實驗93RedET同源重組ppt課件

1、Red/ET同源重組技術2021年3月25日 內 容一、 什么是Red/ET同源重組二、 技術的特點三、 作用機制四、 功能元件五、操作流程及關鍵要素六、在基因工程中的主要運用七、 新技術的開展八、在其他細菌中的運用 遺 傳 重 組基因組的可變性和穩(wěn)定性之間必需維持一個恰到益處的平衡，這樣才干使生物體得以生存并能世代相傳，繁衍不息。染色體的遺傳差別主要由兩種 機制產生，一種是突變，一種是遺傳重組。 重組可分為四類DNA序列、蛋白質因子 狹義遺傳重組：涉及到DNA分子內斷裂-復合的基因交流 遺傳重組與重組DNA技術 異常廣義遺傳重組：任何呵斥基因型變化的基因交流過程一、 什么是Red/ET同源重

2、組1. 概念 Red/ET重組是新近出現(xiàn)的一種利用來自E. coli中 噬菌體的重組酶Red/Red 或者是來自 Rac 噬菌體的重組酶RecE/RecT 進展基因同源重組的DNA工程技術。2. 原理 首先重組酶沿53方向消化雙鏈DNA，顯露粘性末端15-50bp。隨后重組酶介導單鏈退火修復single- strand annealing，即載體和插入片段的黏性末端15-50bp 互補構成穩(wěn)定的帶缺刻的環(huán)狀重組質粒，轉化大腸桿菌后能自動被修復為閉合的環(huán)狀質粒3. 特點： Red同源重組技術具有同源序列短(1550bp)、重組效率高、操作簡單、快速的特點。4. 運用 這種技術可在DNA靶標分子的

3、恣意位點進展基因敲除、敲入、點突變等操作,無需運用限制性內切酶和銜接酶。此外,這種新型重組技術可直接將目的基因克隆到載體上,目的基因既可來源于細菌人工染色體也可是基因組DNA。Red同源重組技術使難度較大的基因工程實驗順利進展,大大推進功能基因組研討的開展。g b al phageETRac phage Rac recE/recT 支配子 = red 支配子, 支配子中的重組酶Red/Red 或者RecE/RecT協(xié)同配合完成重組作用； recE = red ：53 dsDNA核酸外切酶； recT = red ：ssDNA結合和退火蛋白； red： 防止 E. coli中的核酸酶 RecBC

4、D對外源線性DNA片段的消化。噬菌體的pL支配子表示圖 Reda(RecE)Red同源重組原理表示圖Single-strand annealingStrand invasion35Digestion Binding35Redb(RecT)Repair/ReplicationSelectionRecE/RecT和Red/Red兩重組系統(tǒng)的差別 “線狀DNA線狀DNA重組，選用RecE/RecT重組酶系統(tǒng)； “線狀DNA環(huán)狀DNA重組，選用Red/Red重組酶系統(tǒng)； 根據(jù)需求選擇含不同抗生素抗性基因Ampr、Hygr、Tetr和不同的誘導型啟動子pBAD、pTet的重組酶系統(tǒng)表達質粒。 質粒: p

5、SC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) pSC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)RecE/RecT和Red/Red兩重組系統(tǒng)對不同類型底物重組效率的差別 Red同源重組技術相關文獻Nature Genetics (1998)Nature Biotechnology (2000)1. 不依賴RecA蛋白，在重組酶系統(tǒng)Red/Red或RecE/RecT的相互配合下，含短同源臂1550bp的供體DNA分子能直接重組到受體DNA分子上

