鎘對(duì)蛤仔過(guò)氧化氫酶活力的影響(共15頁(yè))

1、本 科 畢 業(yè) 論 文題目(tm)：鎘對(duì)蛤仔過(guò)氧化氫(u yn hu qn)酶活力(hul)的影響姓名孫田力院系生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)生物技術(shù)年級(jí)2008級(jí)學(xué)號(hào)20082513500指導(dǎo)教師孫振興2012年5月20日目 錄 TOC o 1-3 u 1 材料(cilio)與方法 PAGEREF _Toc326263008 h 21.1 實(shí)驗(yàn)(shyn)材料、工具及試劑 PAGEREF _Toc326263009 h 21.2 實(shí)驗(yàn)(shyn)準(zhǔn)備 PAGEREF _Toc326263010 h 21.3 染毒 PAGEREF _Toc326263015 h 21.4 樣品制備和處理 PAGEREF _

2、Toc326263017 h 31.5 紫外速率直接法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活力 PAGEREF _Toc326263021 h 31.6 考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 PAGEREF _Toc326263023 h 42 結(jié)果 PAGEREF _Toc326263024 h 52.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線 PAGEREF _Toc326263025 h 52.2 鎘對(duì)蛤仔外套膜過(guò)氧化氫酶活力的影響 PAGEREF _Toc326263026 h 52.3 鎘對(duì)蛤仔鰓過(guò)氧化氫酶活力的影響 PAGEREF _Toc326263027 h 62.4 鎘對(duì)蛤仔消化盲囊過(guò)氧化氫酶活力的影響 PAGEREF

3、_Toc326263028 h 73 討論 PAGEREF _Toc326263029 h 83.1 蛤仔過(guò)氧化氫酶活力的變化規(guī)律 PAGEREF _Toc326263030 h 83.2 關(guān)于實(shí)驗(yàn)方法對(duì)結(jié)果的影響 PAGEREF _Toc326263035 h 93.2.1 紫外速率直接法的特點(diǎn) PAGEREF _Toc326263036 h 93.2.2 測(cè)CAT活力的其他方法 PAGEREF _Toc326263039 h 93.2.3 Cd對(duì)其他水生生物CAT活力的影響 PAGEREF _Toc326263040 h 103.2.4 實(shí)驗(yàn)中的一些體會(huì) PAGEREF _Toc32626

4、3041 h 10參考文獻(xiàn) PAGEREF _Toc326263045 h 11致 謝 PAGEREF _Toc326263046 h 12魯東大學(xué)本科畢業(yè)論文 PAGE 12 鎘對(duì)蛤仔過(guò)氧化氫(u yn hu qn)酶活力(hul)的影響(yngxing)孫田力（生命科學(xué)學(xué)院，生物技術(shù)，2008級(jí)2班，20082513500）摘要：本實(shí)驗(yàn)用紫外速率直接法分別對(duì)Cd2+脅迫下菲律賓蛤仔的外套膜、鰓和消化盲囊在24 h、48 h、72 h和96 h過(guò)氧化氫酶活力的變化進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，Cd2+對(duì)蛤仔外套膜和鰓過(guò)氧化氫酶活力的影響呈現(xiàn)先興奮后抑制的趨勢(shì)，Cd2+對(duì)蛤仔消化盲

5、囊過(guò)氧化氫酶活力的影響呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)。蛤仔外套膜、鰓、消化盲囊中過(guò)氧化氫酶活力的變化可用于Cd2+污染的早期檢測(cè)，且消化盲囊中的過(guò)氧化氫酶活力變化更加靈敏。關(guān)鍵詞：菲律賓蛤仔；Cd2+；過(guò)氧化氫酶Effect of cadmium on the CAT activity of the clams Ruditapes philippinarum Sun Tianli(College of life science, Biotechnology Class 2, Grade 2008, 20082513500)Abstract: This experiment uses the direct

