中藥活性指標(biāo)成分阿克苷制備及鑒定

1、附件1中藥活性指標(biāo)成分阿克昔(Acteosid)的制備與鑒定何江1,胡小鵬2,邱榕珠3,馬文杰3,李濤2深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院深圳大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院摘要：本實(shí)驗(yàn)以苦丁茶木犀科植物紫莖女貞(Ligustrum purpurasce*葉為原料， 通過高效快速的分離純化方法，制備得到目標(biāo)化合物。目標(biāo)化合物經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為 阿克昔(acteoside)。關(guān)鍵詞：阿克昔紫莖女貞制備鑒定概述阿克昔(Acteoside)，又名洋丁香酚首(中華本草)、洋丁香首(中藥辭海)、 毛蕊花首、馬鞭草首、麥角甾首等。1963年羅馬大學(xué)，M. L. Scarpati首先報(bào) 道從植物Verbascum sinuat

2、um 中分離到阿克苷(acteoside)1。根據(jù)現(xiàn)有的 文獻(xiàn)查詢分析，阿克昔廣泛分布于雙子葉植物中，含阿克昔的植物包括：唇阿克昔(acteoside)分子結(jié)構(gòu) 形科(Labiatae) 15 屬 41 種，紫薇科(Bignoniaceae) 4 屬 5 種，木犀科(Oleaceae) 7 屬 12 種，列當(dāng)科(Orobanchaceae) 5 屬 10 種，玄參科(Scrophulariaceae) 21 屬34種，馬錢科(Loganiaceae) 2屬7種，馬鞭草科(Verbenaceae) 12屬31 種，車前科(Plantaginaceae) 2屬7種，爵床科(Acanthaceae)

3、 2屬3種，木蘭 科(Magnoliaceae)1 屬 2 種，苦檻藍(lán)科(Myoporaceae)1 屬 1 種，蓼科(Polygonaceae) 1屬1屬，菊科(Compositae) 1屬1種，胡麻科(Pedaliaceae) 1屬1種，桔梗 科(Campanulaceae) 1屬1種，胡椒科(Piperaceae) 1屬1種，苦苣苔科 (Gesneriaceae) 1屬1種，薔薇科(Rosaceae) 1屬1種，共計(jì)79屬160種植物。現(xiàn)代藥理研究表明阿克苷具有多種生理活性：抗氧化，抗病毒，保肝，抗腫瘤轉(zhuǎn)移，抗炎，降血脂，抗菌，神經(jīng)保護(hù)，降血壓和心血管保護(hù)等幻。由于阿克苷 具有多種生理活

4、性，且分布廣泛，資源豐富，因此對(duì)其藥用價(jià)值的研究已成為天 然藥物研發(fā)的新熱點(diǎn)。阿克苷屬新一類天然活性結(jié)構(gòu)分子，隨著藥理研究的不斷 深入，必將為其帶來廣泛的臨床應(yīng)用前景。阿克苷為苯丙素苷類成分，可溶于醇類有機(jī)溶劑，溶于水，極性大，阿克苷 分子結(jié)構(gòu)對(duì)熱和光不穩(wěn)定，分離純化難度大。探索高效快速制備和鑒定的方法， 有益于阿克苷的藥物研究和開發(fā)。實(shí)驗(yàn)部分一、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑比旋度J-20C旋光光譜儀測定，紫外光譜用UV-210A型紫外光譜儀測定， 紅外光譜用IR-450型紅外光譜儀測定，核磁共振譜用WH-400型核磁共振儀 測定，F(xiàn)AB-MS用JAB-HS測定。層析柱材料用硅膠，D101大孔吸附樹脂，Se

5、phadex LH-20。薄層層析用高效 硅膠仔板(HPTLC, silica gel, Merck),展開劑為 CHCl3-MeOH-H2O (7:3:。 有機(jī)溶劑用甲醇，乙醇和氯仿等。二、提取及分離稱量g干燥的苦丁茶紫莖女貞(Ligustrum purpurascens)葉，剪碎，放入 10 L加熱回流提取磨口器皿中，加入5 L MeOH，加熱回流2小時(shí)后，靜置放涼，然后過濾，得提取液H1；隨后，再重復(fù)操作一次，得提取液H2 (提取流程見圖1）。合并兩次提取液H1和H2,并減壓濃縮，得甲醇提取物g。在甲醇提取物g中加入4L純凈水，充分?jǐn)嚢杌靹?，然后靜置一小時(shí)，濾出上清液，如此反復(fù)操 作三次

