媒介生物的抗藥性監(jiān)測工作和預防

1、媒介生物的抗藥性監(jiān)測工作和預防 背 景 抗藥性是影響全球公共衛(wèi)生、農業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)等領域中有害生物控制的重要問題，是影響媒介生物性傳染病預防控制的關健因素?；瘜W殺蟲劑是防制衛(wèi)生害蟲的主要措施之一，在防治蟲媒傳染病中起到了非常重要的作用。但是，由于長期、廣泛、大量的使用，導致病媒生物的抗藥性不斷增加，給除害滅病工作帶來了新的課題。 開展和加強重要病媒生物的抗藥性監(jiān)測，可以指導化學殺蟲劑的科學合理使用，提高控制效果，延緩抗藥性發(fā)展的的速度，減少人畜中毒事件的發(fā)生，保護有益生物，維持生態(tài)平衡。 抗藥性監(jiān)測是害蟲抗藥治理的關健環(huán)節(jié)之一。準確、及時的獲得抗藥性的信息對于成功治理害蟲抗藥性、延長新藥劑的

2、使用壽命、改善環(huán)境具有重要的意義。 監(jiān)測目的 掌握重要病媒生物對主要化學殺蟲劑的抗性水平，了解抗性動態(tài)和發(fā)展規(guī)律。為病媒生物控制中化學殺蟲劑的選擇和使用提供科學依據(jù)；針對不同疫情、不同地區(qū)、不同病媒生物制定藥劑的儲備和使用預案。 為了進一步掌握我省病媒生物對常用殺蟲劑的抗藥性情況，選擇城鎮(zhèn)居室中常見蚊種之一的淡色/或致倦庫蚊和家蠅，在省內不同地區(qū)開展抗藥性監(jiān)測研究。及時了解抗性動態(tài)，分析不同地區(qū)的抗藥性現(xiàn)狀和抗性水平以及同類殺蟲劑在不同地區(qū)的使用效果，研究防制對策，鞏固除害滅病成果等提供科學依據(jù)。 抗藥性性監(jiān)測技術的發(fā)展 害蟲抗藥性監(jiān)測的基礎是抗藥性的檢測技術，害蟲抗藥性監(jiān)測是一個時間過程，監(jiān)

3、視害蟲抗藥性的時間動力學或評價抗藥性治理的有效性。抗藥性監(jiān)測技術主要分為3個層次，即種群水平、蛋白質水平、分子水平。 要 求 抗藥性監(jiān)測，以WHO推薦的測定方法為基礎，統(tǒng)一方法（調查點的選擇、采集方法、實驗方法）、統(tǒng)一標準（死亡蟲體的判定標準）、統(tǒng)一調查對象、統(tǒng)一藥劑、統(tǒng)一調查時間。 監(jiān)測內容和方法 靶標昆蟲淡色庫蚊/致倦庫蚊的幼蟲和成蟲、家蠅成蟲監(jiān)測對象。監(jiān)測點的選擇當?shù)孛浇樯镄约膊〉陌l(fā)生情況；相關疾病媒介生物的種類和發(fā)生的強度；病媒生物對人的騷擾程度等。監(jiān)測點要考慮地理要布，要相對固定。 監(jiān)測時間 病媒生物在當?shù)氐陌l(fā)生高峰期（6-8月），一般同一個蟲種每2年監(jiān)測一次，不同監(jiān)測年份測定時間

4、相對固定。 試蟲的采集 試蟲的采集以居民區(qū)（城市或農村）及人活動頻繁的區(qū)域（公園、綠化帶、村莊周圍500m內）為主。在其東、西、南、北、中5個方位采集樣本，按接近等比例混合后進行抗藥性測定?？顾幮詼y定，在采集試蟲的當代或室內飼養(yǎng)的1-2代進行。蚊蟲的采集：成蚊、幼蟲、卵塊，采集方法及工具。蠅的采集：成蠅，采集方法與工具。蜚蠊的采集：采集方法與工具。 實驗室的培育 1、飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)室面積一般不超過10-12m2，高度不高于，建筑結構應避免自然熱、寒氣候的影響。室內配備溫控設備，干濕、溫度計。溫度 25-28相對濕度 家蠅、蟑螂50%-70%，蚊蟲70%-80%。光照 家蠅、蚊蟲飼養(yǎng)室每日光照9h