6、ultra-velocity method of pollution Cd2+ Philippines clam mantle, gills and digestive diverticula of the24 h, 48 h, 72 h, 96 h hydrogen peroxide enzyme activity were determined. It is proved that with the extension of time, Cd2+ on clam mantle and gill of catalase activity appears after the first exc

7、itement inhibitory trend, Cd2+ on clam digestive diverticula catalase activity continued to show a downward trend. The clam gills, mantle, digest blind sac hydrogen peroxide enzyme activity can be used Cd2+ poisoning in early detection, and digest blind sac hydrogen peroxide enzyme activity can be u

8、sed as a more sensitive indicator of the conclusion.Key words: Ruditapes philippinarum; cadmium; catalase環(huán)境中的重金屬鎘等無(wú)機(jī)污染物超過(guò)一定的生物耐受濃度就會(huì)對(duì)生物體內(nèi)生理生化方面產(chǎn)生毒性影響，可以導(dǎo)致細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)變化以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的改變1,2，誘發(fā)哺乳動(dòng)物器官發(fā)生癌變。水體中的重金屬離子超過(guò)一定的濃度同樣會(huì)導(dǎo)致水生動(dòng)物中毒，影響水生動(dòng)物正常的生理生化活動(dòng)，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡3。對(duì)魚類和哺乳動(dòng)物的研究表明，鎘可以改變超氧化物歧化酶(SOD)，過(guò)氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶

9、(GPX)等抗氧化酶的活力，降低細(xì)胞對(duì)自由基及其產(chǎn)物的清除能力4,5。關(guān)于鎘對(duì)魚類及哺乳動(dòng)物(brdngw)毒理影響已經(jīng)有相當(dāng)廣泛和深人的研究，目前，鎘對(duì)甲殼類動(dòng)物毒理影響的研究也已有所進(jìn)展6。與甲殼類動(dòng)物(dngw)相似，軟體動(dòng)物蛤仔營(yíng)底棲生活，受水體中重金屬危害的機(jī)會(huì)也較大。菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）廣泛分布在我國(guó)南北海區(qū)，它養(yǎng)殖周期短，生長(zhǎng)(shngzhng)迅速，適應(yīng)性強(qiáng)（廣溫、廣鹽、廣分布），離水存活時(shí)間長(zhǎng)，是一種適合于人工高密度養(yǎng)殖的優(yōu)良貝類，是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一，具有極其重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。通過(guò)對(duì)重金屬鎘對(duì)菲律賓蛤仔過(guò)氧化氫酶活力的影響的研究，我們

10、希望能夠探究海水中鎘含量和蛤仔在受污染的海水中生活時(shí)間與其體內(nèi)過(guò)氧化氫酶活力之間的關(guān)系，從而找到一種比化學(xué)方法更靈敏的檢測(cè)海水中低濃度重金屬污染的生物檢測(cè)方法，以便于在污染發(fā)生的早期做出預(yù)警，在實(shí)際生產(chǎn)中可以作為一定的參考。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料、工具及試劑實(shí)驗(yàn)采用在魯東大學(xué)附近農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買的新鮮菲律賓蛤仔，在實(shí)驗(yàn)室里用海水養(yǎng)殖，每天早上9點(diǎn)更換海水，海水溫度12，不對(duì)其投餌，并隨時(shí)取出死亡的蛤仔。兩天后，任取30只蛤仔分別用游標(biāo)卡尺和天平測(cè)量其殼長(zhǎng)、殼寬、殼高和帶殼濕重，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算其平均值。經(jīng)計(jì)算，平均殼長(zhǎng)3.13cm， 平均殼寬2.07cm，平均殼高1.28cm，平均帶殼濕重5

