蛋白質(zhì)的復(fù)性

1、-+EOF毛細(xì)管電泳(din yn) 電泳+電滲流0tm (min)共三十六頁(yè)8共三十六頁(yè)-+EOF毛細(xì)管膠束電動(dòng)(din dn)色譜共三十六頁(yè)蛋白質(zhì)的復(fù)性(f xn)共三十六頁(yè)共三十六頁(yè)包含(bohn)體什么是包含體？ 包含體是指外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)(biod)時(shí)，表達(dá)(biod)的蛋白質(zhì)不僅不能分泌到細(xì)胞外，反而在細(xì)胞內(nèi)聚集成沒(méi)有生物活性的直徑約0.1-3.0m的固體顆粒。這些基因表達(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)雖然正確，但其立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的。共三十六頁(yè)共三十六頁(yè) 包含體的形成 包含體的形成比較復(fù)雜，有些機(jī)理還不清楚； 一般認(rèn)為包含體的形成是蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)的結(jié)果。包含體的形成是部分折

2、疊的中間態(tài)之間疏水性相互作用的結(jié)果，主要原因是蛋白質(zhì)本身具有易于聚集沉淀的性質(zhì)，或表達(dá)產(chǎn)物周?chē)奈锢憝h(huán)境（如溫度、離子組成）不適或缺少某些折疊輔助因子（如分子伴侶(bnl)）的作用。其形成是不可預(yù)測(cè)的。共三十六頁(yè)包含體的性質(zhì)高密度的蛋白質(zhì)聚集體主要為基因表達(dá)產(chǎn)物包含體內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物具有(jyu)部分二級(jí)結(jié)構(gòu)包含體對(duì)蛋白酶解不敏感以包含體形式表達(dá)重組蛋白質(zhì)具有優(yōu)勢(shì)：書(shū)386頁(yè)共三十六頁(yè)蛋白質(zhì)復(fù)性(f xn)1.包含(bohn)體的純化2.包含體的溶解3.包含體的復(fù)性共三十六頁(yè) 包含體的純化 - 采用密度梯度離心技術(shù)則可得到純度較高的包含體。如果得到的包含體含有較多的雜質(zhì)，可用螯合劑、低濃度變性劑或

3、表面活性劑（TritonX-100）的溶液(rngy)進(jìn)行洗滌，使污染的膜蛋白等雜質(zhì)溶解，得到含雜質(zhì)較少的包含體。共三十六頁(yè) 包含體的溶解 利用高濃度的強(qiáng)變性劑溶解包含體，如6-8mol/L鹽酸胍或8mol/L尿素，也可利用硫氰酸鹽或表面活性劑。對(duì)于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑解離錯(cuò)配的二硫鍵螯合劑清除(qngch)重金屬離子共三十六頁(yè)共三十六頁(yè)蛋白質(zhì)復(fù)性(f xn)稀釋復(fù)性分子伴侶(bnl)輔助復(fù)性反膠束復(fù)性固相輔助復(fù)性共三十六頁(yè)稀釋(xsh)復(fù)性：直接稀釋復(fù)性透析復(fù)性流加復(fù)性 共三十六頁(yè)共三十六頁(yè)蛋白質(zhì)復(fù)性(f xn)的影響因素 濃度 增加蛋白質(zhì)的濃度有利于聚集的進(jìn)行 溫度 蛋白質(zhì)的

4、復(fù)性一般在室溫下進(jìn)行，溫度過(guò)高（40） 蛋白質(zhì)的聚集將十分嚴(yán)重 pH值 通常復(fù)性在弱堿性條件下（pH8）進(jìn)行，但要注意避免 與蛋白的pI值相近 折疊促進(jìn)劑 （輔助因子） L-Arg, PEG, 去污劑, 尿素(nio s)和鹽酸胍共三十六頁(yè)共三十六頁(yè)包含體產(chǎn)物(chnw)分離工藝（牛生長(zhǎng)激素分離提?。┕踩?yè)共三十六頁(yè)共三十六頁(yè)共三十六頁(yè)共三十六頁(yè)共三十六頁(yè)分子伴侶輔助(fzh)復(fù)性共三十六頁(yè)分子(fnz)伴侶1978年Laskey等發(fā)現(xiàn)；1987年Ellis提出普遍意義分子伴侶；1993年Ellis對(duì)分子伴侶做了更為確切的定義：即分子伴侶是一類(lèi)相互之間有關(guān)系的蛋白，它們的功能是幫助(bng

5、zh)其他含多肽結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在體內(nèi)進(jìn)行正確的非共價(jià)的組裝，并且不是組裝完成的結(jié)構(gòu)在發(fā)揮其正常的生物功能時(shí)的組成部分。共三十六頁(yè)共三十六頁(yè)分子伴侶在蛋白質(zhì)正確折疊中的關(guān)鍵作用阻礙集聚折疊互補(bǔ)功能促進(jìn)錯(cuò)誤(cuw)折疊降解共三十六頁(yè)共三十六頁(yè)反膠團(tuán)中的蛋白質(zhì)復(fù)性(f xn)利用反膠團(tuán)溶解(rngji)變性蛋白質(zhì)，可將變性蛋白質(zhì)分子彼此分隔開(kāi)來(lái)，阻止分子間的相互作用，提高復(fù)性收率。存在問(wèn)題：變性劑抑制蛋白質(zhì)在反膠團(tuán)相的溶解，故萃取率很低。共三十六頁(yè)共三十六頁(yè)共三十六頁(yè)共三十六頁(yè)展 望研究蛋白質(zhì)變性復(fù)性機(jī)理，開(kāi)發(fā)新的變性復(fù)性原理和技術(shù)，解決目前的技術(shù)關(guān)鍵。 完善現(xiàn)有技術(shù)，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)用化和規(guī)?；?

6、根據(jù)(gnj)現(xiàn)有技術(shù)原理，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。開(kāi)發(fā)實(shí)用的設(shè)備共三十六頁(yè)預(yù)防(yfng)包含體形成的方法1. 形成分子伴侶2. 通過(guò)改變、優(yōu)化培養(yǎng)條件增加表達(dá)產(chǎn)物的可溶性. 為了使外源蛋白在E.coli細(xì)胞中可溶性，人們?cè)谂囵B(yǎng)條件的優(yōu)化方面進(jìn)行(jnxng)了多方面的探索。 3通過(guò)基因突變技術(shù)，在蛋白分子中產(chǎn)生氨基酸取代，來(lái)增加重組蛋白的可溶性。共三十六頁(yè)內(nèi)容摘要-。這些基因表達(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)雖然正確，但其立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的。一般認(rèn)為包含體的形成是蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)的結(jié)果。對(duì)于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑解離錯(cuò)配的二硫鍵。增加蛋白質(zhì)的濃度有利于聚集的進(jìn)行。L-Arg, PEG, 去污劑, 尿素和鹽酸胍。完善現(xiàn)有技術(shù)，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)用化和規(guī)?；?。1. 形成分子伴侶。2. 通過(guò)改變、優(yōu)化培養(yǎng)條件增加表達(dá)產(chǎn)物