第八講 酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用

1、主要(zhyo)講授內(nèi)容一、固定化酶(細(xì)胞)的制備二、固定化酶(細(xì)胞)的性質(zhì)和指標(biāo)(zhbio)三、固定化酶和固定化細(xì)胞的反應(yīng)器四、酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用共五十頁(yè)酶促反應(yīng)的專(zhuān)一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和。酶工程的優(yōu)點(diǎn)是工藝簡(jiǎn)單、效率高、生產(chǎn)成本低、環(huán)境污染小，而且產(chǎn)品收率(shu l)、純度高，還可制造出化學(xué)法無(wú)法生產(chǎn)的產(chǎn)品。以下重點(diǎn)介紹固定化酶技術(shù)在制藥工業(yè)中生產(chǎn)抗生素、核苷酸和氨基酸的應(yīng)用。共五十頁(yè)1. 固定化細(xì)胞(xbo)法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸 2. 固定化酶法生產(chǎn)5-復(fù)合單核苷酸 3. 固定化酶法生產(chǎn)L-氨基酸共五十頁(yè)1. 固定化細(xì)胞(xbo)法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸青霉素G (或V)經(jīng)青霉素

2、?；缸饔茫獬?cè)鏈后的產(chǎn)物(chnw)稱(chēng)為6-氨基青霉烷酸(6-APA)，也稱(chēng)無(wú)側(cè)鏈青霉素。共五十頁(yè)6-APA是生產(chǎn)半合成(hchng)青霉素的最基本原料，到目前為止，以6-APA為原料已合成近3萬(wàn)種衍生物，并已篩選出數(shù)十種耐酸、耐酶、低毒及具有廣譜抗菌作用的半合成青霉素。 共五十頁(yè)1技術(shù)(jsh)路線固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基(nj)青霉烷酸的技術(shù)路線 共五十頁(yè)2工藝(gngy)過(guò)程(1) 大腸桿菌培養(yǎng)(piyng) (2) Ecoli 固定化 (3) 固定化Ecoli反應(yīng)堆制備 (4) 轉(zhuǎn)化反應(yīng) (5) 6-APA的提取 共五十頁(yè)青霉素?；皋D(zhuǎn)化(zhunhu)流程圖1. 酶反應(yīng)器；2

3、pH凋節(jié)罐；3熱水(r shu)罐；4堿液罐；5. 熱水循環(huán)泵；6裂解液循環(huán)泵； 7流量計(jì)；8. 自動(dòng)pH計(jì)；9自動(dòng)記錄溫度計(jì)；10酶反應(yīng)器溫度計(jì)共五十頁(yè)大腸桿菌(d chn n jn)培養(yǎng) 斜面培養(yǎng)基：普通肉汁瓊脂培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白(dnbi)胨2，NaCl 0.5，苯乙酸0.2，自來(lái)水配制。用2mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 7.0，在55.16 kPa壓力下滅菌30 min后備用。 共五十頁(yè)將斜面接種后培養(yǎng)1830 h的EColi D816 (產(chǎn)青霉素?；?，用15 mL無(wú)菌水制成菌細(xì)胞懸液；取1 mL懸浮液接種至裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角燒瓶（250 mL）中，在搖床上28

4、，170 r/min振蕩培養(yǎng)15 h，如此(rc)依次擴(kuò)大培養(yǎng)，直至1 0002 000 L。共五十頁(yè)規(guī)模通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后用高速管式離心機(jī)離心收集(shuj)菌體，備用。共五十頁(yè)Ecoli 固定化 取E. coli 濕菌體100 kg，置于40反應(yīng)罐中，在攪拌下加入50 L 10明膠溶液，攪拌均勻后加入25戊二醛5L，再轉(zhuǎn)移至搪瓷盤(pán)中，使之成為35cm厚的液層，室溫放置2 h，再轉(zhuǎn)移至4冷庫(kù)(lngk)過(guò)夜；共五十頁(yè)待形成固體凝膠塊后，通過(guò)粉碎和過(guò)篩，使其成為直徑為2 mm左右的顆粒狀固定化Ecoli細(xì)胞(xbo)，用蒸餾水及pH7.5、0.3 mol/L磷酸緩沖液先后充分洗滌，抽干，