11、.32g。實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備有：電子天平、UV2100紫外分光光度計(jì)、解剖用具、容量瓶、棕色瓶、移液槍、離心管、試管、HITACHI CT15RE低溫離心機(jī)、高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、超低溫冰箱等。實(shí)驗(yàn)主要試劑有： 0.05mol/L磷酸鹽緩沖液：稱取無(wú)水KH2PO4 1.362 g、Na2HPO4 1.42 g，加蒸餾水至500 ml，調(diào)pH 7.0，室溫保存。 H2O2貯存液（2 mol/L）：量取30% H2O2溶液100 ml，加蒸餾水至500 ml，4保存。 H2O2應(yīng)用液（0.015 mol/L）：量取1.5ml H2O2貯存液，用磷酸鹽緩沖液稀釋至200 ml，4保存。每次使用前在2

12、40 nm測(cè)定，使A240在0.50.55之間為宜。若大于0.55，用磷酸緩沖液稀釋；若小于0.5，用30% H2O2調(diào)節(jié)?？捡R斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑：10 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，5 ml 90乙醇，10 ml 85（m/v）磷酸，加蒸餾水至100 ml。1.2 實(shí)驗(yàn)(shyn)準(zhǔn)備(zhnbi)器材(qci)滅菌： = 1 * GB2 取潔凈的1.5ml離心管約400個(gè)，槍頭若干，玻璃研磨棒20只，置于大燒杯中，用錫箔紙封口，放入高壓滅菌鍋中121滅菌20min，滅菌后置于超凈臺(tái)中保存。 = 2 * GB2 解剖器具如剪刀、鑷子、手術(shù)刀等，在使用前在酒精燈火焰上灼燒滅菌。藥品配置：按要

13、求配置藥品，置于棕色瓶中保存，貼上標(biāo)簽。1.3 染毒依據(jù)以前的同學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鎘對(duì)菲律賓蛤仔96h的Lc50為11.31 mg/L。分組染毒：養(yǎng)殖2天后，10只小桶，分別標(biāo)記為空白A、空白B、1/10A、1/10B、1/8A、1/8B、1/4A、1/4B、1/2A、1/2B，共5組，每組2只桶平行對(duì)照。分別向每只桶里加入4L海水和15只蛤仔，不投餌，不充氧，每天早上9點(diǎn)換水，水溫12。每天換水后立刻加入一定量鎘的母液，用木棒攪拌均勻。實(shí)驗(yàn)期間染毒至96h。1.4 樣品制備和處理樣品制備：染毒24h后，從每只桶中取出3只蛤仔，置于白色解剖盤內(nèi)，用鑷子砸碎外殼，分別取出外套膜、鰓、消化盲囊，用勻漿

14、液清洗后分別放入滅菌的1.5ml離心管中并做好標(biāo)記，每個(gè)桶的9只離心管放在一個(gè)小袋中，標(biāo)記，每個(gè)批次共10小袋，用大袋裝好，標(biāo)記，置于超低溫冰箱中保存待用。同理，染毒48h、72h、96h后分別取樣，標(biāo)記，置于超低溫冰箱中保存。樣品處理：測(cè)定前，從超低溫冰箱中取出待測(cè)樣品，待稍融化后加入200ul勻漿液，在冰盒內(nèi)用研磨棒仔細(xì)研磨后，再加入約1000ul勻漿液，搖勻，配平，以便于離心。將離心管對(duì)稱放入低溫離心機(jī)中離心，每次離心一組9管，用空白水管配平。4000rpm離心10min，取出后取上清液進(jìn)行測(cè)定。1.5 紫外速率直接法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活力原理：紫外速率直接法是利用CAT分解H2O2生成H2

