冬蟲夏草中腺苷含量的測定

1、摘要目的：建立用HPLC法測定冬蟲夏草及含片中腺甘的含量。方法：Ci8(4.6mmx250mm,5um)fe譜柱，0.05molL-1磷酸二氫鉀+甲醇90+10為流動相，流速為1.0mlmin-1檢測波長260nm,柱溫為35C。結(jié)果：月M昔含量在0.00異0.2ug(r=0.9998同呈良好的線性關(guān)系。平均回收率為99.49%RSD=1.47%。結(jié)論：方法準確可靠、結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，分析速度快，可有效控制制劑的質(zhì)量。關(guān)鍵字：HPLC;冬蟲夏草菌粉；含片；腺昔；DADAbstractObjective:todeterminethecontentofadenosineCordycepspowd

2、erandtabletsbyHPLCmethod.Methods:kromasil-C18(4.6mmX250mm,5um)column,usingmethanoltwohydrogen0.5mo?L-1phosphoricacid(90:10)asmobilephase,theflowratewas1.0ml?min-1,thedetectionwavelengthwas260nm,thecolumntemperaturewas35C.Results:adenosinein0.0050.2ug(r=09998)showedagoodlinearrelationshipintherangeof

3、.Theaveragerecoverywas101.16%,RSD=1.47%.Conclusion:themethodisConclusion:themethodisaccurateandreliablestrongspecificity,resultsstability,goodreproducibility,whichcaneffectivelycontrolthequalityofthepreparation.Keywords:Cordycepssinensispowder;tablet;adenosine;HPLC目錄摘要IAbstracts.前言3儀器與試藥3.實驗條件3供試品提取

4、溶劑的選擇3檢測波長的選擇4流動相的選擇4.試驗方法與結(jié)果4分析溶液4對照品溶液制備4供試品溶液制備4色譜條件5分析方法學考察5系統(tǒng)適應性試驗5標準曲線繪制及線型圍考察6精細度試驗6重復性試驗6穩(wěn)定性試驗6加樣回收率試驗6.討論74.174.284.38參考文獻：9致10.前言冬蟲夏草，僅僅是我國190多種蟲草中的一種，也是中藥傳統(tǒng)的滋補藥材。冬蟲夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體，主要活性成分是蟲草素，是中國特有的蟲生真菌，具有調(diào)節(jié)免疫力功能、抗月中瘤、抗疲勞等成效。在藥理學現(xiàn)代研究結(jié)果中，冬蟲夏草含有腺甘約7%,糖類28.9%,脂月方約8.4%,蛋白質(zhì)約25%。其中冬蟲夏

5、草中82.2%為不飽和脂肪酸10此外冬蟲夏草中主要成分為腺甘，在2000版中國藥典2和文獻報道3中均采用高效液相色譜法測定蟲草中腺甘的含量。在實際分析檢測中其兩種方法檢測時，峰形對稱性不佳，有一干擾峰且干擾嚴重，為了改善它對樣品提取條件進展改良，取得了較好的效果，對冬蟲夏草的質(zhì)量控制提供了一定的技術(shù)依據(jù)。分析實驗采用HPLC高效液相色譜法4,5別離技術(shù)，性能未定，能快速、準確測定其含量，樣品的預先處理方法簡單易行。儀器與藥品的選擇1Agilent1100高效液相色譜儀，配置在線脫氣機、高壓泵及梯度洗脫裝置、自動進樣器、G8(4.6mmX250mm,5um泊譜柱、光電二極管陣列檢測器DAD、Ag

6、ilent色譜工作站、JD500E超聲波清洗器，優(yōu)普超純水機。2腺甘標準品永葉生物科技，水為UP水，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。3冬蟲夏草、冬蟲夏草含片在省格爾木市冬蟲夏草雪域?qū)Ｙu店購置。.分析測定前的準備試驗樣品的預處理首先為了試驗結(jié)果具有代表性，選擇品質(zhì)優(yōu)良的冬蟲夏草。冬蟲夏草和含片通過研缽研成粉末，這樣有利于30%乙醇提純。在樣品預處理過程中應該防止引入其他雜質(zhì)和腺甘含量的損失。試驗提取樣品溶劑的選擇由于腺甘的含量較低，干擾成分多，曾采用藥典方法及文獻報道2,3的方法，用90%甲醇和15%甲醇提取，均別離不好，拖尾嚴重，后經(jīng)屢次實驗，采用30%乙醇超聲提取后，蒸干，進展檢測，峰形的

7、對稱性比擬好，并消除了腺昔峰的拖尾現(xiàn)象及干擾峰，取得了較好的別離效果。HPLC檢測器波長的選擇取腺昔標準品溶液適量，調(diào)節(jié)波長在200400nm區(qū)間，在光電二極管陣列檢測器中測出吸收光譜圖，結(jié)果顯示在260nm處有最大吸收，因此選擇260nm為檢測波長。2.4流動相的選擇利用藥典方法中流動相：磷酸鹽緩沖液PH6.5取0.01molL-1磷酸二氫鈉68.5ml與0.01molL-1磷酸二氫鈉31.5ml,攪拌均勻，調(diào)PH6.5甲醇17:3及0.05molL-1磷酸二氫鉀一甲醇為流動相，經(jīng)過這兩種流動相的試驗，選擇0.05molL-1磷酸二氫鉀一甲醇為流動相，以不同與比例進展反復試驗，確定比例為(9