6、，實現(xiàn)交換、插入、刪除、突變等；2. 不受靶標DNA分子大小的限制；3. 不受內切酶切位點的限制；4. 準確性：不依賴RecA蛋白，減少了引入非預期的突變、 缺失、交換等的幾率； 5. 簡便快捷：省去了中間質粒的構建，減少實驗步驟、縮短實驗周期。二、Red/ET同源重組技術的特點三、 Red/ET重組的作用機制Red/ET重組鏈入侵模型1.鏈入侵方式Red/ET同源重組鏈退火模型2.鏈退火模型四、 Red/ET重組中的功能元件1. Red、Red和RedRed：以三聚體的方式構成“漏斗型活性的蛋白， 5-3外切酶活性。Red構造A和與DNA相互作用的方式B圖片來自Subramanian et

7、al. 2003 Red：與ssDNA結合構成絲狀體，催化與互補ssDNA之間的退火。 Red：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶對外源DNA的降解。 2. RecE和RecTRecE：C端39kDa的部分才是5-3外切酶活性必需，對5端為羥基的底物也有活性。 RecT：與ssDNA結合構成絲狀體，催化與互補ssDNA之間的退火。3. RecA 個亞基構成有活性的RecA蛋白，細菌中廣泛存在且高度保守，有同源重組酶、DNA損傷修復、DNA依賴ATPase活性等功能。 可誘導SOS反響、挽救DNA復制叉等，提高電擊后細胞的活力，添加電轉化效率。五、 Red/ET重組操作流程引物設計合成線性

8、供體dsDNA底物的制備線性載體的制備重組反響重組產物轉化至感受態(tài)細胞重組子挑選重組子檢測1. 設計合成引物 設計引物時要遵照普通引物設計的根本原那么，但是上下游引物要加上15-20bp的載體同源序列。載體同源序列如何添加主要分以下兩種情況：1載體酶切后是5端突出或平末端，那么引物上的同源序列包括5端突出序列的同源序列。2載體酶切后是3端突出，那么引物上的同源序列不包括3端突出序列的同源序列。引物設計方法同源臂長度對Red/ET重組效率的影響數(shù)據(jù)來自Zhang et al. 1998 同源臂的長度在1550bp時，重組效率就能滿足實驗要求，重組效率隨著同源臂長度的添加而添加。2. 線性供體ds

9、DNA底物的制備 選用保真度高的DNA聚合酶如Phusion、Pyrobest等，減少PCR反響中的突變；擴增GC含量較高的DNA片段時，選用Triplemaster、HotStarTaq 等，用合成的引物PCR擴增獲得dsDNA底物； 純化PCR產物： 1減少模板背景對挑選任務帶來的難度； 2降低其剩余引物與靶標DNA片段的結合，提高重組效率； 3去處PCR產物中的鹽離子，提高轉化效率。 降低模板對挑選任務帶來的難度； 1純化回收PCR產物； 2內切酶消化處置模板； 3運用R6K復制子。 線性化載體可以經過酶切或PCR擴增兩種方法獲得。1酶切 選取適宜的位點，單酶切或雙酶切皆可,質粒的線性化

10、不徹底，將導致陰性克隆的產生，為了提高陽性率，建議經過雙酶切進展質粒線性化。2PCR擴增 選取適宜的位點，設計正向和反向引物，引物長度普通在18-20bp左右，建議用高保真的聚合酶擴增。為了防止模板質粒DNA對后續(xù)實驗的影響，建議用Dpn I內切酶消化PCR產物，降低背景，提高陽性率。 不論采取哪種方法，最終線性化載體的濃度需50ng/ul，高濃度的載體有利于提高效率。 3. 線性載體的制備4. 同源重組反響試劑加量10 x Buffer1ulRecombination Enzyme1ul線性化載體（50ng/ul） 50-100ng插入片段（50ng/ul）150-200ngdd H2O補足