15、O和O2這一反應(yīng)。該反應(yīng)不可能遵循零級(jí)反應(yīng)，因?yàn)樵贖2O2的商品濃度范圍（5mol/L）內(nèi)酶不可能達(dá)到底物飽和，且當(dāng)H2O2濃度超過(guò)0.1mol/L時(shí)，有活力的CAT-H2O2復(fù)合物與H2O2進(jìn)一步結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)活力的復(fù)合物、，使酶活力降低而無(wú)法在底物飽和情況下測(cè)定酶活力。然而此反應(yīng)在一定底物濃度范圍內(nèi)符合一級(jí)反應(yīng)，即反應(yīng)速率與底物濃度和CAT活力兩者相關(guān)，而反應(yīng)速率常數(shù)K僅與CAT活力成正比，與底物濃度無(wú)關(guān)。在240nm測(cè)定反應(yīng)中H2O2在一定時(shí)間內(nèi)的吸光度降低值（240=0.003940.00021/mmolmm），可計(jì)算出反應(yīng)速率常數(shù)K以代表CAT活力。K=（2.3/t）A0/At。步驟：

16、預(yù)熱紫外分光光度計(jì)20min，調(diào)波長(zhǎng)至240nm，打開(kāi)(d ki)氘燈，關(guān)閉鎢燈，A模式下調(diào)零。使用石英比色皿進(jìn)行測(cè)定。將H2O2應(yīng)用(yngyng)液從冰箱中取出，室溫下放置，使其溫度達(dá)到室溫，測(cè)定吸光值，使A240在0.5 - 0.55之間為宜。若大于0.55，用磷酸(ln sun)緩沖液稀釋；若小于0.5，用30% H2O2調(diào)節(jié)。在測(cè)定管中加入2.8ml0.015mol/LH2O2及0.2ml樣品，空白管中以蒸餾水替代0.015mol/LH2O2，以空白管調(diào)零，在240nm處記錄測(cè)定管初始吸光度值A(chǔ)0及30秒吸光度值A(chǔ)30，用于CAT活力計(jì)算（如表1）。表1 紫外速率法試劑加樣表試 劑測(cè)

17、定管空白管0.015 mol/L H2O2 (ml)H2O (ml)樣品 (ml）2.8/0.2/2.80.2結(jié)果計(jì)算：因?yàn)樵摲磻?yīng)不可能符合零級(jí)反應(yīng)，因此不能用國(guó)際單位制中的國(guó)際單位來(lái)表示酶活力。CAT活力的測(cè)定方法不同，所定義的單位也各不相同，本試驗(yàn)中樣品CAT活力用U/g蛋白表示。CAT活力（U/g）=(2.3a/30b)(A0/A30)上式中，a:測(cè)定體系中樣品稀釋倍數(shù) b:樣品中蛋白質(zhì)濃度。注意： = 1 * GB2 因H2O2易分解，測(cè)定前應(yīng)核定H2O2濃度。 = 2 * GB2 因標(biāo)本中的其他物質(zhì)會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響，故測(cè)定需要設(shè)定空白管。 = 3 * GB2 測(cè)定管中加樣完畢后應(yīng)立即

18、進(jìn)行比色測(cè)定，因此各樣品CAT活力應(yīng)分別測(cè)定。 = 4 * GB2 酶易失活，而且0.015mol/L H2O2在室溫中不穩(wěn)定，容易自動(dòng)分解，故最好在30min內(nèi)測(cè)定。 = 5 * GB2 選擇240nm波長(zhǎng)可以減輕標(biāo)本中其他物質(zhì)在紫外區(qū)的影響。 = 6 * GB2 本法測(cè)定延遲時(shí)間為0秒，操作誤差在10秒內(nèi)不至于影響結(jié)果。 = 7 * GB2 溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大，最好選定在20。 = 8 * GB2 pH值的變化對(duì)本法測(cè)定結(jié)果影響不大。1.6 考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量原理：考馬斯亮藍(lán)G-250是一種染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?。蛋白含量?-1000

19、g范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用比色法測(cè)定。步驟：預(yù)熱紫外分光光度計(jì)20min，調(diào)波長(zhǎng)至595nm，關(guān)閉氘燈，打開(kāi)鎢燈，A模式下調(diào)零。使用玻璃比色皿進(jìn)行測(cè)定1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6只試管，編號(hào)后，按表2加入試劑。表2 標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)曲線制作加樣表管號(hào)123456蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.20.40.60.81.0蒸餾水（ml）1.00.80.60.40.20考馬斯亮藍(lán)G-250 (ml)555555蛋白質(zhì)含量（g）020406080100搖勻，放置(fngzh)2min后在595nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定（比色應(yīng)在1h內(nèi)完成）。以牛血清蛋白含量（g）為橫

