第21章基因診斷與基因治療ppt課件

1、第 二 十 一 章基因診斷與基因治療Genetic Diagnosis and Gene Therapy.基因(gene) 基因是為生物活性產(chǎn)物編碼的DNA功能片斷，這些產(chǎn)物主要是蛋白質(zhì)或各種RNA。.基因變異致病類型內(nèi)源基因的變異基因構(gòu)造突變基因表達異常外源基因的入侵.第 一 節(jié)基因診斷Gene Diagnosis. 二、分類 DNA診斷以DNA為檢測對象的診斷方法。 RNA診斷以mRNA為檢測對象的診斷方法。一、基因診斷的概念和特點 一、定義利用現(xiàn)代分子生物學和分子遺傳學的技術(shù)和方法，直接檢測基因構(gòu)造及其表達程度能否正常，從而對疾病作出診斷的方法。.三、特點針對性強 特異性高靈敏度高 適用

2、性強，診斷范圍廣.二、 基因診斷常用技術(shù)方法 一、核酸分子雜交技術(shù)二、聚合酶鏈反響三、基因測序四、基因芯片五、DNA指紋.一、核酸分子雜交(molecular hybridization)技術(shù) 核酸分子雜交可用以檢測樣本中能否存在與探針序列互補的同源核酸序列。 核酸探針 是一類具有放射性標志或化學標志的并與目的目的DNA或RNA分子序列互補的寡核苷酸片段。 . 探針是可以同某種待研討的核酸序列或蛋白多肽鏈特異結(jié)合的任何分子，經(jīng)標志之后可用來檢測目的DNA/RNA 或蛋白質(zhì)分子。 實驗流程：提取DNA(限制酶切)凝膠電泳膜轉(zhuǎn)移雜交放射自顯影分析.建立在核酸雜交技術(shù)根底上的常用基因診斷方法1、限制

3、性內(nèi)切酶(restriction endonuclease)酶譜分析法2、DNA限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析法 3、等位基因特異寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO)探針雜交法.1、限制性內(nèi)切酶酶譜分析法 是利用限制性內(nèi)切酶和特異性DNA探針來檢測能否存在基因變異的一種方法。.Mst酶切位點(CCTNAGG)53正?；?3突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析AT .+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患

4、者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析.2、DNA-RFLP分析法 中性突變是指在人基因組中，平均每200對堿基可發(fā)生一對變異的景象。 DNA多態(tài)性是指中性突變導(dǎo)致個體間核苷酸序列的差別。 限制性片段長度多態(tài)性是指DNA多態(tài)性假設(shè)發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點上，酶切水解該DNA片段就會產(chǎn)生長度不同的片段。.RFLP分析法.3、ASO雜交法 根據(jù)知基因突變位點的核苷酸序列，人工合成相應(yīng)于正常和突變基因堿基序列的兩種寡核苷酸探針，用它們分別與受檢者DNA進展分子雜交來檢測能否存在等位基因突變。 .ASO雜交法探針：M N M N M N M N 正?；?純合突變 雜合突變 基因缺陷 新的突變類

5、型？ +.二、聚合酶鏈反響 (polymerase chain reaction, PCR) 是利用特異的引物，特異地擴增目的DNA的方法。 實驗流程：提取DNAPCR凝膠電泳顯色分析.5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 555 5 551、根本任務(wù)原理.Cycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴展100萬倍以上。.2、常用的PCR方法： 常規(guī)PCR、巢式PCR、多重PCR、多種PCR、不對稱PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、定量反轉(zhuǎn)錄PCR、mRNA差別顯示PCR、原位

6、PCR、實時PCR等等。.3、在PCR技術(shù)根底上的常用基因診斷方法PCR-SSCP法*PCR-ASO法PCR-RFLP法PCR-限制酶譜法PCR-STR短串聯(lián)反復(fù)序列，short tandem repeat. SSCP是指一樣長度的單鏈DNA因其堿基序列不同，甚至單個堿基不同，都能夠構(gòu)成不同的空間構(gòu)象，從而在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時泳動速率不同的景象。 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (single strand conformation polymorphism, SSCP).PCR-SSCP分析 是指PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正常基因和變異基因的遷移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在。.