5、備用。共五十頁(yè)固定化EColi 反應(yīng)堆制備(zhbi) 生物反應(yīng)堆：將酶或細(xì)胞(xbo)進(jìn)行固定化處理，再將固定化酶或細(xì)胞(xbo)裝填于適當(dāng)反應(yīng)器中制成的填充式反應(yīng)器。共五十頁(yè)將上述充分洗滌后的固定化EColi 細(xì)胞(產(chǎn)青霉素?；?裝填于帶保溫(bown)夾套的填充床式反應(yīng)器中，即成為固定化Ecoli 反應(yīng)堆（反應(yīng)器規(guī)格為70 cm160 cm）。共五十頁(yè)轉(zhuǎn)化(zhunhu)反應(yīng) 取20 kg青霉素G(或V)鉀鹽，加入到1 000 L配料(pi lio)罐中，用0.03 mol/L、pH7.5的磷酸緩沖液溶解并使青霉素鉀鹽濃度為3，用2mol/ L NaOH溶液調(diào)pH至7.57.8； 共五

6、十頁(yè)然后，將反應(yīng)器及pH調(diào)節(jié)罐中反應(yīng)液溫度升到40，維持反應(yīng)體系的pH在7.57.8范圍內(nèi)，以70 L/min流速使青霉素鉀鹽溶液通過(guò)固定化 EColi 反應(yīng)堆進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)化(zhunhu)，直至轉(zhuǎn)化(zhunhu)液pH不變?yōu)橹?。循環(huán)時(shí)間一般為34 h。反應(yīng)結(jié)束后，放出轉(zhuǎn)化液。共五十頁(yè)6-APA的提取(tq) 上述轉(zhuǎn)化液經(jīng)過(guò)濾澄清后，濾液用薄膜濃縮器減壓(jin y)濃縮至100L左右；冷卻至室溫后，于250 L攪拌罐中加50 L 醋酸丁酯充分?jǐn)嚢杼崛?015 min（萃?。?共五十頁(yè)取下層水相，加1 g/mL活性炭于70攪拌脫色30 min，濾除活性炭；濾液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH至4.

7、0左右(zuyu)，5放置結(jié)晶過(guò)夜；次日濾取結(jié)晶，用少量冷水洗滌，抽干，115烘23h，得成品6-APA。按青霉素G計(jì)，收率一般為7080。 共五十頁(yè)2. 固定化酶法生產(chǎn)(shngchn)5-復(fù)合單核苷酸4種5-復(fù)合單核苷酸注射液可用于治療白血球下降、血小板減少及肝功能失調(diào)等疾病(jbng)。核糖核酸(RNA)經(jīng)5-磷酸二酯酶作用可分解為腺苷、胞苷、尿苷及鳥(niǎo)苷的一磷酸化合物，即AMP、CMP、UMP，及GMP。 共五十頁(yè)5-磷酸二酯酶存在于桔青霉細(xì)胞、谷氨酸發(fā)酵菌細(xì)胞及麥芽根等生物(shngw)材料中。實(shí)驗(yàn)以麥芽根為材料制取5-磷酸二酯酶，并使其固定化后用于水解酵母RNA，以生產(chǎn)5-復(fù)合單核苷

8、酸注射液。共五十頁(yè)RNA由核糖核苷酸經(jīng)磷酯鍵縮合而成長(zhǎng)鏈狀分子核苷酸之間的連結(jié)(lin ji)方式：3,5-磷酸二酯鍵生產(chǎn)(shngchn)5-復(fù)合單核苷酸共五十頁(yè)1技術(shù)(jsh)路線固定化酶法生產(chǎn)(shngchn)5-復(fù)合單核苷酸的技術(shù)路線 共五十頁(yè)2工藝(gngy)過(guò)程(1) 5-磷酸二酯酶的制備 (2) 固定化5-磷酸二酯酶的制備 (3) 轉(zhuǎn)化反應(yīng) (4) 5-復(fù)合單核苷酸的分離純化(chn hu) (5) 精制及灌封 共五十頁(yè)5-磷酸二酯酶的制備(zhbi) 取干麥芽根，加910倍體積(W/V)的水，用2 mol/L HCl調(diào)pH至5.2，于30條件(tiojin)下浸泡1520h，然