20、坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)曲線。2、樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定取兩只潔凈的試管，分別標(biāo)記為空白管和實(shí)驗(yàn)管，按表3加入試劑。表3 樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定加樣表試劑樣品管空白管樣 品（ml）0.1/蒸餾水（ml）0.91.0考馬斯亮藍(lán)G-250（ml）55搖勻，放置2min后在595nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，記錄吸光值。2 結(jié)果2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線所測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光值如表4：表4 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得的吸光值蛋白含量（g）吸光值00.624200.810401.013601.156801.3231001.490蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1：圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)曲線 由蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出

21、(d ch)求蛋白含量的線性方程：y = 0.0086 x + 0.6399，R2=0.9976，說(shuō)明(shumng)做出的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線符合要求?？捡R斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)需注意： = 1 * GB2 做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)多次測(cè)量，保證曲線兩點(diǎn)之間跨度不要太大。 = 2 * GB2 由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的R20.9;3如果測(cè)出的吸光度過(guò)大，可以對(duì)樣品進(jìn)行稀釋或者減少加樣量。2.2 鎘對(duì)蛤仔外套膜過(guò)氧化氫酶活力的影響鎘對(duì)蛤仔外套膜過(guò)氧化氫酶活力變化有明顯的影響，外套膜24h、48h、72h、96h酶活力的變化如圖2所示：從圖中可以看出：鎘對(duì)蛤仔外套膜過(guò)氧化氫酶活力影響的總體趨勢(shì)表現(xiàn)為24h-4

22、8h為興奮效應(yīng)，48h以后為抑制效應(yīng)。對(duì)照組過(guò)氧化氫酶活力在24h-48h之間隨時(shí)間逐漸升高，到48h時(shí)達(dá)峰值，表現(xiàn)為毒物興奮效應(yīng)，而后，從48h-96h過(guò)氧化氫酶活力開(kāi)始急劇降低，表現(xiàn)為毒物抑制作用。1/10濃度組過(guò)氧化氫酶活力在24h-48h之間隨時(shí)間逐漸升高，到48h時(shí)達(dá)峰值，表現(xiàn)為毒物興奮效應(yīng)，而后從48h-96h過(guò)氧化氫酶活力開(kāi)始降低，表現(xiàn)為毒物抑制作用。1/8濃度(nngd)組過(guò)氧化氫酶活力(hul)在24h-48h之間隨時(shí)間略有(l yu)升高，到48h時(shí)到達(dá)峰值，表現(xiàn)為毒物興奮效應(yīng)，而后從48h-96h過(guò)氧化氫酶活力開(kāi)始降低，表現(xiàn)為毒物抑制作用。1/4濃度組過(guò)氧化氫酶活力在24

23、h-48h之間隨時(shí)間略有升高，48h-72h升高迅速，到72h時(shí)到達(dá)峰值，表現(xiàn)為毒物興奮效應(yīng)，而后從72h-96h過(guò)氧化氫酶活力降低，表現(xiàn)為毒物抑制作用。1/2濃度組過(guò)氧化氫酶活力在24h-48h之間隨時(shí)間略有升高，到48h時(shí)到達(dá)峰值，表現(xiàn)為毒物興奮效應(yīng)，而后從48h-96h過(guò)氧化氫酶活力開(kāi)始降低，表現(xiàn)為毒物抑制作用。2.3 鎘對(duì)蛤仔鰓過(guò)氧化氫酶活力的影響鎘對(duì)蛤仔鰓過(guò)氧化氫酶活力變化有明顯的影響，鰓24h、48h、72h、96h酶活力的變化如圖3所示：從圖中可以看出：鎘對(duì)蛤仔鰓過(guò)氧化氫酶活力影響的總體趨勢(shì)表現(xiàn)為24h-48h為興奮效應(yīng)，48h以后為抑制效應(yīng)。對(duì)照組過(guò)氧化氫酶活力在24h-48h