7、正常人純合突變雜合突變Leber 遺傳性神經(jīng)病患者 PCR/SSCP分析 線粒體DNA第11778位GA所致+.三、基因測序(gene sequencing) 即測定某一基因的堿基序列。 實驗流程：提取DNA分別出有關(guān)基因測序分析診斷 基因測序的方法：化學裂解法DNA鏈末端合成終止法DNA自動測序.四、基因芯片gene chip) 基因芯片，又稱DNA芯片、DNA陣列、寡核苷酸微芯片DNA chip、DNA arrays、oligonucleotide micro-chip是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地陳列固定于支持物上，然后與待測的標志樣品的基因按堿基配對原理進展雜

8、交，再經(jīng)過激光聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進展掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。.基因芯片的運用1、在診斷中的運用 核酸序列分析、基因表達分析、尋覓新基因、突變基因和基因多態(tài)性檢測等2、在藥學研討中的運用 藥物挑選、藥物作用機制研討、耐藥菌株、藥敏檢測、毒理學研討、環(huán)境化學毒物的挑選、基因掃描等.五、DNA指紋(DNA fingerprint) 在人基因組DNA中有高度可變的“小衛(wèi)星區(qū)域，采用“小衛(wèi)星基因探針，在同一限制酶切產(chǎn)物的DNA雜交圖譜上，同一個體不同組織來源的DNA的譜帶完全一致，而不同個體之間同卵雙生除外譜帶都不一樣，好像人的指紋

9、具有高度個體特異性一樣，因此這種雜交圖譜被稱為DNA指紋或遺傳指紋genetic fingerprint。. 簡言之：DNA指紋或遺傳指紋是指采用“小衛(wèi)星基因探針進展DNA分子雜交 Southern 印跡，Southern blotting所得的圖譜。 實驗流程：提取DNA限制酶切凝膠電泳膜轉(zhuǎn)移雜交放射自顯影分析.三、基因診斷的運用遺傳疾病腫瘤感染性疾病傳染性流行病判別個體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學中個體識別、親子鑒定.總結(jié) 基因診斷的概念、特點、常用的技術(shù)方法及運用。.復(fù)習題1、名詞解釋： 基因診斷、DNA診斷、RNA診斷、RFLP分析、SSCP、基因芯片、DNA指紋2、簡述基因診斷的

10、特點、常用技術(shù)方法及可用于診斷的疾病。簡述基因變異致病的類型及內(nèi)源性基因變異的類型。簡述限制性內(nèi)切酶譜分析法、ASO探針雜交法、PCR-SSCP分析、基因芯片、DNA指紋等的實驗流程。.第 二 節(jié)基因治療Gene Therapy.一、基因治療的概念早期是指用正常的基因整合入細胞基因組，以校正和置換致病基因的一種治療方法。 目前廣義上來講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揚作用，以到達治療疾病目的的方法。一、基因治療的概念.二、基因治療的根本方法1、基因矯正 (gene correction)2、基因置換 (gene replacement)3、基因增補 (gene augment

11、ation)4、基因失活 (gene inactivation) . 1、基因矯正 (gene correction) 指將致病基因的異常堿基進展糾正，而正常部分予以保管。 納米鉗.A G C T G T G A A G T C G T GT C G A C A C T T C A G C A CabnormalgeneGene correctionnormalgeneTACG.2、基因置換 (gene replacement) 指用正常的基因經(jīng)過體內(nèi)基因同源重組，原位交換致病基因，使細胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常形狀。.A G C T G T G C A A G T C G T GT C G A

12、 C A C G T T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G C A A G T C G T GT C G A C A C G T T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G T A A G T C G T GT C G A C A C A T T C A G C A CabnormalgeneGene replacement.3、基因增補 (gene augmentation) 將目的基因?qū)氩∽兗毎蚱渌毎?，不去除異常基因，而是?jīng)過目的基因的非定點整合，使其表達產(chǎn)物彌補缺陷基因的功能或使原有基因表達加強。.A G C T G

13、 T G C A A G T C G T GT C G A C A C G T T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G T A A G T C G T GT C G A C A C A T T C A G C A CabnormalgeneGene augmentation.4、基因失活 (gene inactivation) 指將特定的序列導(dǎo)入細胞后，在轉(zhuǎn)錄或翻譯程度阻斷某些基因的異常表達，已到達治療疾病的目的。.幾種常見的基因失活技術(shù)反義核酸技術(shù)核酶技術(shù)三鏈技術(shù)干擾RNA技術(shù)肽核酸基因敲除.反義(antisence)核酸技術(shù) 是指用人工合成的RNA或DNA

