藥物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)演示課件(PPT 68頁)

1、藥物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師： 劉 娟 羅藝晨第1頁，共68頁。毒性試驗(yàn) 給實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行不同途徑、不同期限的染毒、檢測各種毒性終點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)。其目的是確定無害作用水平、毒性類型、靶器官、劑量-反應(yīng)關(guān)系，為安全性評價或危險性評價提供重要的資料。第2頁，共68頁。 評價一個藥物的毒性試驗(yàn)方法：急性毒性試驗(yàn)、亞慢性毒性試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)、特殊毒性試驗(yàn)（遺傳、生殖、致突變等）、其它毒性試驗(yàn)（刺激性、過敏性、溶血性等）等。 評價一個藥物的毒性指標(biāo)：安全劑量（safety dose）、最小中毒劑量（minimal toxic dose）、最大耐受劑量（MTD）、半數(shù)致死量（LD50）、治療指數(shù)（TI=LD50/ED

2、50）、安全范圍（MS=LD1/ED99或LD5/ED95）第3頁，共68頁。 急性毒性試驗(yàn) 是指一次或24小時內(nèi)多次染毒的試驗(yàn)，是毒性研究的第一步。要求采用嚙齒類或非嚙齒類兩種動物。通常為小鼠或大鼠采用經(jīng)口、吸入或經(jīng)皮染毒途徑。急性毒性試驗(yàn)主要測定半數(shù)致死量（濃度），觀察急性中毒表現(xiàn)， 亞慢性毒性 是指實(shí)驗(yàn)動物連續(xù)多日接觸較大劑量的外來化合物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)。所謂較大劑量，是指小于急性LD50的劑量?！岸嗳铡钡拇_切天數(shù)，至今尚無完全統(tǒng)一的認(rèn)識。一般認(rèn)為在環(huán)境毒理學(xué)與食品毒理學(xué)中所要求的連續(xù)接觸為36個月，而在工業(yè)毒理學(xué)中認(rèn)為13月即可。 第4頁，共68頁。 慢性毒性試驗(yàn) 是確定外來化合物的毒

3、性下限，即長期接觸該化合物可以引起機(jī)體危害的閾劑量和無作用劑量。一般認(rèn)為環(huán)境毒理學(xué)與食品毒理學(xué)則要求實(shí)驗(yàn)動物染毒1年以上或2年，而工業(yè)毒理學(xué)慢性試驗(yàn)動物染毒6個月或更長時間。 特殊毒性試驗(yàn) 包括致畸、致癌、致突變作用以及生殖毒性試驗(yàn)。 （1）致突變實(shí)驗(yàn)包括微生物回復(fù)突變試驗(yàn)、哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)和整體試驗(yàn)（常選用微核試驗(yàn)）。 作用于生殖系統(tǒng)的藥物， 需進(jìn)行動物顯性致死試驗(yàn)。 （2） 致癌實(shí)驗(yàn)： 短期致癌實(shí)驗(yàn)和長期致癌實(shí)驗(yàn)。 （3） 致畸胎試驗(yàn)：于孕鼠或孕兔胚胎的器官形成期給藥，觀察對子代的影響。第5頁，共68頁。 最大耐受劑量(MTD) 指在外來化合物急性毒性實(shí)驗(yàn)中,化學(xué)物質(zhì)不引起受

4、試對象(實(shí)驗(yàn)動物)出現(xiàn)死亡的最高劑量,故可縮寫為LD0。一般不用最大耐受劑量來比較兩種外來化合物的毒性。 治療指數(shù) 為藥物的安全性指標(biāo)。通常將半數(shù)中毒量（TD50）/半數(shù)有效量（ED50)或半數(shù)致死量（LD50）/半數(shù)有效量（ED50）稱為治療指數(shù)。治療指數(shù)大的藥物相對治療指數(shù)小的藥物安全，但以治療指數(shù)來評價藥物的安全性，并不完全可靠。 安全范圍 是指藥物的最小有效量與最小中毒量之間的范圍，它表示藥物的安全性，一般安全范圍越大，用藥越安全。藥理學(xué)用上95%有效劑量（ED95）到5%中毒劑量（LD5）的距離來表示。第6頁，共68頁。實(shí)驗(yàn)一 急性毒性試驗(yàn)第7頁，共68頁。 （一） 藥物L(fēng)D50的測