24、之間隨時(shí)間逐漸升高，到48h時(shí)到達(dá)峰值，表現(xiàn)為毒物興奮效應(yīng)，而后，從48h-72h過(guò)氧化氫酶活力開(kāi)始降低，表現(xiàn)為毒物抑制作用，72h-96h過(guò)氧化氫酶活力基本保持不變。1/10濃度過(guò)氧化氫酶活力在24h-48h之間隨時(shí)間降低，表現(xiàn)為毒物抑制效應(yīng)，而后，從48h-96h過(guò)氧化氫酶活力開(kāi)始升高，表現(xiàn)為毒物興奮作用。1/8濃度(nngd)過(guò)氧化氫酶活力(hul)在24h-48h之間隨時(shí)間急劇升高，到48h時(shí)到達(dá)峰值(fn zh)，表現(xiàn)為毒物興奮效應(yīng)，而后，從48h-72h過(guò)氧化氫酶活力開(kāi)始降低，表現(xiàn)為毒物抑制作用，72h-96h過(guò)氧化氫酶活力開(kāi)始升高，表現(xiàn)為毒物興奮作用。1/4濃度過(guò)氧化氫酶活力在2

25、4h-48h之間隨時(shí)間逐漸升高，到48h時(shí)到達(dá)峰值，表現(xiàn)為毒物興奮效應(yīng)，而后，從48h-96h過(guò)氧化氫酶活力開(kāi)始降低，表現(xiàn)為毒物抑制作用。1/2濃度過(guò)氧化氫酶活力持續(xù)下降，表現(xiàn)為毒物抑制作用。本組數(shù)據(jù)表明，鰓過(guò)氧化氫酶活力在1/2濃度表現(xiàn)出了高濃度的持續(xù)抑制，表明鰓對(duì)于污染物的靈敏度大于外套膜。2.4 鎘對(duì)蛤仔消化盲囊過(guò)氧化氫酶活力的影響鎘對(duì)蛤仔消化盲囊過(guò)氧化氫酶活力變化有明顯的影響，消化盲囊24h、48h、72h、96h酶活力的變化如圖4所示：從圖中可以看出：鎘對(duì)蛤仔消化盲囊的過(guò)氧化氫酶活力影響的總體趨勢(shì)表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。照組過(guò)氧化氫酶活力在24h-48h之間隨時(shí)間逐漸升高，到48h時(shí)到達(dá)峰值

26、，表現(xiàn)為毒物興奮效應(yīng)，而后，從48h-96h過(guò)氧化氫酶活力開(kāi)始降低，表現(xiàn)為毒物抑制作用。1/10濃度過(guò)氧化氫酶活力在24h-48h之間隨時(shí)間逐漸降低，表現(xiàn)為毒物抑制效應(yīng)，而后，從48h-72h過(guò)氧化氫酶活力開(kāi)始升高，表現(xiàn)為毒物興奮作用，從72h-96h，過(guò)氧化氫酶活力又降低，表現(xiàn)為毒物抑制效應(yīng)。1/8濃度(nngd)過(guò)氧化氫酶活力(hul)在24h-48h之間隨時(shí)間(shjin)升高，到48h時(shí)到達(dá)峰值，表現(xiàn)為毒物興奮效應(yīng)，而后，從48h-72h過(guò)氧化氫酶活力開(kāi)始降低，表現(xiàn)為毒物抑制作用，在72h-96h之間隨時(shí)間逐漸升高，表現(xiàn)為毒物興奮效應(yīng)。1/4濃度過(guò)氧化氫酶活力在24h-48h之間隨時(shí)間