8、0:10時峰形及出峰時間適宜。.測定方法及測定結(jié)果分析溶液制備對照品的標準溶液準確稱取腺昔標準品0.0160g經(jīng)五氧化二磷為枯燥劑減壓24h，再參加30%的乙醇溶液溶解，參加50ml容量瓶中稀釋至刻度線，搖勻，作為標準品儲藏液。樣品溶液的制備準確稱取冬蟲夏草含片和菌粉各2.0000g分別準確參加30%的乙醇溶液10ml,密塞，稱定重量，超聲30min,放至室溫，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾。按同樣方法連續(xù)3次，將所得的濾液置于100ml容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，作為試驗溶液。HPLC色譜條件色譜柱：Ci8,(4.6mmx250mm,5um);流動相：0.05molL-1磷酸

9、二氫鉀+甲醇90+10;檢測波長260nm；流速1.0mlmin-1;柱溫：35C。HPLC的試驗過程及測定結(jié)果系統(tǒng)適應性的試驗在上述色譜條件下，分別把試驗溶液、標準品溶液放入自動進樣器由計算機自動控制定量閥進樣量為10ul，按預先編制注射樣品的操作程序工作。取樣、進樣、復位、樣品管路清洗和樣品盤的轉(zhuǎn)動，全部按預定程序自動進展。試驗色譜圖中，在與標準品色譜圖相應保存時間上，有一一樣的色譜峰。色譜圖見圖1圖1樣品A與標準品BHPLC色譜圖Fig1.HPLCChromatogramsofreferencesample(A)andsubstance(B)昔adenosine繪制標準、線型曲線的圍控制

10、準確稱取腺昔標準品，用甲醇稀釋并制成每1ml含20ug的溶液。分別進樣7次0.25051.003.0、5.0、7.0、10.0ul,按上述色譜條件測定，并以進樣量為橫坐標X，以峰面積為縱坐標Y進展線性回歸。得回歸方程：Y=8155.3X-6.5954r=0,9998。腺昔在0.005-0.2ug圍有良好的線性關(guān)系。儀器精細度的試驗準確吸取上述標準品溶液適宜，在上述色譜條件下，連續(xù)進樣5次，記錄腺昔面積，計算RSD標準偏差為1.35%重復性試驗精細稱取同一批號樣品5份，以供試品溶液制備及上述色譜條件，平行測定6次，測定腺昔的含量分別為0.074310.075340.074850.0812Z0.0

11、7853mgm-1，平均含量為0.07686ngml-1,RSD為0.27%n=5。穩(wěn)定性試驗取精細度試驗的標準品溶液，在室溫下放置12、48h后測定，記錄峰面積，兩次測定的RSD為1.03%,1.31%此方法穩(wěn)定性較好。加樣回收率試驗稱取含量的同一批樣品3份，準確參加腺昔標準品適量，按樣品測定，并用甲醇稀釋一定含量，計算回收率。結(jié)果見表1.表1加樣回收率試驗Table1samplerecoveryratetest原含量:ug參加量ug測定值ug回收率ugugRSD(%)16.45900.50907.0024101.7626.43800.76357.2524107.4799.499.336.4

12、4700.97537.502589.25樣品測定取不同批號的樣品，按3.1.2狽下的方法制成試驗溶液。在選定的色譜條件下，對冬蟲夏草菌粉及含片進展測定。計算腺音的含量，測定結(jié)果見表2。表2樣品含量測定結(jié)果Table2resultsofsampledetermination編號No含量contentmgRSD(%)菌粉10.157340.98含片20.076181.054.討論在與蟲草藥典和文獻中相比，此實驗在腺昔的提取方法上做了改良；由超聲波提取法法跟同流提取法比擬得出，選擇超聲波提取法工作30min效果最好。其次對乙醇提取的濃度做出比擬分析，結(jié)論是：30%的乙酉1比95%乙醇提取的完全結(jié)果可

13、見表2。最后得出實驗結(jié)論冬蟲夏草菌粉中腺甘的含量高于含片中腺甘的含量。進展檢測時用磷酸三鈉溶液溶解樣品，其流動相的濃度比例對蟲草腺昔的別離峰形有一定的影響，由屢次實驗得出結(jié)論，0.05molL-1磷酸二氫鉀-甲醇在流動相中的濃度比例應控制在90:10為佳。本方法簡單、穩(wěn)定，為冬蟲夏草及制劑的質(zhì)量控制提供了一種有效的分析方法。參考文獻：1Zhanglunli君莉中國網(wǎng)2100.05.24-13:31:002CHP（中國藥典），2000,VolI（一部）：86.3QIYan-fei（戚雁飛），HPLCDeterminationofpoundadenosinehedgehogCapsulefeHPLC測定復方猴頭膠囊中腺昔的含量，Chinesemedicine中成藥，2002,243：1814WuChun-mei侯春敏），YeRong-ping什榕平）,HPLCDeterminationofAdenosineinCordycepsHPLC法測定冬蟲夏草中腺甘的含量，Chineseherbalmedicine中草藥，1999,30,9:658.5LiXue-qing（雪芹），Wang-yan（E閻），BaoTian-tong包天桐），DeterminationofAdenosineinCordycepsfunnyRPliquidchromatograp