí)間漂移的另一個(gè)常見原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動(dòng)相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是：流動(dòng)相本身，流動(dòng)相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過實(shí)驗(yàn)可判斷污染的來(lái)源。 樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，就可能是使保留時(shí)間漂移的潛

31、在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)。如：配藥中的賦形劑，生化樣品（如血清）中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的淀粉，環(huán)境水樣中的腐殖酸等。通常樣品中的強(qiáng)保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時(shí)間漂移的同時(shí)或其后會(huì)有反壓的增加?？梢酝ㄟ^使用固相提取（SPE）等樣品前處理方法來(lái)去除樣品基質(zhì)的影響。 避免色譜柱污染最簡(jiǎn)單的方法是防患于未然。相比之下，找到問題的所在并設(shè)計(jì)有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動(dòng)相中溶解。如THF可去除反相色譜柱中的許多污染物，但蛋白在THF中就不能溶解。DMSO常常用于去除反相色譜柱中的蛋白。 使用保護(hù)柱是個(gè)

32、非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時(shí)采用的辦法。 四 流動(dòng)相組成 流動(dòng)相組成的緩慢變化也是保留時(shí)間漂移的常見原因。如流動(dòng)相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動(dòng)相等。 五 疏水坍塌 當(dāng)小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動(dòng)相時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)生分離突然喪失及被分析物質(zhì)保留明顯降低或完全不保留的現(xiàn)象，這就是疏水坍塌。此現(xiàn)象是由流動(dòng)相不浸潤(rùn)固定相表面而致。挽救的辦法實(shí)現(xiàn)用含大量有機(jī)組分的流動(dòng)相浸潤(rùn)固定相，再用高水含量的流動(dòng)相進(jìn)行平衡。色譜柱長(zhǎng)期儲(chǔ)存也會(huì)發(fā)生此現(xiàn)象。使用內(nèi)嵌極性基團(tuán)的反相色譜柱（如Waters SymmetryShield RP色譜柱）或非端基封口的色譜柱（如Water

33、s Resolve色譜柱）也可避免發(fā)生坍塌。（一）保留時(shí)間變化 柱溫變化柱恒溫 等度與梯度間未能充分平衡至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱 緩沖液容量不夠用25mmol/L的緩沖液 柱污染每天沖洗柱 柱內(nèi)條件變化穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相 柱快達(dá)到壽命采用保護(hù)柱（二）保留時(shí)間縮短 流速增加檢查泵,重新設(shè)定流速 樣品超載降低樣品量 鍵合相流失流動(dòng)相PH值保持在37.5;檢查柱的方向 流動(dòng)相組成變化防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀 溫度增加柱恒溫（三） 保留時(shí)間延長(zhǎng) 流速下降管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡 硅膠柱上活性點(diǎn)變化用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱 鍵合相流失 同前（二）3 流動(dòng)相組成變

34、化同前（二）4 溫度降低同前（二）515.為何出現(xiàn)肩峰或分叉？ 樣品體積過大用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% 樣品溶劑過強(qiáng)采用較弱的樣品溶劑 柱塌陷或形成短路通道更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件 柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品 進(jìn)樣器損壞更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子16.為何出現(xiàn)鬼峰？ 進(jìn)樣閥殘余峰每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗 樣品中未知物處理樣品 柱未平衡重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑（尤其是離子對(duì)色譜） 三氟乙酸（TFA）氧化每天新配,用抗氧化劑 水污染（反相）通過變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水17.為何出現(xiàn)峰拖尾？ 柱超載降低樣品量,增加柱直

35、徑采用較高容量的固定相 峰干擾清潔樣品,調(diào)整流動(dòng)相 硅羥基作用加三乙胺,用堿致鈍化柱,增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相PH值,純化樣品 柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品 柱塌陷或形成短路通道更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件 死體積或柱外體積過大連接點(diǎn)降至最低,對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管 柱效下降用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱18.為何出現(xiàn)峰展寬？ 樣品體積過大用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% 在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散 數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn) 檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過大設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的