27、逐漸升高，到48h時(shí)到達(dá)峰值，表現(xiàn)為毒物興奮效應(yīng)，而后，從48h-96h過(guò)氧化氫酶活力開(kāi)始降低，表現(xiàn)為毒物抑制作用。1/2濃度過(guò)氧化氫酶活力從24h-96h逐漸降低，表現(xiàn)為毒物的抑制作用。本組數(shù)據(jù)表明，鰓過(guò)氧化氫酶活力至少在1/8濃度表現(xiàn)出了高濃度的持續(xù)抑制，表明消化盲囊對(duì)于污染物的靈敏度大于鰓。3 討論3.1 蛤仔過(guò)氧化氫酶活力的變化規(guī)律從時(shí)間關(guān)系上來(lái)看，在實(shí)際試驗(yàn)中鎘對(duì)蛤仔外套膜過(guò)氧化氫酶活力的影響總體趨勢(shì)是先升后降，即毒物對(duì)酶活力的影響是先誘導(dǎo)后抑制。實(shí)際試驗(yàn)中鎘對(duì)蛤仔鰓過(guò)氧化氫酶活力的影響總體趨勢(shì)變化情況比較復(fù)雜，對(duì)照組、1/4濃度和1/2濃度表現(xiàn)為先升后降趨勢(shì)，而1/10濃度表現(xiàn)為先

28、降后升趨勢(shì)，1/8濃度為先升后降再升趨勢(shì)。實(shí)際試驗(yàn)中鎘對(duì)蛤仔消化盲囊過(guò)氧化氫酶活力的影響總體趨勢(shì)變化情況也比較復(fù)雜，對(duì)照組、1/4濃度表現(xiàn)為先升后降趨勢(shì)，而1/10濃度表現(xiàn)為先降后升再降趨勢(shì)，1/8濃度為先升后降再升趨勢(shì)，1/2濃度表現(xiàn)為一直下降趨勢(shì)。總的來(lái)看，在接受重金屬鎘刺激后，對(duì)照組酶在48h達(dá)到最大活力，1/10濃度在48h-72h間達(dá)到最大酶活力，1/8濃度在48h達(dá)到最大酶活力，1/4濃度48h-72h間達(dá)到最大酶活力，1/2濃度在24h-48h間到達(dá)最大酶活力。從濃度關(guān)系來(lái)看，實(shí)際試驗(yàn)中1/4濃度的鎘對(duì)蛤仔外套膜過(guò)氧化氫酶活力的影響最大，1/8濃度的鎘對(duì)蛤仔鰓過(guò)氧化氫酶活力的影響

29、最大，1/2濃度的鎘對(duì)蛤仔消化盲囊過(guò)氧化氫酶活力的影響最大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鎘與蛤仔不同部位過(guò)氧化氫酶活力之間存在明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系和濃度-效應(yīng)關(guān)系，且蛤仔各器官靈敏度為 ：消化盲囊 鰓 外套膜。理論上當(dāng)蛤仔暴露于Cd2+溶液后,其過(guò)氧化氫酶活力會(huì)發(fā)生明顯變化，并且有一定的規(guī)律性，即剛開(kāi)始的一段時(shí)間過(guò)氧化氫酶活力會(huì)增加，而后活力降低，呈誘導(dǎo)效應(yīng)。并且各濃度組過(guò)氧化氫酶活力都應(yīng)該低于0濃度對(duì)照組，說(shuō)明Cd2+仍抑制了過(guò)氧化氫酶活力。但實(shí)際測(cè)得的各濃度的酶活力往往高于對(duì)照組，這與理論不符。不排除實(shí)驗(yàn)誤差的可能性，也存在蛤仔接受Cd2+刺激以后，身體產(chǎn)生大量H2O2，使得過(guò)氧化氫酶活力得以在短時(shí)間內(nèi)