5、定第8頁，共68頁。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）理念是藥三分毒;（2）了解一些常規(guī)藥物毒理學(xué)的試驗(yàn)方法，及評價指標(biāo);（3）掌握藥物急性毒性試驗(yàn)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法、LD50的測定及計(jì)算方法。第9頁，共68頁。二. 實(shí)驗(yàn)原理 選擇健康的實(shí)驗(yàn)動物，根據(jù)體重按隨機(jī)分組方法，根據(jù)LD50計(jì)算的設(shè)計(jì)原則將動物分成數(shù)個染毒組。一次或24h后，觀察動物所產(chǎn)生的警醒毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，中毒死亡的情況等，根據(jù)各組動物死亡數(shù)計(jì)算半數(shù)致死量（LD50）。據(jù)此分析受試動物毒性反應(yīng)與劑量的關(guān)系，并根據(jù)LD50值對藥物進(jìn)行毒性分級。第10頁，共68頁。三.實(shí)驗(yàn)材料（1）器材 1ml注射器、電子天平、記號筆、鑷子、剪刀等。（2）藥品 鹽

6、酸賽拉嗪注射液。（3）動物 健康成年小白鼠若干只，體重18-22g。第11頁，共68頁。四.實(shí)驗(yàn)方法1. 預(yù)實(shí)驗(yàn)各組劑量分別為Dmax、（ Dmax ）r、（ Dmax ）r2、(Dmax)r3.第12頁，共68頁。2.正式試驗(yàn)2.1試驗(yàn)步驟隨機(jī)分成5組記錄小鼠死亡只數(shù)60min小白鼠禁食6-10h各組按試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案給藥計(jì)算LD50得出結(jié)論第13頁，共68頁。將小白鼠隨機(jī)分成5組，每 組4只(隨機(jī)單位組設(shè)計(jì)方法)。（1）小白鼠編號（從1-20號）用兩種顏色記號筆進(jìn)行標(biāo)記：黑色代表個位（藍(lán)色記號筆）；紅色代表十位（紅色記號筆）。（2）小鼠稱重并按體重大小依次排序。第14頁，共68頁。2.2 試驗(yàn)

7、設(shè)計(jì) 組別小鼠編號156211218912103201384719164513151714第15頁，共68頁。2.3 給藥方法：肌肉注射組別注射濃度（mg/kg）注射量110000.005mL/g體重2850372046605520表1：給藥方案第16頁，共68頁。3.試驗(yàn)結(jié)果記錄組別注射濃度（mg/kg）動物數(shù)死亡數(shù)死亡率備注11000428504372044660455204表2：結(jié)果記錄表第17頁，共68頁。4. 計(jì)算LD504.1計(jì)算方法：目測機(jī)率單位法、加權(quán)機(jī)率單位法(Bliss法)、寇氏法、序貫法。4.2 Bliss法是目前推薦使用的方法。此法對劑量分組無嚴(yán)格要求，不需要劑量組有0

8、%和100%死亡率，是目前公認(rèn)最準(zhǔn)確的測定方法。4.3 我國衛(wèi)生部規(guī)定，Bliss法是作為新藥LD50測定評定必須采用的方法。第18頁，共68頁。計(jì)算方法1：加權(quán)機(jī)率單位法(Bliss法)-軟件輔助計(jì)算第19頁，共68頁。計(jì)算方法2： 2. 改良寇氏法公式計(jì)算： LD50=log-1Xm-i(p-0.5)Xm：為最大劑量組劑量對數(shù)值；i：為相鄰兩組劑量比值的對數(shù)（相鄰兩組對數(shù)劑量的差值，log2）；P：為各組動物死亡率（用小數(shù)表示，如果死亡率為20%應(yīng)寫成0.20）；p：各組動物死亡率之總和 。第20頁，共68頁。5. 評價指標(biāo)急性毒性分級 小鼠一次經(jīng)口LD50 大致相當(dāng)于體重 70kg人的致

9、死劑量極毒1 mg/kg 10000 mg/kg 1050克第21頁，共68頁。6. 注意事項(xiàng)6.1 正確捉拿小白鼠，防止咬傷；6.2 注意肌肉注射方法，給藥劑量力求準(zhǔn)確；6.3 實(shí)時注意觀察小鼠中毒癥狀及其發(fā)生時間、死亡時間。 第22頁，共68頁。7. 作業(yè)7.1 查閱文獻(xiàn)，與國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報道結(jié)果作比較。7.2 撰寫試驗(yàn)報告第23頁，共68頁。（二） 刺激性試驗(yàn) 1. 皮膚刺激實(shí)驗(yàn) 2. 眼部刺激實(shí)驗(yàn)第24頁，共68頁。1.皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過比較染毒動物與正常動物皮膚的變化，學(xué)習(xí)評價外源性化學(xué)物急性皮膚刺激的 基本方法。第25頁，共68頁。二、實(shí)驗(yàn)原理 皮膚刺激試驗(yàn)是指皮膚接