11、至10ul1配置反響體系 將目的DNA片段和線性化載體以一定的摩爾比加到管子中進展重組反響摩爾比可計算方法見附錄，10 ul體系(見下表) 留意：1.目的片段與載體的摩爾比在2:1-5:1之間，摩爾比低于2:1效率會降低；2.反響時間在15-30分鐘，時間太短不利于重組反響2短暫離心混勻，37孵育15分鐘。3反響終了后，取5-10ul反響液立刻進展轉化，剩余反響液可在4或-20保管待用。 5.重組產物轉化至感受態(tài)細胞冰上融化一管100 l的DH5感受態(tài)細胞。參與5-10l反響液到感受態(tài)細胞中，悄然混勻，冰上孵育30分鐘。42水浴中熱激45-90秒后，冰浴3分鐘。留意：所運用的感受態(tài)細胞效率11

12、08cfu/g.參與890l SOC液體培育基，37復蘇45-60分鐘。6. 重組子挑選 復蘇培育物8000rpm離心1分鐘搜集菌體，根據(jù)需求將一定量的菌體均勻的涂布在含抗生素平板上,37倒置培育12-16h后察看菌落生長情況。 運用抗生素的最低抑菌濃度，有利于獲得更多的重組子：在10g/mL的卡那霉素平板上重組子的數(shù)目是60g/mL的卡那霉素平板上重組子的數(shù)目的6倍。 抗生素運用濃度與Red/ET重組效率的關系 常用抗生素的任務濃度7. 重組子的檢測 檢測方法：酶切分析、PCR檢測、平板雙劃線、測序等； 普通采用菌落PCR進展陽性克隆鑒定。為防止假陽性結果，鑒定引物選擇一條為載體特異性引物，

13、另一條引物為目的片段特異性引物。 高拷貝質粒修飾存在“質粒多聚體 景象； “質粒多聚體問題處理方法： 采用“線性DNA+線性DNA重組方式； 利用RecE/RecT重組酶系統(tǒng)； 減低質?？截悢?shù)?？敲顾乜剐曰騅an交換pUC19中的氨芐抗性基因Amp“質粒多聚體 景象處理方法： 采用“線性DNA+線性DNA重組方式； 利用RecE/RecT重組酶系統(tǒng)； 減低質?？截悢?shù)。六、 Red/ET重組技術的主要運用1. 重組質粒的構建 2. 染色體的修飾 3. 亞克隆Subcloning 4. 直接克隆Direct cloning1. 重組質粒的構建 (1) 傳統(tǒng)基因克隆技術的缺陷 傳統(tǒng)克隆技術依賴限

14、制性酶切位點和內切 酶的消化，當短少適宜的酶切位點或者某個酶切位點在目的片段中大量存在時，利用內切酶消化難以得到相應的產物。 方法看似簡單，但實驗周期長。 大片段難以與載體正確銜接。 無法同時銜接多個2個以上的DNA片段。限制性內切酶銜接酶步驟1：酶切目的片段步驟2：酶切載體步驟3:目的片段與載體銜接同源重組克隆步驟傳統(tǒng)克隆步驟步驟4:重組子轉化到感受態(tài)細胞同源重組克隆傳統(tǒng)克隆克隆片段長度50bp-10kb50bp-2kb一次克隆片段數(shù)1-5個1個感受態(tài)效率要求1108cfu/ug以上1107cfu/ug以上所用的酶重組酶T4連接酶片段的插入位點任何位點特定位點片段酶切不需要需要載體線性化方法

15、酶切或PCR酶切同源重組克隆與傳統(tǒng)克隆比較插入選擇標志插入無選擇標志的DNA片段2. 染色體的修飾 E. coli染色體上插入抗性基因 傳統(tǒng)基因工程技術A和Red/ET重組技術B修飾E.coli染色體實驗步驟比較B 不同復制子能承載外源 DNA片段的大小3. 亞克隆Subcloning 4. 直接克隆Direct cloningA亞克隆和直接克隆表示圖Red/ET subcloning亞克隆 pGB-15A載體抗性基因簇直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇3 mg基因組DNA用EcoR V消化Mx unknown PKS gene cluster (36kb)p15A oriCmPKS from other bacteria：Photorhabdus lumineciensPsedumonas flurescencse異源表達七、