9、后加壓去渣，浸出液過(guò)濾，濾液冷卻至5，加入2.5倍體積(V/V)的95冷工業(yè)乙醇(5)，于5靜置23h后，吸去上層清液，回收乙醇，下層離心收集沉淀，用少量丙酮及乙醚先后洗滌23次，真空干燥，粉碎得5-磷酸二酯酶。共五十頁(yè)固定化5-磷酸二酯酶的制備(zhbi) 取上述磷酸二酯酶0.2 kg(控制(kngzh)固定化后的固定化酶比活力在100 U/g以上為宜)，用1.5的(NH4)2SO4溶液溶解，過(guò)濾得酶液。另取濕ABXE纖維素樹(shù)脂40 kg，加入05的蒸餾水至80 L，攪拌下先后加入1mol/L HCl和5NaNO2溶液各10 L，攪拌均勻，于05下反應(yīng)150 min后，抽濾；共五十頁(yè)濾餅迅速

10、用預(yù)冷的0.05mol/L HCl和蒸餾水各洗3次，抽干后將濾餅投入上述5-磷酸二酯酶溶液中，攪拌(jiobn)均勻后用1mol/L Na2CO3溶液調(diào)pH8.0，攪拌反應(yīng)30min，用冷水洗34次，抽干，得固定化5-磷酸二酯酶。共五十頁(yè)轉(zhuǎn)化(zhunhu)反應(yīng) 取2kg RNA，緩慢加入預(yù)熱至6070的360 L pH5.0的10-3mol/L ZnCl2溶液中，用1mol/L NaOH溶液調(diào)至pH5.05.5，濾除沉淀，將清液升溫至70，加入上述濕的固定化5-磷酸二酯酶40 kg(要求酶的比活在100U/g以上)，于67維持(wich)pH5.05.5，攪拌反應(yīng)12 h。共五十頁(yè)根據(jù)增色效

11、應(yīng)，用紫外吸收法判斷轉(zhuǎn)化平衡點(diǎn)。轉(zhuǎn)化完成(wn chng)后，濾出轉(zhuǎn)化液，用于分離5-單核苷酸。固定化酶再繼續(xù)用于下一批轉(zhuǎn)化反應(yīng)。共五十頁(yè)5-復(fù)合單核苷酸的分離(fnl)純化 將上述轉(zhuǎn)化液用6mol/LHCl溶液(rngy)調(diào)pH至3.0，濾除沉淀，濾液用6mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.0，進(jìn)入已處理好的Cl-型陰離子交換樹(shù)脂柱(30cm100cm)，流速為22.5 L/min，吸附后，用250300L去離子水洗滌柱床; 共五十頁(yè)然后用3 NaCl溶液以l1.2L/min流速洗脫，當(dāng)流出液pH達(dá)到7.0時(shí)開(kāi)始分部(fn b)收集，直至洗脫液中不含核苷酸為止，合并含核苷酸鈉的洗脫液進(jìn)行精制。

12、共五十頁(yè) 精制(jngzh)及灌封 上述核苷酸鈉溶液用薄膜濃縮器減壓(jin y)濃縮后，測(cè)定核苷酸含量，再用無(wú)熱原質(zhì)水稀釋至20 mg/mL，加入0.51.0(g/mL)藥用活性炭，煮沸10min脫色和除熱原，濾除活性炭，濾液經(jīng)6號(hào)除菌漏斗或0.45 m孔徑的微孔濾膜過(guò)濾除菌后灌封，即為5-復(fù)合單核苷酸注射液。共五十頁(yè)熱原質(zhì)(yun zh)熱原質(zhì)是在生產(chǎn)過(guò)程中由于被污染后由雜菌所產(chǎn)生的一種內(nèi)毒素。各種雜菌所產(chǎn)生的熱原反應(yīng)(fnyng)有所不同。革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的熱原反應(yīng)(fnyng)一般比革蘭氏陽(yáng)性菌的為強(qiáng)。 共五十頁(yè)熱原注入體內(nèi)引起(ynq)惡寒高熱，嚴(yán)重的引起(ynq)休克。它是多糖磷類(lèi)