10、觸藥物是否產(chǎn)生可逆性炎性癥狀的試驗(yàn)，它又分急性皮膚刺激試驗(yàn)（一次皮膚涂抹實(shí)驗(yàn)）和多次皮膚刺激試驗(yàn)。 所有皮膚刺激試驗(yàn)方法都在Draixe, Waodard和Calvery(1944）所提方法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。目前多選用家兔和豚鼠，對于強(qiáng)刺激或無刺激作用的藥物用家兔檢測效果好，但對作用緩和的刺激藥物用豚鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果較準(zhǔn)確。Criffth（1977）發(fā)現(xiàn)家兔通常比豚鼠和人更易敏感，用這兩種動物評價人體反應(yīng)更為合理。第26頁，共68頁。三、實(shí)驗(yàn)材料 1、動物：成年健康家兔。家兔休重2kg左右，與給受試物24小時將動物背部脊柱兩側(cè)毛脫掉，脫毛面積約為體表面積1（家兔每側(cè)各約50cm2）。2、受試物：膏

11、劑、液體或粉末。粉末需用適宜賦形劑（如羊毛脂、凡士林等）混勻，本實(shí)驗(yàn)采用10%雙氧水溶液。第27頁，共68頁。四、實(shí)驗(yàn)方法 1、實(shí)驗(yàn)操作：在家兔背部受試物區(qū)和對照區(qū)（脫毛后），一次將受試物1ml均勻涂布受試物區(qū)，將生理鹽水涂布于空白對照區(qū)，再以醫(yī)用紗布及膠布進(jìn)行包扎固定，開始計(jì)時。在給藥后30分鐘取下包扎，用溫水洗凈皮膚上的殘留受試物，觀察受試區(qū)皮膚的變化，有無紅斑、水腫等現(xiàn)象。如為多次給受試物實(shí)驗(yàn)則一般每日涂抹一次，連續(xù)一周，其余均與一次給受試物的方法和要求一致。 第28頁，共68頁。2、結(jié)果判斷與評價 每只動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果按表1進(jìn)行刺激反應(yīng)評分，計(jì)算出平均分值按表2進(jìn)行刺激強(qiáng)度評價：第29頁，

12、共68頁。紅斑形成積分無紅斑0勉強(qiáng)可見1明顯紅斑2中等-嚴(yán)重紅斑3紫紅色紅斑并有焦痂形成4水腫形成無水腫0勉強(qiáng)可見1皮膚隆起輪廓清楚2水腫隆起約1mm3水腫隆起超過1mm，范圍擴(kuò)大4總分8表1 皮膚刺激反應(yīng)評分第30頁，共68頁。表2 皮膚刺激強(qiáng)度評價刺激反應(yīng)分值無刺激0-0.4輕度刺激0.5-2.9中度刺激3-5.9強(qiáng)刺激6.0-8.0第31頁，共68頁。2. 眼刺激試驗(yàn)一.試驗(yàn)?zāi)康?1.眼刺激試驗(yàn)?zāi)康模?2.眼刺激試驗(yàn)方法； 3.眼刺激試驗(yàn)結(jié)果的評價方法。第32頁，共68頁。1.動物：家兔；2.受試物：10%雙氧水溶液；3.劑量：滴入1滴；4.方法：滴入一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，另一側(cè)作為空白對照（

13、滴入等量生理鹽水）。給藥后使眼睛被動閉合1min。記錄給藥后5min、10min、15min、20min時眼的局部反應(yīng)情況（1h、12h、24h、48h、72h）。二、實(shí)驗(yàn)材料第33頁，共68頁。眼睛部分結(jié)構(gòu)：模式圖第34頁，共68頁。THANK YOUSUCCESS2022/7/2135可編輯第35頁，共68頁。眼刺激試驗(yàn)-角膜評分刺激反應(yīng)強(qiáng)度評分無混濁 0極輕微彌漫性混濁，虹膜清晰可見 1輕度混濁（虹膜細(xì)微結(jié)構(gòu)不清晰）2混濁（虹膜結(jié)構(gòu)不清，瞳孔大小看不到）3極混濁（虹膜完全看不到）4第36頁，共68頁。眼刺激試驗(yàn)虹膜評分 刺激反應(yīng)強(qiáng)度 評分 正常 0皺褶明顯加深，充血，腫脹，角膜周圍輕度充

