DB35T 1958-2021 鴨巴泰病毒RT-PCR檢測方法

1、ICS 11.22035CCS B 41福建省地方標準DB35/T 19582021鴨巴泰病毒 RT-PCR 檢測方法Detection method of RT-PCR for duck Batai virus2021 - 02 - 09 發(fā)布2021 - 05 - 09 實施福建省市場監(jiān)督管理局發(fā) 布DB35/T 19582021DB35/T 19582021III目次前言II范圍1規(guī)范性引用文件1術(shù)語和定義1設(shè)備、材料和試劑1樣品采集、前處理和保存2RT-PCR 操作步驟2結(jié)果判定3附 錄 A （規(guī)范性）試劑的配制及引物參考序列4附 錄 B （資料性）RT-PCR 檢測結(jié)果電泳圖6前言本

2、文件按照GB/T 1.12020標準化工作導(dǎo)則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出 本文件由福建省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。本文件起草單位：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、福州海關(guān)技術(shù)中心、福建省動物疫病預(yù)防控制中心、寧德海關(guān)檢驗檢疫技術(shù)中心。本文件主要起草人：傅秋玲、傅光華、鄭騰、李中華、葉洪、黃瑜、萬春和、程龍飛、施少華、張體銀、劉榮昌、陳翠騰、彭春香、陳紅梅、陳珍、朱春華。DB35/T 19582021DB35/T 19582021 PAGE 5 PAGE 6鴨巴泰病毒 RT-PCR 檢測方法范圍本文件規(guī)定了鴨巴泰病毒核酸診斷的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT

3、-PCR）的檢測方法。本文件適用于鴨巴泰病毒感染的流行病學(xué)監(jiān)測和診斷。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 66822008 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。GB 194892008 實驗室 生物安全通用要求術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1鴨巴泰病毒Batai virus；BATV該病毒屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）正布尼亞病毒屬（Orthobunyavirus）的成員，為有囊膜病毒，其基因組為單股負鏈

4、分節(jié)段RNA，大小約12 kb，包含S、M和L等3個基因片段，分別編碼病毒的核衣殼蛋白，囊膜蛋白和聚合酶蛋白。3.2鴨巴泰病毒病 Batai virus disease鴨巴泰病毒病在我國養(yǎng)禽業(yè)中，尤其是種番鴨、麻鴨中流行，其臨床表現(xiàn)以種（蛋）鴨產(chǎn)蛋下降、卵巢出血和脾臟輕度出血為特征，與禽坦布蘇病毒病相似，易引起臨床混淆甚至誤診。此外，該病還危害肉鴨，臨床上以生長不良為特征。設(shè)備、材料和試劑設(shè)備PCR 擴增儀。微量可調(diào)移液器（100 L1000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L）。4.1.3 冰箱（2 8 、-20 ）。高速冷凍離心機（其最高轉(zhuǎn)速應(yīng)大于 12 000 r

5、/min）。組織勻漿器。手術(shù)剪。手術(shù)鑷。電泳儀。電泳槽。凝膠成像系統(tǒng)。旋渦振蕩器。超凈工作臺。材料和試劑試驗用水應(yīng)符合 GB/T 66822008 中一級水的規(guī)格要求。磷酸鹽緩沖液（PBS）配制方法見附錄 A 的A.1。焦炭酸二乙酯處理水（Diethy Pyrocarbonate，DEPC 水）配制方法見附錄 A 的A.2。Trizol。三氯甲烷。異丙醇。無水乙醇。75%乙醇：配制方法見附錄 A 的A.3。溴化乙錠溶液：配制方法見附錄 A 的 A.4。1TAE 緩沖液：配制方法見附錄 A 的 A.5。1.0%瓊脂糖凝膠：配制方法見附錄 A 的A.6。DNA 相對分子質(zhì)量標準物：DL2 000。

6、10加樣緩沖液：配制方法見附錄 A 的A.7。RT-PCR 檢測用引物和使用方法見附錄 A 的A.8。對照樣品：以提取的鴨巴泰病毒提取的核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）作為陽性對照， 以其他禽源 RNA 病毒（如禽坦布蘇病毒）RNA 樣品作為陰性對照，以滅菌去離子水作為空白對照。樣品采集、前處理和保存樣品采集和運輸采樣所用器具（手術(shù)剪、手術(shù)鑷和容器等）應(yīng)預(yù)先滅菌處理，在采樣過程中應(yīng)戴一次性手套和口罩， 以免樣品間交叉污染。采集產(chǎn)蛋下降疑似病鴨的卵巢或（和）脾臟裝入滅菌過的容器中，編號后置于冷藏箱內(nèi)在24 h內(nèi)送至實驗室。樣品處理在超凈工作臺中取出采集的待檢樣品置于滅菌平皿內(nèi)

7、，充分剪碎后與磷酸鹽緩沖液按體積比1:3的比例制成組織勻漿液，反復(fù)凍融3次后于4 10 條件下8 000 r/min離心30 min，取上清用于核酸（RNA）的抽提，或置-20 條件下凍存?zhèn)溆谩悠繁４娌杉蛱幚淼臉悠?，? 8 條件下保存應(yīng)不超過24 h。否則，需保存在-20 條件下，但時間不超過7 d；若需較長時間待處理，應(yīng)保存在-70 條件下，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。RT-PCR 操作步驟病毒 RNA 提取病毒RNA提取應(yīng)采用以下步驟或等效的商品化RNA提取試劑盒進行，且在實驗操作過程中應(yīng)遵守GB 194892008的要求。取200 L待檢樣品，加入1 mL Trizol試劑，用移液器充分混勻