36、10% 流動(dòng)相粘度過高增加柱溫,采用低粘度流動(dòng)相 檢測(cè)池體積過大用小體積池,卸下熱交換器 保留時(shí)間過長(zhǎng)等度洗脫時(shí)增加強(qiáng)溶劑含量,也可用梯度洗脫 柱外體積過大將連接管徑和連接管長(zhǎng)度降至最小 樣品過載進(jìn)小濃度小體積樣品19.除了流速外，還有哪些因素能引起壓力改變？ 改變流動(dòng)相組成和溫度；改變柱長(zhǎng)、柱內(nèi)徑和填料粒度；柱突然阻塞壓力升高（正常情況下其它條件不變柱壓都是逐漸升高的）。20.什么是強(qiáng)溶劑、弱溶劑？ 改變流動(dòng)相的組成或溶劑溶劑強(qiáng)度就可以改變峰容量因子和保留時(shí)間。在一定條件下，減少保留時(shí)間或縮短分析時(shí)間的溶劑為強(qiáng)溶劑，增加保留時(shí)間或延長(zhǎng)分析時(shí)間的溶劑為弱溶劑。21.怎樣才會(huì)使峰位發(fā)生重排？ 在

37、分析多組分樣品時(shí)，僅改變流動(dòng)相的強(qiáng)度（組成百分比）而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的保留時(shí)間，不會(huì)發(fā)生峰位的重排。 下列條件改變可能發(fā)生峰位重排：流動(dòng)相中換了強(qiáng)溶劑；PH值的改變；柱填料的改變；柱溫的改變；流動(dòng)相的組成改變（如加入離子對(duì)試劑三乙基胺等）。22.除了在線脫氣，常用的實(shí)驗(yàn)室脫氣方式還有哪些？ 加熱回流脫氣，脫氣效果最佳，但無(wú)法保持；氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價(jià)格太貴，所以用的不多；真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失；超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但在實(shí)驗(yàn)室中最常用。目前還是盡量爭(zhēng)取用在線脫氣，方便且效果好。

38、23.評(píng)價(jià)一個(gè)色譜柱的最基本指標(biāo)有那些？ 評(píng)介一根色譜柱的基本指標(biāo)是：塔板數(shù)、峰不對(duì)稱因子、柱壓降、適用范圍和鍵合相濃度以及峰容量。24.什么是時(shí)間常數(shù)？ 時(shí)間常數(shù)實(shí)際上是響應(yīng)時(shí)間的設(shè)定，起著過濾噪音的作用。時(shí)間常數(shù)太?。ㄌ欤┛赡茉黾佣淘胍?，時(shí)間常數(shù)太大（太慢）可能出寬峰、拖尾峰。25.為什么在實(shí)驗(yàn)過程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)倒峰？ 所用的流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下有吸收，而進(jìn)在此波長(zhǎng)下沒有吸收或吸收低于流動(dòng)相的溶液，在流動(dòng)相中會(huì)出現(xiàn)洞穴，通過柱后出現(xiàn)倒峰。26.為何會(huì)出現(xiàn)“胖”峰和平頭峰？怎樣避免？ 用比流動(dòng)相強(qiáng)度大的大體積樣品進(jìn)樣，通常會(huì)損害色譜圖的質(zhì)量，而出現(xiàn)“胖”峰和平頭峰。應(yīng)遵循下列規(guī)則選用溶劑溶解樣

39、品：A最好用流動(dòng)相溶解樣品進(jìn)樣。B用大體積弱溶劑溶解樣品，如反相色譜中用水溶解樣品進(jìn)樣，主要缺點(diǎn)是每次進(jìn)樣后在色譜圖的開頭出現(xiàn)大的負(fù)峰，有時(shí)還波及到樣品峰。C需要時(shí)用強(qiáng)溶劑溶解進(jìn)樣。27.什么是次級(jí)保留效應(yīng)？ 在良好的色譜分離中，樣品分子是以單一的保留過程被保留。如在反相色譜中，溶質(zhì)與柱填料的非極性烷基鏈發(fā)生疏水性相互作用。但在以硅膠為基質(zhì)的填料中，有些樣品組分能與硅醇基團(tuán)相互作用，脫附的過程很慢，使峰嚴(yán)重拖尾，這就是次保留過程。對(duì)付次保留效應(yīng)最有效的方法就是選用封尾更好色譜柱或加入流動(dòng)相改良劑（也叫掃尾劑）。28.前延峰的發(fā)生及處理？ 因柱溫問題很易引起前延峰，有些樣品在常溫下分離可見前延峰，提高溫度后前延峰的現(xiàn)象消失。在離子對(duì)色譜中，前延峰的另一個(gè)原因是用非流動(dòng)相作樣品溶劑。因此在離子對(duì)色譜中要求僅用流動(dòng)相溶解樣品，而且進(jìn)