14、血，瞳孔對光仍有反應(yīng) 1出血，肉眼可見壞死，對光無反應(yīng)（或出現(xiàn)其中一種反應(yīng)） 2第37頁，共68頁。眼刺激試驗(yàn)結(jié)膜評分. 充血（指瞼結(jié)膜、球結(jié)膜部位） 評分 血管正常 血管充血呈鮮紅色 血管充血呈深紅色，血管不易分辨 彌漫性充血呈紫紅色 . 水腫 無水腫 輕微水腫（包括瞬膜） 明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻 水腫至眼瞼近半閉合 水腫至眼瞼超半閉合 . 分泌物 無分泌物 少量分泌物 分泌物使眼瞼和睫毛潮濕或粘著 分泌物使整個眼區(qū)潮濕或粘著 第38頁，共68頁。分值計(jì)算方法角膜評分：分值虹膜評分：分值結(jié)膜評分：（）分值總分：項(xiàng)評分之和。分值范圍（分）第39頁，共68頁。 眼刺激性評價標(biāo)準(zhǔn) 刺激程度 積

15、 分無刺激性 5輕度刺激性 輕度刺至中度刺激性 中度刺激性 中度至重度度刺激性 重度刺激性 第40頁，共68頁。作業(yè)撰寫試驗(yàn)報告。第41頁，共68頁。實(shí)驗(yàn)二 特殊毒性試驗(yàn) 特殊毒性包括致畸、致癌、致突變作用和生殖毒性。 藥物對遺傳物質(zhì)的損傷,被稱為“藥物的遺傳毒性”。若藥物影響生殖細(xì)胞使形成的配子(精子和卵)的遺傳物質(zhì)發(fā)生突變,可能致使發(fā)育期間的胎兒發(fā)生先天性畸形。突變?nèi)绨l(fā)生在體細(xì)胞,在個體中可導(dǎo)致腫瘤的形成。藥物的致癌性,致畸性,致突變性都是屬于藥物特殊毒性的研究范圍。三者之間關(guān)系交錯癌變與突變,致癌物與致突變物有著密切的關(guān)系。第42頁，共68頁。1.小鼠骨髓微核試驗(yàn)2.藥物免疫毒性試驗(yàn)（環(huán)

16、磷酰胺對小鼠免疫器官重量的影響）第43頁，共68頁。1. 小鼠骨髓微核試驗(yàn)學(xué)習(xí)小鼠骨髓微核試驗(yàn)原理及目的 掌握微核試驗(yàn)的制片方法 掌握微核的觀察計(jì)數(shù) 掌握微核試驗(yàn)的結(jié)果分析評價4123一. 試驗(yàn)?zāi)康牡?4頁，共68頁。 微核試驗(yàn)（MNT）是檢測染色體或有絲分裂期損傷的一種遺傳毒性試驗(yàn)方法。無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細(xì)胞分裂后期仍留在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)成為微核。 最常用的是嚙齒類動物骨髓嗜多染紅細(xì)胞(PCE)微核試驗(yàn)。以受試物處理嚙齒類動物，然后處死，取骨髓，制片、固定、染色，于顯微鏡下計(jì)數(shù)PCE中的微核。如果與對照組比較，處理組PCE微核率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加，并有劑量

17、-反應(yīng)關(guān)系，則可認(rèn)為該受試物是哺乳動物體細(xì)胞的致突變物。二.實(shí)驗(yàn)原理第45頁，共68頁。微 核（micronucleus, 簡稱MCN） 微核是在細(xì)胞的有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進(jìn)入子細(xì)胞形成細(xì)胞核時，仍然留在細(xì)胞質(zhì)中的染色單體或染色體的無著絲粒片斷或環(huán)。最后單獨(dú)形成一個或幾個規(guī)則的次核，存在于細(xì)胞質(zhì)中，由于比核小得多故稱微核。 微核的產(chǎn)生與染色體損傷有關(guān)。 也叫衛(wèi)星核,是真核類生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu),是染色體畸變在間期細(xì)胞中的一種表現(xiàn)形式。第46頁，共68頁。微核試驗(yàn)(Micronucleus test，MNT) 通過試驗(yàn)觀察受試動物是否產(chǎn)生微核的試驗(yàn)。從而判斷受試動物是否發(fā)生突變（測試干