8、，室溫放置5 min；加入200 L 三氯甲烷，旋渦振蕩30 s混勻，室溫放置15 min；4 下12 000 r/min離心15 min；取上層水相加入等體積異丙醇，上下顛倒數(shù)次混勻，-20 放置20 min；4 下12 000 r/min離心15 min；棄上清液，沉淀用1 mL 75乙醇清洗；10 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀室溫干燥5 min；加20 L DEPC 水溶解RNA沉淀。-20 冰箱保存?zhèn)溆?，RNA溶液應(yīng)避免反復(fù)凍融，并盡快用于檢測。空白對照、陰性對照和陽性對照進行同步操作。RT-PCR 反應(yīng)RT-PCR反應(yīng)體系為25 L，每個反應(yīng)管的反應(yīng)體系為：依次

9、加入14 L 焦炭酸二乙酯（DEPC）處理水，2.5 L反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液，2.5 L Taq聚合酶緩沖液，0.5 L dNTP，0.5 L Taq聚合酶，0.5 L 反轉(zhuǎn)錄酶，0.5 L RNA酶抑制劑，上下游引物各0.5 L (10 mol/L)，樣品的RNA各 3 L?；靹蚝? 000 r/min離心15 s，使反應(yīng)混合液都沉降到PCR管底。將上述混合物按照以下步驟進行RT-PCR： 第一步是反轉(zhuǎn)錄，42 ，30 min；第二步是PCR循環(huán)，94 預(yù)變性3 min；循環(huán)參數(shù)為94 變性30 s，52.4 退火30 s，72 延伸1 min，循環(huán)35 次；最后，72 延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后

10、，可將產(chǎn)物保存于4 。6.3 RT-PCR 產(chǎn)物電泳反應(yīng)結(jié)束后，分別取待檢樣品、陰性對照樣品、陽性對照樣品和空白對照樣品各5 L RT-PCR產(chǎn)物與0.5 L加樣緩沖液混合均勻，加入到1.0%瓊脂糖凝膠板的樣孔中；同時，在另一樣孔中加5 L DL2 000標準分子量對照；以5 V/cm的電壓電泳30 min后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。結(jié)果判定結(jié)果判定標準當(dāng)陽性對照出現(xiàn)480 bp特異性條帶（見附錄B電泳圖2號泳道）、陰性對照（見附錄B電泳圖3號泳道） 和空白對照均無擴增條帶（見附錄B電泳圖4號泳道）時，表明本次實驗成立。結(jié)果判定當(dāng)待檢樣品出現(xiàn)480 bp特異性條帶（見附錄B電泳圖5號泳道），結(jié)

11、果判為陽性，若無特異性擴增條帶（見附錄B電泳圖6號泳道），結(jié)果判為陰性。附錄A（規(guī)范性）試劑的配制及引物參考序列0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO41.15gKH2PO40.2 g將上述試劑溶于800 mL滅菌雙蒸水中，定容至1 000 mL，1.034105 Pa高壓滅菌30 min，4 保存?zhèn)溆谩＝固克岫阴ィ―EPC）處理水于三蒸水按0.1%加入DEPC，磁力攪拌過夜，1.034105 Pa高壓滅菌20 min，冷卻備用。75%乙醇取無水乙醇750 mL加入滅菌雙蒸水250 mL，定容至1 000 mL，-20保存?zhèn)溆?。溴化乙錠（EB）溶

12、液溴化乙錠20 mg滅菌雙蒸水至20 mL說明：也可采用市售商品化的更環(huán)保、更安全的熒光染料，比如Goldviewer等。1TAE電泳緩沖液配制0.5 mol/L 乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH 8.0）二水乙二銨四乙酸二鈉18.61 g氫氧化鈉（10%）調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水至100 mL配制50TAE電泳緩沖液三羥基甲基氨基甲烷（Tris）242 g冰乙酸57.1 mL0.5 mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH8.0）100 mL 滅菌雙蒸水至1 000 mL用時用滅菌雙蒸水稀釋50倍使用。配制1TAE電泳緩沖液50TAE電泳緩沖液20 mL滅菌雙蒸水至1 000 mL1.0%瓊脂糖凝膠瓊脂糖1.0 g1TAE電泳緩沖液至100 mL置微波爐中加熱至完全融化，待冷至50 60 時，加熒光染料溶液5 L，搖勻后倒入制膠板中， 待完全凝固后取下加樣梳，備用。10加樣緩沖液聚蔗糖25 g溴酚藍0.1 g二甲苯青0.1 g滅菌雙蒸水至100 mLRT-PCR檢測用引物序列為BATV-F5-CTGCAGTTTTMAGATTGTTTC-3 BATV-R5-TGTTTTATTTCCTGTAGGTAC-3注1：M（A/C）。注2：此對引物針對BATV囊膜蛋白M基因設(shè)計而