生化實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)試驗(yàn)PAGE

1、生化實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)試驗(yàn)PAGE生命科學(xué)學(xué)院 相關(guān)知識(shí)背景生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn) 聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electropHoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺為支持介質(zhì)的電泳。聚丙烯酰胺是由單體丙烯酰胺（acrylamide. Acr）和交聯(lián)劑N, N-甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis）在催化劑過(guò)硫酸銨（ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8簡(jiǎn)稱AP）或核黃素(ribofavn即vitamin B2)和加速劑N, N, N, N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetramethyl ethylen

2、e diamine, 簡(jiǎn)稱TEMED)的作用下,聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。生命科學(xué)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)原理生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 聚丙烯酰胺凝膠電泳按其有無(wú)濃縮效應(yīng)分為連續(xù)及不連續(xù)系統(tǒng)，在連續(xù)系統(tǒng)中凝膠總濃度、緩沖液PH均相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下主要靠電荷及分子篩效應(yīng)得以分離；在不連續(xù)系統(tǒng)中緩沖液離子成分、PH、凝膠總濃度及電位梯度均不連續(xù)，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，可使稀的樣品在電泳中濃縮成層，因而具有良好的清晰度和分辨率。按器材來(lái)分主要有垂直的圓盤電泳和板狀電泳。下面就三種物理效應(yīng)的原理分別加以說(shuō)明：Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)生命科學(xué)學(xué)院 1.樣品濃縮效應(yīng) 上述不連續(xù)系統(tǒng)

3、中的三種不連續(xù)使樣品在濃縮膠中得到濃縮。（1）凝膠孔徑不連續(xù)性。在上述三層凝膠中，樣品膠及濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠。在電場(chǎng)作用下，蛋白質(zhì)顆粒在大孔膠中泳動(dòng)遇到的阻力小，移動(dòng)速度快，當(dāng)進(jìn)入小孔膠時(shí)，受到的阻力加大，移動(dòng)速度減慢，因而在2層凝膠交界處，樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶，并在此界面上依其電荷效多少依次排列分開(kāi)，通?？蓾饪s樣品300倍。 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)生命科學(xué)學(xué)院 （2）緩沖體系離子成分及pH值的不連系性。在三層凝膠中均有三羥甲基氨基甲烷（簡(jiǎn)稱Tris）及HCI。Tris的作用是維持溶液的電中性及PH值，是緩沖配對(duì)離子。HCI在任何溶液中均易解離出Cl-，在電場(chǎng)中遷移

4、率快，走在最前面成為快離子。電極緩沖液中的甘氨酸（Gly）,其pI在的電極緩沖液中,易解離出甘氨酸根（NH2CH2COO），而在的凝膠緩沖體系中，甘氨酸解離度最小，僅有0.11%，因而在電場(chǎng)中遷移很慢，稱為慢離子。大多數(shù)蛋質(zhì)pI在左右在或時(shí)均帶負(fù)電荷向正極移動(dòng)，其有效遷移率介于快離子和慢離子之間，于是蛋白質(zhì)就在快、慢離子形成的界面處，被濃縮成為極窄的區(qū)帶。當(dāng)進(jìn)入的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過(guò)蛋白質(zhì)；因此氯離子及甘氨酸根沿著離子界面繼續(xù)前進(jìn)。蛋白質(zhì)分子由于分子量大，被留在后面，然后再分成多個(gè)區(qū)帶。（如圖）。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)生命

5、科學(xué)學(xué)院 （電位梯度的不連續(xù)性。電位梯度的高低與電泳速度的快慢有關(guān)（V=mE）,遷移率低的離子在高電位梯度中可以與遷移率高而處于低電位梯度的離子具有相應(yīng)的速度（即E高m慢=E低m快）,電泳開(kāi)始后,由于快離子遷移率最大,就會(huì)很快超過(guò)蛋白質(zhì),因此在快離子后面形成一個(gè)離子濃度低的區(qū)域,即低電導(dǎo)區(qū),電場(chǎng)強(qiáng)度與電導(dǎo)成反比關(guān)系：I=E,式中E為電場(chǎng)強(qiáng)度,I為電流強(qiáng)度,為電導(dǎo)率,E與電導(dǎo)率成反比，所以低電導(dǎo)區(qū)就有了較高的電位梯度。這種高電位梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動(dòng)。在快離子和慢離子的移動(dòng)速度相等的穩(wěn)定狀態(tài)建立之后，則在快離子和慢離子之間形成一個(gè)穩(wěn)定而又不斷向陽(yáng)極移動(dòng)的界面。由于蛋白質(zhì)的有效遷

6、移恰好介于快、慢離子之間,因此也就聚集在這個(gè)移動(dòng)的界面附近,被濃縮形成一個(gè)狹小的中間層。由于濃縮膠為大孔膠, 對(duì)樣品沒(méi)有分子篩作用。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)生命科學(xué)學(xué)院 2.分子篩效應(yīng): 分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過(guò)一定孔徑分離膠時(shí),受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率,這就是分子篩效應(yīng)。蛋白質(zhì)進(jìn)入的同一孔徑的分離膠后。此時(shí),高電壓消失,在均一的電壓梯度下,由于甘氨酸解離度增加，加之其分子量小,其有效泳動(dòng)率增加,趕上并超過(guò)各種血清蛋白。進(jìn)入同一孔徑的小孔膠時(shí), 蛋白分子量小且為球形的蛋白質(zhì)分子所受阻力小,移動(dòng)快,走在前面；反之阻力大,移動(dòng)慢,走在后面,從而通過(guò)凝膠的分子篩作用將各

7、種蛋白質(zhì)分成各自的區(qū)帶。 3.電荷效應(yīng) 進(jìn)入的分離膠中,各種蛋白所帶凈電荷不同,而有不同的遷移率。表面電荷多,則遷移快；反之則慢。因此各種蛋白質(zhì)按電荷多少,分子量及形狀(既荷質(zhì)比q/r),以一定順序排成一個(gè)個(gè)區(qū)帶。 PAGE連續(xù)體系應(yīng)用也很廣,但無(wú)濃縮效應(yīng), 利用分子篩及電荷效應(yīng)進(jìn)行樣品分離,條件溫和,對(duì)生物活性的保持有益。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)試劑1、1mol/L鹽酸48.0 mL Tris 36.6g TEMED 0.