5、，蟑螂飼養(yǎng)用黑布遮蓋。 2、飼養(yǎng)設備飼養(yǎng)架放飼養(yǎng)籠用，高2m（可隔3-4層，每層高45-50cm），寬40cm，長2m。飼養(yǎng)架靠墻邊側每層裝有30w日光燈，昆蟲飼養(yǎng)照光用。 飼養(yǎng)籠成蠅飼養(yǎng)籠有鉛絲架和絹紗籠二部份組成。鉛絲架：由8號或10號鉛絲為骨架，鉛絲架的背側二邊裝有二根活動的鉛絲鉤，用作固定骨架用，卸掉二根鉛絲鉤，架子可活動折疊。鉛絲架底部為20號鉛絲織成網(wǎng)眼形。鉛絲架是邊長25cm的四方形。絹紗籠：用絹紗布做成23cm的四方形籠子，絹紗籠四角接15-20cm長的線帶，便于吊扎在鉛絲籠架上。絹紗籠前下方開一長20cm、寬20cm、高20cm的正方形開口，連接15cm的長袖，取放幼蟲缸和更

6、換飼料。幼蟲缸、卵杯、平皿、絹紗布等。 蚊蟲飼養(yǎng)籠四邊為木框架制成，大小為長40cm寬25cm高25cm。上面按裝活動玻璃，四周為銅紗網(wǎng)、底部為木質板，在籠的前端正中開一直徑15cm圓孔，連接長30cm的布袖，便于取放蚊蟲和飼血動物。 蟑螂飼養(yǎng)缸為玻璃缸、不銹缸圓桶、有機玻璃箱，上部四周邊緣均勻涂抹凡士林油脂，以防蟑螂逃逸。內設隱藏架子，規(guī)格視情況而定，缸口用紗布作蓋。產卵及孵化其它器材飼料盤、50-100ml燒杯、500ml燒杯、搪瓷盆、水桶、藥匙、棉花、撈勺等。 3飼養(yǎng)方法 家蠅飼養(yǎng)成蠅：羽化后的成蠅移入飼養(yǎng)籠內，同時放入飼料盤和吮水槽。盤內飼料是用白糖和奶粉1：1比例投放。吮水槽可用50

7、-100ml燒杯，杯內裝滿脫氯水，水面上放一塑料泡沫片，以便蠅吮水停落。飼料和水應及時更換，如變質，蠅吃后易死亡。成蠅羽化后72小時就會產卵，此時應放入盛有麥麩的產卵槽，其配比是麥麩1份和水2份。產卵槽必須每天檢查，如沒有產卵的應重新更換麥麩。已經(jīng)產卵的應及時取出卵槽待孵出一令幼蟲移入幼蟲缸。 幼蟲期：幼蟲接種入幼蟲缸后（幼蟲缸可用500ml燒杯），用絹紗布蓋住，橡皮筋箍緊，以防幼蟲爬出。每只幼蟲缸接種幼蟲約500條。幼蟲缸飼料配比：麥麩100g，奶粉5g，水200ml（一份飼料飼喂幼蟲500條左右）。配比方法：先將奶粉溶化在水中，然后加入麥麩拌勻，水量視麥麩質量可適當調配（麥麩粗吸水少，麥麩

