蛋白質(zhì)的復(fù)性

1、-+EOF毛細(xì)管電泳(din yn) 電泳+電滲流0tm (min)共三十六頁8共三十六頁-+EOF毛細(xì)管膠束電動(din dn)色譜共三十六頁蛋白質(zhì)的復(fù)性(f xn)共三十六頁共三十六頁包含(bohn)體什么是包含體？ 包含體是指外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)(biod)時(shí)，表達(dá)(biod)的蛋白質(zhì)不僅不能分泌到細(xì)胞外，反而在細(xì)胞內(nèi)聚集成沒有生物活性的直徑約0.1-3.0m的固體顆粒。這些基因表達(dá)產(chǎn)物的一級結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)雖然正確，但其立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的。共三十六頁共三十六頁 包含體的形成 包含體的形成比較復(fù)雜，有些機(jī)理還不清楚； 一般認(rèn)為包含體的形成是蛋白質(zhì)過量表達(dá)的結(jié)果。包含體的形成是部分折

2、疊的中間態(tài)之間疏水性相互作用的結(jié)果，主要原因是蛋白質(zhì)本身具有易于聚集沉淀的性質(zhì)，或表達(dá)產(chǎn)物周圍的物理環(huán)境（如溫度、離子組成）不適或缺少某些折疊輔助因子（如分子伴侶(bnl)）的作用。其形成是不可預(yù)測的。共三十六頁包含體的性質(zhì)高密度的蛋白質(zhì)聚集體主要為基因表達(dá)產(chǎn)物包含體內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物具有(jyu)部分二級結(jié)構(gòu)包含體對蛋白酶解不敏感以包含體形式表達(dá)重組蛋白質(zhì)具有優(yōu)勢：書386頁共三十六頁蛋白質(zhì)復(fù)性(f xn)1.包含(bohn)體的純化2.包含體的溶解3.包含體的復(fù)性共三十六頁 包含體的純化 - 采用密度梯度離心技術(shù)則可得到純度較高的包含體。如果得到的包含體含有較多的雜質(zhì)，可用螯合劑、低濃度變性劑或

3、表面活性劑（TritonX-100）的溶液(rngy)進(jìn)行洗滌，使污染的膜蛋白等雜質(zhì)溶解，得到含雜質(zhì)較少的包含體。共三十六頁 包含體的溶解 利用高濃度的強(qiáng)變性劑溶解包含體，如6-8mol/L鹽酸胍或8mol/L尿素，也可利用硫氰酸鹽或表面活性劑。對于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑解離錯(cuò)配的二硫鍵螯合劑清除(qngch)重金屬離子共三十六頁共三十六頁蛋白質(zhì)復(fù)性(f xn)稀釋復(fù)性分子伴侶(bnl)輔助復(fù)性反膠束復(fù)性固相輔助復(fù)性共三十六頁稀釋(xsh)復(fù)性：直接稀釋復(fù)性透析復(fù)性流加復(fù)性 共三十六頁共三十六頁蛋白質(zhì)復(fù)性(f xn)的影響因素 濃度 增加蛋白質(zhì)的濃度有利于聚集的進(jìn)行 溫度 蛋白質(zhì)的

4、復(fù)性一般在室溫下進(jìn)行，溫度過高（40） 蛋白質(zhì)的聚集將十分嚴(yán)重 pH值 通常復(fù)性在弱堿性條件下（pH8）進(jìn)行，但要注意避免 與蛋白的pI值相近 折疊促進(jìn)劑 （輔助因子） L-Arg, PEG, 去污劑, 尿素(nio s)和鹽酸胍共三十六頁共三十六頁包含體產(chǎn)物(chnw)分離工藝（牛生長激素分離提取）共三十六頁共三十六頁共三十六頁共三十六頁共三十六頁共三十六頁分子伴侶輔助(fzh)復(fù)性共三十六頁分子(fnz)伴侶1978年Laskey等發(fā)現(xiàn)；1987年Ellis提出普遍意義分子伴侶；1993年Ellis對分子伴侶做了更為確切的定義：即分子伴侶是一類相互之間有關(guān)系的蛋白，它們的功能是幫助(bng

5、zh)其他含多肽結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在體內(nèi)進(jìn)行正確的非共價(jià)的組裝，并且不是組裝完成的結(jié)構(gòu)在發(fā)揮其正常的生物功能時(shí)的組成部分。共三十六頁共三十六頁分子伴侶在蛋白質(zhì)正確折疊中的關(guān)鍵作用阻礙集聚折疊互補(bǔ)功能促進(jìn)錯(cuò)誤(cuw)折疊降解共三十六頁共三十六頁反膠團(tuán)中的蛋白質(zhì)復(fù)性(f xn)利用反膠團(tuán)溶解(rngji)變性蛋白質(zhì)，可將變性蛋白質(zhì)分子彼此分隔開來，阻止分子間的相互作用，提高復(fù)性收率。存在問題：變性劑抑制蛋白質(zhì)在反膠團(tuán)相的溶解，故萃取率很低。共三十六頁共三十六頁共三十六頁共三十六頁展 望研究蛋白質(zhì)變性復(fù)性機(jī)理，開發(fā)新的變性復(fù)性原理和技術(shù)，解決目前的技術(shù)關(guān)鍵。 完善現(xiàn)有技術(shù)，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)用化和規(guī)模化。

6、根據(jù)(gnj)現(xiàn)有技術(shù)原理，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。開發(fā)實(shí)用的設(shè)備共三十六頁預(yù)防(yfng)包含體形成的方法1. 形成分子伴侶2. 通過改變、優(yōu)化培養(yǎng)條件增加表達(dá)產(chǎn)物的可溶性. 為了使外源蛋白在E.coli細(xì)胞中可溶性，人們在培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面進(jìn)行(jnxng)了多方面的探索。 3通過基因突變技術(shù)，在蛋白分子中產(chǎn)生氨基酸取代，來增加重組蛋白的可溶性。共三十六頁內(nèi)容摘要-。這些基因表達(dá)產(chǎn)物的一級結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)雖然正確，但其立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的。一般認(rèn)為包含體的形成是蛋白質(zhì)過量表達(dá)的結(jié)果。對于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑解離錯(cuò)配的二硫鍵。增加蛋白質(zhì)的濃度有利于聚集的進(jìn)行。L-Arg, PEG, 去污劑, 尿素和鹽酸胍。完善現(xiàn)有技術(shù)，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)用化和規(guī)?；?. 形成分子伴侶。2. 通過改變、優(yōu)化培養(yǎng)條件增加表達(dá)產(chǎn)物