8、24 mL2、Acr 28.0g Bis3、過(guò)硫酸銨 4、1mol/L鹽酸48 mL Tris 5.98g TEMED 0.48 mL5、Acr 10.0g Bis6、蔗糖 7、電極緩沖液Tris克；甘氨酸 克；加水到1L用時(shí)稀釋10倍 生命科學(xué)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)步驟設(shè)計(jì)試驗(yàn)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)一、樣品的提取二、PAGE電泳三.結(jié)果分析生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)Exit（一）、樣品的提取一、過(guò)氧化物同功酶的提取 1.準(zhǔn)確稱取新鮮材料3g，加入9ml 提取緩沖液（Tris-HCI）和少許石英砂，研磨成勻漿。離心15min,上清液為可溶性蛋白和同工酶的粗提液。3.取上清液，分別加入蔗糖和溴酚藍(lán)。生

9、命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)二、聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直板1.裝膠槽：（1）配1%的瓊脂糖：用電子天平準(zhǔn)確稱取5g瓊脂糖，加水500ml,然后在電爐上加熱至微沸，并不斷攪拌，溶液由渾濁變?yōu)橥该骷纯?。?）取兩塊電泳玻板（其中一塊有凹槽），用鉻酸洗凈，再用自來(lái)水沖洗2-3次，最后用蒸餾水沖洗干凈，放于相應(yīng)的支架上直立干燥。（洗凈的玻板內(nèi)面要避免手指觸摸，以防沾污）（3）將帶有凹槽的玻璃放在凝膠模高一點(diǎn)的孔中，另一平板放于凝膠模有底槽的一邊.（4）將已插好玻板的凝膠模夾到貯槽中（使略低的玻板一側(cè)靠近負(fù)極），然后雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲帽.（5）傾斜電泳槽，用滴管吸取少量的1% 瓊脂糖溶

10、液，封好凝膠模板底邊和側(cè)邊生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)2.分離膠的配制：將貯液（除過(guò)硫酸銨外）按比例混合成工作液，按比例迅速加入過(guò)硫酸銨混勻，不要?jiǎng)×覕嚢枰悦鈳нM(jìn)空氣?；旌虾笥米⑸淦鲗⒐ぷ饕郝?、連續(xù)地沿管壁注入安放好的電泳板中，分離膠的高度約距矮玻璃板2cm，然后立即用注射器在分離膠液面上緩緩加入3-5毫米的蒸餾水層，可以看見(jiàn)凝膠與水之間明顯的界面。切勿使加入的水呈滴狀墜入膠液，而使頂部凝膠濃度變稀，改變凝膠孔徑。加水的目的是使凝膠聚合后有一個(gè)平整的表面，同時(shí)在凝膠聚合過(guò)程中使之與空氣隔離，減少氧氣對(duì)聚合的抑制作用。并防止因凝膠彎月面的存在造成電泳后蛋白質(zhì)區(qū)帶呈新月形。加入水

11、層后，讓其在電泳時(shí)的溫度條件下，靜止聚合。隨著聚合過(guò)程的進(jìn)行，水和凝膠的清楚界面慢慢消失，等到再次看清晰可見(jiàn)的界面時(shí)（如圖），表明表面的凝膠已聚合，再靜置30分鐘。生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)3.濃縮膠的制備：臨用時(shí)再制備。 將分離膠上的水層，用注射器和濾紙條除去，但不要觸及膠面。將濃縮膠貯液按比例混合成工作液，加入濃縮膠液至矮玻璃板平齊，然后靜置聚合?？吹綕饪s膠呈乳白色，表明聚合開(kāi)始，繼續(xù)半小時(shí)聚合完全。再向電泳槽中灌入電泳緩沖液加至高過(guò)矮玻璃板。生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Exit設(shè)計(jì)試驗(yàn)4.加樣： (1)垂直板：用微量注射器（或移液槍）取樣品溶液10-25l，小心地加入到凝膠

12、凹形樣品槽底部，因樣品比重大于電極緩沖液，因此，樣品液自動(dòng)沉降到膠面上平鋪成一層。5.電泳：（1）垂直板：先80V電泳一段時(shí)間,約60min后，再150V電泳。待指示劑快要到達(dá)玻璃板底部時(shí)，即快要接近瓊脂糖時(shí)，關(guān)閉電源，停止電泳。生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)5.取板：電泳完畢,倒出電極緩沖液,將膠板從電極槽上卸下,平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。揭掉橡皮夾套，將兩塊玻璃板置于自來(lái)水龍頭下沖洗掉瓊脂糖凝膠設(shè)計(jì)試驗(yàn)生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)6.剝膠：用解剖刀柄輕輕從板側(cè)縫間撬開(kāi)玻板（注意切忌從凹槽處撬，以防使膠斷裂）。用刀片在膠板一端切除一角作為標(biāo)記。用磨平針尖的獸醫(yī)用針頭吸取無(wú)離子水把凝膠從短形玻璃板上剝離，并慢慢把膠板沖入白瓷盤或大培養(yǎng)皿內(nèi)，即可固定與染色。設(shè)計(jì)試驗(yàn)撬板剝