8、細吸水多），其干濕程度以手抓調勻的麥麩輕握拳，飼料內的水分沿指縫滲出而不流滴，松拳后飼料不散落為宜。 蛹期：三令幼蟲成熟后（約一周），返回飼料缸表面化蛹?；紩r，幼蟲先縮成團，24小時后，變紅褐色蛹，后再變成黑褐色。蛹期5天左右開始羽化，移入飼養(yǎng)籠內飼養(yǎng)。 蚊蟲飼養(yǎng)成蚊飼養(yǎng)通常用蚊籠飼養(yǎng)，每籠可養(yǎng)成蚊500只左右?；\內放入用5%葡萄糖液浸透的脫脂棉一小杯作為飼料，每1-2天更換一次。成蚊在羽化后3-5天多數(shù)已完成交配，此時即需供雌蚊吸血。供血時，用體重25g左右的小白鼠，使其腹部向上固定在鐵板架上，剪去腹毛，放入籠內喂血12小時。雌蚊吸血后，在25-28下約3-4天產卵。此時在籠內放入清水一杯

9、，供產卵用。每日在水杯中取出卵塊，移入幼蟲飼養(yǎng)盆的水中。 幼蟲飼養(yǎng)飼養(yǎng)幼蟲的搪瓷盆應經(jīng)常保持清潔，固定專用。每只幼蟲飼養(yǎng)盆放入幼蟲約1500-2000條。飼養(yǎng)用的自來水，必須隔夜脫氯。幼蟲飼料用面粉2份，肝粉1份的混合飼料。以揉松的毛筆蘸取少許混合飼料均勻撒布于水面，每日加飼料1-2次。以不使飼料過剩為度。幼蟲經(jīng)7-10天開始化蛹，化蛹后，用吸管將蛹移入含水約50ml的杯內，將蛹杯置蚊籠內，經(jīng)2-3天即羽化成蚊。 蟑螂飼養(yǎng)成蟲及若蟲的飼養(yǎng)成蟲及若蟲按不同齡期分別于飼養(yǎng)缸內進行飼養(yǎng)。缸內放入2個玻璃平皿，其中1個盛飼料，另1個盛含水的脫脂棉，第2天更換1次，飼料可用餅干，飼養(yǎng)缸內可放若干硬紙盒，

10、供蟑螂棲息活動。 產卵及孵化將快要產卵的雌蟲移入產卵孵化器的小盤內，同時放入盛有飼料及飲水的平皿和14目電鍍鐵紗卷各1個，供雌蟲食料和棲息產卵之用。每日觀察1次，將已產完卵的雌蟲取出再放入另一些將產卵的雌蟲。同時更換大盤內供若蟲棲息的紙卷，將其中的若蟲移入飼養(yǎng)缸內單獨飼養(yǎng)。 注意事項1 飼養(yǎng)室必須保持整潔。2 飼養(yǎng)室飼料要防止霉菌污染。3 飼養(yǎng)室必須密封，嚴防試蟲交叉、外逃。4 嚴禁藥物、接觸過藥物的器材放入飼養(yǎng)室和在飼養(yǎng)室周圍噴灑藥物。 監(jiān)測藥劑 淡色/致倦庫蚊的監(jiān)測藥劑擬除蟲菊酯類：高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯；有機磷類：敵敵畏、倍硫磷、雙硫磷、殺螟硫磷；氨基甲酸酯類：仲丁威；

11、有機氯類：DDT、三氯殺蟲酯。 家蠅的監(jiān)測藥劑擬除蟲菊酯類：高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯；有機磷類：敵敵畏、毒死蜱、甲基吡惡磷；氨基甲酸酯類：殘殺威；有機氯類：DDT。溶劑：以丙酮（分析純）作溶劑。 抗藥性測定參考濃度： 淡色/致倦庫蚊自然品系抗藥性測定（LC50）的參考濃度：DDT1.1 mg/L、三氯殺蟲酯、敵敵畏、仲丁威、二氯苯醚菊酯、溴氰菊酯、右旋丙稀菊酯、高效氯氰菊酯。 家蠅自然品系抗藥性測定（LD50）參考濃度：胺菊酯1.150g /只、三氯殺蟲酯只、敵敵畏為只、仲丁威0.75g /只、二氯苯醚菊酯只、溴氰菊酯0.025g /只、右旋丙稀菊酯0.450g /只、高效氯氰