14、來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，使編碼基因不能轉(zhuǎn)錄為mRNA，因此不能翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。.反義RNA技術(shù) 反義RNA是指與mRNA互補，且能抑制與疾病發(fā)生直接相關(guān)基因表達的RNA。 反義RNA技術(shù)是指利用反義RNA在mRNA程度上封鎖基因表達，最終可經(jīng)過調(diào)理劑量，來治療由基因突變或過度表達所致的疾病或嚴重感染性疾病。 .T C G A C A C A T T C A G C A CA G C T G T G T A A G T C G T GabnormalgeneGene inactivationabnormalmRNA U C G A C A C A U U C A G C A C反義RNA A

15、 G C U G U G U A A G U C G U GAbnormal proteinAbnormal protein.核酶(ribozyme)技術(shù) 經(jīng)過核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當?shù)牟课?，?gòu)成錘頭核酶構(gòu)造，催化對靶RNA分子的剪切，從而破壞靶RNA分子到達治療疾病的目的。.5353靶RNA核酶分子核酶技術(shù).三鏈技術(shù)(triplex approach) 又稱為反基因戰(zhàn)略(antigene stragegy)，是利用脫氧寡核苷酸能與雙螺旋雙鏈DNA專注性序列結(jié)合，構(gòu)成三鏈DNA，從而在轉(zhuǎn)錄程度或復(fù)制程度阻止基因轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的技術(shù)。 能構(gòu)成三鏈DNA的脫氧寡核苷酸稱為三鏈DNA構(gòu)成脫氧寡核

16、苷酸t(yī)riplex-forming oligonucleotide,TFO)。.復(fù)制、轉(zhuǎn)錄三鏈DNA技術(shù).干擾RNA(interference RNA,RNAi)技術(shù) RNAi是指在特定因子作用下，有導(dǎo)入胞內(nèi)的雙鏈RNA降解生成的約22nt左右的SiRNAs(single strand RNAi)。 RNAi技術(shù)是指利用堿基互補配對原那么，使RNAi和靶DNA結(jié)合，同時誘導(dǎo)激活體內(nèi)的基因沉默因子，從而使靶DNA降解。.dsRNARNAi-DNARNA、DNA降解干擾RNA技術(shù)RNAi.RNAi技術(shù)的特點特異性強效率性高作用時間長可經(jīng)過細胞屏障而發(fā)揚作用.肽核酸(peptide nucleic

17、acid,PNA)技術(shù) PNA是指DNA-肽復(fù)合物。 PNA技術(shù)是利用多肽與DNA的特異性結(jié)合，專注地抑制某一基因的表達。.肽肽核酸技術(shù).基因敲除(gene knock-out)技術(shù) 指有目的的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。.三、基因治療的其他方法1、“自殺基因的運用 某些病毒或細菌的基因所表達的酶能將對人體無毒或低毒的藥物前體在人體細胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎拘援a(chǎn)物，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細胞也被殺死，故稱這類基由于自殺基因。 自殺基因 無毒、低毒的藥物前體 細胞毒性產(chǎn)物細胞死亡.2、基因疫苗的運用 將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達系統(tǒng)的質(zhì)粒上，然后將質(zhì)粒直接導(dǎo)入人或動物體內(nèi)，讓其在宿主細胞內(nèi)表

18、達抗原蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)對。.重組表達質(zhì)粒外源性抗原基因基因疫苗.二、基因治療的根本程序一、治療性基因的選擇 目的基因的選擇二、基因載體的選擇三、靶細胞的選擇四、基因轉(zhuǎn)移五、外源基因表達的挑選 利用載體中的標志基因 有neor標志基因時，用 418進展挑選六、回輸體內(nèi) 靜脈回輸 自體骨髓移植 埋入皮下組織病毒載體*非病毒載體體細胞生殖細胞間接體內(nèi)療法(ex vivo)直接體內(nèi)療法(in vivo). 常見基因載體的優(yōu)缺陷載體 優(yōu)點 缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒 基因組小并且簡單 僅感染分裂細胞 穩(wěn)定整合于宿主基因組 隨機整合能夠?qū)е峦蛔?生物學特性清楚 經(jīng)常只需短暫表達 可高效轉(zhuǎn)入復(fù)制中的細胞 病毒滴度低107pfu/ml 對宿主無害 能夠會于有復(fù)制才干的病毒重組腺病毒相關(guān)病毒 基因組小 未知 可特異整合于人染色體19q 需腺病毒輔助復(fù)制 以人細胞作為宿主 攜帶外源基因才干有限 無毒，無致病性 難