18、擾有絲分裂的物質(zhì)）。 微核可出現(xiàn)在多種細(xì)胞中，但在有核細(xì)胞 中較難與正常核的分支相區(qū)別，由于紅細(xì)胞在成熟前最后一次分離后數(shù)小時可將主核排出，而仍保留微核于嗜多染紅細(xì)胞（PCE）中，而且在骨髓中微核形成達(dá)到高峰。因此，通常計(jì)數(shù)骨髓中PCE細(xì)胞中的微核數(shù)作為判斷指標(biāo)。第47頁，共68頁。第48頁，共68頁。 PCE（polychromatic erythrocyte）指嗜多染紅細(xì)胞， NCE（normochromatic erythrocyte）指正染紅細(xì)胞， RBC（red blood cell）指紅細(xì)胞，包括PCE和NCE。 PCENCE為評價細(xì)胞毒性的指標(biāo)，代表未成熟紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比值

19、。微核試驗(yàn)中計(jì)算PCENCE比值時，每只動物應(yīng)至少計(jì)數(shù)200個紅細(xì)胞（即：PCE+NCE200個）。微核試驗(yàn)中未成熟紅細(xì)胞占總紅細(xì)胞的比值不應(yīng)少于對照組的20。第49頁，共68頁。三. 實(shí)驗(yàn)器材及試劑器材 手術(shù)刀、手術(shù)剪、干凈紗布、玻璃染色缸、1ml注射器、6號針頭、載玻片、帶油鏡頭顯微鏡。試劑小牛血清、Giemsa應(yīng)用液、 二甲苯。實(shí)驗(yàn)動物：昆明小白鼠第50頁，共68頁。四.試驗(yàn)動物處理1 試驗(yàn)分組 模型組：用1%環(huán)磷酰胺按0.1ml/10g(100mg/kg)劑量進(jìn)行經(jīng)口染毒兩次，間隔24h； 空白對照組： 灌服等量生理鹽水；第51頁，共68頁。2、采樣制片（1）骨髓液的制備和涂片 試驗(yàn)動

20、物用頸椎脫臼的方法將其處死，剖開后肢取下股骨，擦凈血污，剔去肌肉，剪去兩端骨骺。用1ml注射器接6號針頭吸取約0.05ml小牛血清，沖洗骨髓腔1-2次，沖洗物用潔凈載玻片接著，混合均勻后推片，晾干（可用酒精燈短時烘烤加快晾干速度）。第52頁，共68頁。涂片滴加一滴于載玻片上，再取一張載玻片30勻速滑動第53頁，共68頁。（2）固定與染色1）. 固定：將推好晾干的骨髓片用甲醇固定5-10min取出晾干。2）. 染色：將固定晾干后的涂片、用新鮮配制的Giemsa應(yīng)用液(Giemsa儲備液1份加pH6.4的磷酸鹽緩沖液9份)染色10-15min，然后沖洗掉玻片上的染色液，晾干。 第54頁，共68頁。

21、3、觀察 先在低倍鏡下觀察，選擇分布及染色較好的區(qū)域，再在油鏡下觀察計(jì)數(shù)。1.嗜多染紅細(xì)胞(PCE)呈灰藍(lán)色(未成熟紅細(xì)胞)；2.正染紅細(xì)胞(NCE)呈粉紅色(成熟紅細(xì)胞)；3.觀察PCE細(xì)胞中的微核(MN)(微核多數(shù)呈圓形，邊緣光滑整齊，呈紫紅色或藍(lán)紫色)第55頁，共68頁。第56頁，共68頁。4、計(jì)數(shù)1）.計(jì)數(shù)200個RBC(PCE+NCE)得出PCE與NCE的比值 PCE/NCE比值= PCE個數(shù)/NCE個數(shù)2）.計(jì)數(shù)1000個PCE細(xì)胞得出含有微核的PCE細(xì)胞個數(shù)。 微核率=（含微核PCE個數(shù)/計(jì)數(shù)PCE總數(shù)）1000 結(jié)果以千分率表示。第57頁，共68頁。實(shí)驗(yàn)記錄計(jì)算各組微核細(xì)胞率第58頁，共68頁。結(jié)果分析與評價PCE/NCE比值：正常的PCE/NCE比值約為1(正常范圍為0.6-1.2)試驗(yàn)組：如比值 0.1X0.6,表示受到PCE形成受到不同程度抑制;如比值0.05X0.1，則表示PCE形成受到嚴(yán)重抑制；比值0.05，表示受試化學(xué)毒物的劑量過大，試驗(yàn)結(jié)果不可靠。第59頁，共68頁。注意事項(xiàng)1.做好推片和控制好染色時間是試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。2.顯微鏡在油鏡下觀察，