6、，將所得的上清液合并，并直接上D101樹脂（1500 g）層析柱分離。D101 樹脂層析柱分別用純凈水、50%甲醇和甲醇洗脫，得到三組餾分：A g），B g） 和C g）。所得A、B、C三部分，經(jīng)TLC檢測硅膠G，展開系統(tǒng) CHCl3MeOHH2O （7:3:,B 部分含有阿克苷。B部分（g）經(jīng)硅膠層析，干柱切割法，得到三部分:E g）、F和G（ g）。 將含有阿克苷的F部分進(jìn)行硅膠柱層析，以CHCl3MeOHH2O溶劑系統(tǒng)洗脫 得到7組餾分（如圖1所示）。其中F3部分（g）再進(jìn)行一次硅膠柱層析分離， 得到粗品M g。粗品M再經(jīng)Sephadex LH-20柱層析純化得到M g。g口1口1十：5

7、 功苦茶葉263.4 gLH-20. EtOI-l硅.膠.島斤:切割志482.3 QI SephadexCHCL-MeOH-H.O, 7 3:0 5三、純度檢測經(jīng)色譜層析純化得到的M g),其純度進(jìn)行高效液相(HPLC)檢測。檢測條 件為：儀器：安捷倫1200(Agilent 1200)高效液相儀檢測波長：227 nm分析柱：C-18 column (Hypersil ODS, 250 x MM)柱溫：4C流速：1 ml/min樣品濃度：1 mg/ml進(jìn)樣量：5 pl洗脫條件：起始洗脫比例為 H2Oacetonitrile (80:20,v/v);時(shí)間程序?yàn)?25 min，洗脫比例由 0100

8、% acetonitrile 人 _ . “ 一 一 !一. 1020叫麟圖2 M的高效液相純度檢測通過高效液相色譜檢測，從苦丁茶紫莖女貞葉中分離純化得到的M其純度 為。四、結(jié)構(gòu)鑒定1.顯色反應(yīng)31) FeCl3顯色：將少許M試樣溶于10 ml適量的甲醇中，用毛細(xì)管取樣，并在 硅膠TLC板上點(diǎn)樣，用風(fēng)筒將斑點(diǎn)吹干，然后用10% FeCl3水溶液在TLC上噴霧，此時(shí)觀察到斑點(diǎn)呈墨蘭色。2)KOH水溶液顯色：取少許M試樣放入一小試管中，用甲醇溶解，然后滴加 10% KOH水溶液二至三滴，溶液呈深黃色。比旋度測定：aD24 (c , MeOH)紫外光譜 入max (EtOH) nm，(log s)(

9、如圖3所示)在210240 nm區(qū)間，出現(xiàn)225和248 ()吸收，表明化合物M結(jié)構(gòu)中含 有a、0不飽和酰基和苯環(huán)官能團(tuán)。288 ()為苯環(huán)的弱吸收甙，而335 ()吸收 為結(jié)構(gòu)中的兀兀*電子躍遷的吸收帶峰。4.紅外光譜IR vmaxKBr, cm1 (如圖4所示)3450吸收寬峰表明M分子中存在多一OH基團(tuán)，1690與1660為共軛a、0 不飽和酰基的特征吸收峰，1510和1440為雙鍵和苯環(huán)骨架振動(dòng)吸收。1DD.D圖4化合物M的紅外吸收光譜5. 1HNMR核磁共振譜如圖5所示，化合物M的1HNMR譜圖在一ppm低磁場共振范圍內(nèi)出現(xiàn) 6個(gè)苯環(huán)質(zhì)子信號(hào)，屬于兩個(gè)ABX自旋系統(tǒng)。8和的兩組二重峰

10、，J = Hz，為 咖啡酰基的反式雙鍵質(zhì)子信號(hào)；而8(2H, J = Hz)、(1H, t, J = Hz)和(1H, m) 分別為苯乙醇基質(zhì)子信號(hào)。在1HNMR譜中可觀察到P-D-葡萄毗南糖基和a-L- 鼠李毗喃糖基的端基質(zhì)子信號(hào)?；衔颩的1HNMR化學(xué)位移信號(hào)歸屬如下：Aglycone (3,4-dihydroxyphenylethyl): (1H, d, J = Hz, H-2), (1H, d, J = Hz, H-5), (1H, dd, J = , Hz, H-6), (2H, t, J = Hz, H2-7), (1H, t, J = Hz, H-a), (1H, m, H-8