12、菊酯只。測定方法 蚊幼蟲的抗藥性測定蚊幼蟲的測定：采用藥液浸漬法（WHO推薦方法），以4齡初期幼蟲為測試對象，測定半數(shù)致死濃度（LC50）。器具：50ml、500ml容器，1ml、5ml刻度移液管。環(huán)境條件：溫、濕度試蟲：正常品系、自然品系、齡期等 濃度的設定：根據(jù)上述提供的半數(shù)致死濃度參考數(shù)據(jù)，各測試單位在正式測試前，需進行一次預測，根據(jù)預測結果，按等差或等倍設定實驗所需濃度（設置5-7個系列濃度）。測定步驟： 取50ml容器若干只，先放入適量的脫氯水（45ml左右），用吸管吸取四齡期幼蟲20-25條，放入幼蟲后，用脫氯水補至50ml。取250-500ml容器若干只，先在每只容器的邊緣粘貼一

13、小塊膠布，注明測試藥物名稱和濃度值。 在每只容器內加脫氯水150ml。然后根據(jù)設定的不同濃度的丙酮藥液，用刻度移液管吸取藥液分別加入容器內，用玻璃棒從低濃度向高濃度逐一攪拌均勻，把50ml容器內的幼蟲輕輕地分別倒入500ml容器內，合計成200ml水溶液，設以200ml脫氯水和加入與藥液等量的丙酮液作對照，在實驗室相應條件下，放置24h。24h后檢查記錄各系列濃度的幼蟲死亡數(shù)。同一個測試濃度重復4-5次，供試蟲數(shù)共計100條。 死亡判斷標準：檢查死亡數(shù)時，可用尖頭鑷子或昆蟲針輕輕觸動幼蟲頭部和尾部，不動者為死亡，只是震顫也視為死亡。如果有化蛹的應該剔除，若化蛹率超過10%，對照組死亡率超過20

14、%以上者，試驗視為無效，整個實驗應重做。結果處理：將測試所獲得的結果匯總整理后，計算LC50。 成蚊的測定成蚊抗藥性測定方法主要有兩種，分為濾紙圓筒接觸法和微量點滴法。濾紙圓筒接觸法：這是一種常用的測定方法，是WHO推薦的標準方法之一。器具：由兩個筒聯(lián)成一套，一個為接觸藥紙用，另一個為蚊蟲接觸藥紙后作恢復飼養(yǎng)用。接觸筒用有機玻璃制成，筒長，直經(jīng)5cm，一端用尼龍紗封口，另一端有螺紋。另有一白色不透明的有機玻璃方隔板，77cm，中間有一直經(jīng)5cm的圓孔和高1cm的邊圈（有內螺紋），每隔板內裝活動抽板一塊，抽板有直經(jīng)的圓孔，拉動抽板可使隔板兩側的圓筒封閉或打通，每兩圓筒易于裝上或取下聯(lián)成一套。 藥

15、紙的制備：將白油和乙醚按1:2比例混合作為溶劑。殺蟲劑按需要量溶解其中，配成一定濃度，吸取均勻滴于的新華1號濾紙或其他質量相近的濾紙上。2h后后待乙醚完全揮發(fā)即可應用。藥紙制備后應在6h內使用，如需要保存可將藥紙裝入黑色的袋中，在較低溫度下保存，但一經(jīng)開啟后即不能儲存，必須在2-3天內用完，如果已經(jīng)裝入接觸，就只能用一次。 測試時先把恢復筒安裝在隔板的一面，用吸蚊器吸取20-25只雌蚊（羽化后約2-3天，未吸血）吹入筒內，然后關閉隔板，在隔板另一面裝上已襯貼藥紙的接觸筒，把隔板拉開，將恢復筒內蚊蟲輕輕吹入接觸筒，迅速關上隔板，將筒放平，開始計算接觸時間，接觸1h。完畢后再抽開隔板將蚊蟲吹入恢復