13、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的結(jié)合體，為大分子有機(jī)物質(zhì)，能溶于水。在280加熱4h它能被破壞90%；共五十頁(yè)180200加熱(ji r)半小時(shí)或150加熱2h能被徹底破壞。它亦能被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化劑(如高錳酸酸鉀)等破壞。它能通過(guò)一般濾器，但能被活性炭、石棉濾材等所吸附。共五十頁(yè)生產(chǎn)中常用活性炭脫色去除(q ch)熱原，但須注意脫色時(shí)pH，溫度、炭用量及脫色時(shí)間等因素，還應(yīng)考慮它對(duì)抗生素的吸附問(wèn)題，否則會(huì)影響抗生素的產(chǎn)量；共五十頁(yè)此外，對(duì)某些產(chǎn)品可用超微過(guò)濾辦法去除熱原，還應(yīng)加強(qiáng)在生產(chǎn)(shngchn)過(guò)程中的環(huán)境衛(wèi)生以防止熱原。 共五十頁(yè)3. 固定化酶法生產(chǎn)(shngchn)L-氨基酸目前氨基酸在醫(yī)藥、食品

14、以及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)(shngchn)中的應(yīng)用越來(lái)越廣。以適當(dāng)比例配成的混合液可以直接注射到人體內(nèi)，用以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。各種必需氨基酸對(duì)人體的正常發(fā)育有保健作用，有些氨基酸還可以作為藥物，治療某些特殊疾病。共五十頁(yè)工業(yè)上生產(chǎn)L-氨基酸的一種方法(fngf)是化學(xué)合成法。但是由化學(xué)合成法得到的氨基酸都是無(wú)光學(xué)活性的D/L-外消旋混合物，所以必須將它進(jìn)行光學(xué)拆分，以獲得L-氨基酸。共五十頁(yè)外消旋氨基酸拆分的方法(fngf)有物理化學(xué)法、酶法等，其中以酶法最為有效，能夠產(chǎn)生純度較高的L-氨基酸。 共五十頁(yè)酶法生產(chǎn)(shngchn)L-氨基酸的反應(yīng)式 氨基?；覆鸱諨/L-氨基酸外消旋混合物 共五十頁(yè)N-?；疍/

15、L-氨基酸經(jīng)過(guò)氨基?；傅乃獾玫絃-氨基酸和未水解的N-酰化D-氨基酸，這兩種產(chǎn)物的溶解度不同，因而很容易分離。未水解的N-?；?D-氨基酸經(jīng)過(guò)外消旋作用后又成為(chngwi)D/L-型，可再次進(jìn)行拆分。 共五十頁(yè)制得的固定化氨基?；富钚愿?，穩(wěn)定性好，可用于連續(xù)拆分?；?DL-氨基酸。具體制備方法(fngf)如下：共五十頁(yè)固定化酶的制備(zhbi)將預(yù)先用pH 7.0、0.1mol/L磷酸緩沖液處理的DEAE-葡聚糖A-25溶液1 000 L，在35下與11001700 L的天然氨基(nj)?；杆芤?內(nèi)含33400萬(wàn)單位的酶)一起攪拌10 h，過(guò)濾后，得DEAE-葡聚糖-酶復(fù)合物，再

16、用水洗滌。所得固定化酶的活性可達(dá)16.7萬(wàn)20.0萬(wàn)單位/L，活性得率為5060。 共五十頁(yè)用此法制得的固定化氨基?；?，可以裝柱連續(xù)拆分D/L型外消旋氨基酸。生產(chǎn)(shngchn)不同的L-氨基酸，加入底物?；?DL-氨基酸要控制的流速也不同。 共五十頁(yè)DEAE-葡聚糖-氨基?；该钢牟僮鞣€(wěn)定性很好，半衰期可達(dá)65天。在長(zhǎng)期使用之后，酶柱上的酶可能(knng)有部分脫落，由于酶柱是由離子交換法將酶固定得到，因此再生十分容易，只要加入一定量的游離氨基?；?，酶柱便能完全活化。共五十頁(yè)用固定化酶連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸，產(chǎn)物的純化(chn hu)較簡(jiǎn)單，收率也比游離酶法要高，因此生產(chǎn)單位量L-氨基酸所需要的底物量較少。固定化氨基?；阜浅７€(wěn)定，用于酶的費(fèi)用大大減少。共五十頁(yè)固定化氨基?；该钢纳a(chǎn)工藝還可以自動(dòng)控制，這樣不僅改善了勞動(dòng)強(qiáng)度，而且大