11、b)Glucosyl: (1H, d, J = Hz, H-1), (m, 2，,3 and 5，)， (1H, t, J = Hz, H4), (1H, dd, J = 12, Hz, H-6),(1H, dd, J = 12, Hz, H-6)Rhamnosyl: (1H, d, J = Hz, H-1”), (m, 2 and 3”), (1H, t, J = Hz,H-4”), (m, H-5), (3H, d, J = Hz, H3-6)Caffeoyl: (1H, d, J = Hz, H2)，(1H, dd, J = Hz, H-5), (1H, dd, J =,Hz, H-6”

12、，)，(1H, d, J = Hz, H7)，(1H, dd, J = , Hz, H-8) 圖5化合物M的1H NMR圖譜6.61 (lH1dd1J=0 12OHE1H-6)S.24C1H. dd.J=H 1.2 D Hz. H-8,r：i6. 13C-NMR 核磁共振譜化合物M的13C NMR圖譜(見圖6)顯示29個(gè)碳信號(hào)，與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)比較4，其碳 化學(xué)位移信號(hào)得到歸屬：Aglycone (3,4-dihydroxyphenylethyl): (C-1), (C-2), (C-3), (C-4), (C-5),121 (C-6), (C-7), (C-8)Glucosyl:(gluC-1

13、)，(gluC-2)，(gluC-3)，(gluC-4)，(gluC-5)，(gluC-6)，Rhamnosyl: (rhaC-1), (rhaC-2), (rhaC-3), (rhaC-4), (rhaC-5),(rhaC-6”)Caffeoyl: (C-1), (C-2), (C-3), (C-4), (C-5), (C-6), (C-7),(C-8 r)C-4 cWgluC-472 2. rh就一f72.D. rhaC-2qluC-E-1E2.2I1u1Ir1jIIr招 e5H圖6化合物M的13C NMR圖譜FAB-MS 譜圖化合物M的FAB-MS圖譜顯示，亞分子離子峰M+H+為625,

14、分子式可推定為C29H3615。圖7化合物 M的FAB-MS圖譜結(jié)果以苦丁茶紫莖女貞為原料，經(jīng)提取純化，得到化合物g,經(jīng)HPLC測定，其純度為。通過以上物理化學(xué)性質(zhì)和波譜學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)推定，化合物M的分子結(jié)構(gòu)應(yīng)為： 2( 3, 4二羥基苯)乙基一30aL-鼠李毗喃糖基40一反式咖啡酰 基0pD葡萄毗喃糖苷，即該化合物M與已知成分阿克苷(acteoside)一致5。討論按照課題立項(xiàng)的要求，現(xiàn)已如期完成。從苦丁茶紫莖女貞葉中分離得到目標(biāo)化合物 阿克苷g，純度為，所分離純化得到的阿克苷結(jié)構(gòu)經(jīng)波譜學(xué)和化學(xué)方法得到鑒定。阿克苷為天然多酚類成分，極性大，分子結(jié)構(gòu)對(duì)熱和光敏感，不穩(wěn)定，分離純化難 度大。針

15、對(duì)阿克苷分子極性大，不穩(wěn)定，分離難度大的具體問題，我們應(yīng)用新方法，大 大提高了阿克苷的分離純化速度和效率。所采用的新方法有：1）在本實(shí)驗(yàn)中采用浸膏水 萃取法，克服以往混懸水相親脂溶劑梯度萃取法時(shí)間長、易乳化、成分交叉等問題；2） 將浸膏水萃取的上清液，直接加樣進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析分離，省去了萃取相水液的 濃縮步驟，本方法不僅節(jié)省了人力物力，更避免了阿克苷分子在濃縮過程中的分解，此 屬本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)創(chuàng)立的新方法；3）在硅膠層析分離時(shí)，采用干柱切割法，將原本需要進(jìn) 行2個(gè)多月層析的實(shí)驗(yàn)，縮短為一周時(shí)間，大大提高了柱層析分離的效率。通過本次實(shí) 驗(yàn)，建立了阿克苷的高效快速分離法，為阿克苷資源開發(fā)以及產(chǎn)業(yè)化奠定了良好的提取 純化工藝。參考文獻(xiàn)Scarpati M L, Delle Monache FIsolation from Verbascum sinuatum of two new glucosides, verbascoside and isoverbascoside.Annali di Chimica (Rome, Italy) 1963; 53: 356 67He J, Hu X P, Zeng Y Li Y, Qiu R