16、筒，關上隔板，將筒直放，用浸有5%葡萄糖水的棉花球置于尼龍網(wǎng)上。觀察24h試蟲死亡數(shù)，重復4-5次，每劑量應至少測100只蚊蟲。 點滴法的要求：1、試蟲的均性；2、劑量的選項擇及配制（預測3個濃度，共設置5-7個濃度）；3、試蟲來源；4、麻醉；5、點滴（劑量準確、部位準確、性別準確）6、觀察；7、死亡率等。 成蚊的微量點滴法：操作較精確并要求高，是研究抗性機制的重要方法之一。器具：旋轉式微量點滴器或自制玻璃毛細管點滴器、小型養(yǎng)蚊籠等。溶劑：分析純丙酮。當固體殺蟲劑如濃度過高（如超過1%）時，容易在點滴器針頭及蟲體表面上結晶，在丙酮內加入5%橄欖油，可防止這種現(xiàn)象。藥液配制：每一次測定設4-5個

17、系列濃度，一般情況下藥液濃度均較低，最高濃度不超過0.5%。測定結果以每蚊受藥量計算（l/蚊），按每個劑量的死亡率求出LD50和LD95。 試蟲來源：應在試驗前夜捕捉剛吸血蚊蟲攜回室內至次日上午做測定試驗，此時胃血已開始消化。如果蚊蟲專嗜人血的，于當日早晨在室內捕捉已吸血的蚊蟲，或者于夜間捕捉飛入人室的雌蚊，在籠內飼以動物血，待胃血消化至謝拉氏3-4期時測定。 操作程序：把上述吸血雌蚊用乙醚麻醉，每20頭仰臥排列在一玻璃器皿上，用藥液點于胸部的腹面，每蟲受藥量一般為，滴藥后把蚊蟲迅速移入小型養(yǎng)蚊籠內恢復，給以正常飼養(yǎng)，24h后檢查死亡數(shù)。每劑量重復1-2次，環(huán)境條件與正常飼養(yǎng)類同。 家蠅的抗藥

18、性監(jiān)定微量點滴法：全國家蠅抗性協(xié)作組統(tǒng)一推薦方法。器具：點滴器采用10l、20l微量進樣器，小型養(yǎng)蠅籠等。藥劑：先將殺劑原藥用丙酮（分析純）稀釋成1%母液（可根據(jù)實際需要），然后按等差或等倍配制成5-7個系列濃度，放置于冰箱內備用（使用玻璃溶器，時間不過長）。 取3-7日齡家蠅雌性成蟲，體重為18-20mg/只。經(jīng)乙醚輕度麻醉后，選取健康雌蟲50只，放置于平皿中，背部向上，然后用點滴器將藥液按以上設置的系列濃度由低到高的順序，點滴于中胸背板上（），點滴完畢把試蟲放入小型養(yǎng)蠅籠內（亦可用500ml潔凈的燒杯替代），放入少量的奶粉和海綿或脫脂棉球供水，飼養(yǎng)24h，觀察死亡數(shù)，用丙酮液替代藥液作空白

19、對照。每個系列濃度點滴家蠅50只，試驗重復二次。 死亡判斷和結果處理：凡腹部上翻，六足抽搐，用可用尖頭鑷子或昆蟲針輕輕觸之不能翻動5爬行者判為死亡。當死亡率超過20%時，整個試驗需要重新進行。將測試所獲得的結果匯總整理后，計算LD50。 蜚蠊抗性監(jiān)測三角燒瓶藥膜法、點滴法器具：500ml三角燒瓶、磨口瓶、10l和100l微量進樣器、飼養(yǎng)籠等。藥劑：先將殺劑原藥用丙酮（分析純）稀釋成1%母液（可根據(jù)實際需要），然后然后進一步稀釋成0.05%的涂膜液盛于磨口瓶內，注明標簽，放置于冰箱內備用（使用玻璃溶器，時間不過長）。試蟲：采集于調查點的當?shù)貎?yōu)勢種，如德國小蠊、美洲大蠊、黑胸大蠊等，攜回實驗室正常飼養(yǎng)3-5天后備用。 三角燒瓶藥膜法：藥膜瓶的制備：取潔凈的三角燒