30、提高，從而照成染毒組酶活力高于對(duì)照組的可能性。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的鎘對(duì)蛤仔過(guò)氧化氫酶活力的趨勢(shì)與劉曉玲等測(cè)得的中華絨螯蟹的過(guò)氧化氫酶活力相比較，外套膜和鰓的酶活力大致是一致的，均為先升高再下降。據(jù)劉曉玲等人研究，這種情況產(chǎn)生的原因是在Cd2+與動(dòng)物體結(jié)合以后，相當(dāng)部分Cd2+被肝胰腺內(nèi)的金屬硫蛋白(MT)結(jié)合降低了的毒性以及體內(nèi)產(chǎn)生了大量的H2O2造成的。而蛤仔消化盲囊過(guò)氧化氫酶活力呈持續(xù)下降趨勢(shì)，雖與中華絨螯蟹所得結(jié)論不符，但根據(jù)沈盎綠等人對(duì)黑鯛過(guò)氧化氫酶活力的研究得出的結(jié)論7，過(guò)氧化氫酶活力在高濃度的Cd2+影響下呈下降趨勢(shì)?？梢該?jù)此推斷：蛤仔消化盲囊對(duì)于Cd2+的敏感程度高于外套膜和鰓。3.2

31、 關(guān)于(guny)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)結(jié)果(ji gu)的影響3.2.1 紫外速率(sl)直接法的特點(diǎn)紫外速率直接法是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法。本法在240nm測(cè)定H202被過(guò)氧化氫酶催化分解時(shí)，吸光度的降低。由于過(guò)氧化氫酶催化H202的分解反應(yīng)在一定底物濃度范圍符合一級(jí)反應(yīng)，因此計(jì)算出速率常數(shù)，即代表過(guò)氧化氫酶活力。但是，本方法也存在例如H202易分解，需要每次測(cè)量前測(cè)定其吸光值等問(wèn)題，給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)一定的麻煩。另外，H202吸光度的變化會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果照成較大影響。3.2.2 測(cè)CAT活力的其他方法 = 1 * GB2 高錳酸鉀滴定法：過(guò)氧化氫酶（catalase）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過(guò)氧

32、化氫分解為水和分子氧，在此過(guò)程中起傳遞電子的作用，過(guò)氧化氫則既是氧化劑又是還原劑?？筛鶕?jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過(guò)量）的過(guò)氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的過(guò)氧化氫。即可求出消耗的H2O2的量。8 = 2 * GB2 碘量法：用碘量法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活力是常用的方法。過(guò)氧化氫酶能把過(guò)氧化氫分解為水和氧，其活力大小，以一定時(shí)間內(nèi)分解的過(guò)氧化氫量來(lái)表示。當(dāng)酶與底物(過(guò)氧化氫)反應(yīng)結(jié)束后，再用碘量法測(cè)未分解的過(guò)氧化氫量。以鉬酸銨作催化劑，使過(guò)氧化氫與碘化鉀反應(yīng)，放出游離碘，然后用硫代硫酸鈉滴定碘.根據(jù)空白和測(cè)定二者

33、滴定值之差，即可求出酶分解的過(guò)氧化氫量。8 = 3 * GB2 氧電極法：過(guò)氧化氫酶廣泛存在于植物的所有組織中，能將過(guò)氧化氫分解為氧和水，可使生物機(jī)體免受過(guò)氧化氫的毒害作用。測(cè)定過(guò)氧化氫酶的方法有測(cè)壓法、滴定法以及分光光度法等。用氧電極法測(cè)量放氧速度，方法靈敏而快速。放氧速度與過(guò)氧化氫酶活力成正比。9 = 4 * GB2 酶反應(yīng)熱效應(yīng)法：過(guò)氧化氫酶分解過(guò)氧化氫為H2O與O2并釋放能量。通過(guò)測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中釋放的熱量,并用換能器將熱量轉(zhuǎn)換為電壓值,用以表示酶活力大小,在完成標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作后,利用該儀器來(lái)檢測(cè)酶的活力。該法具有靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn),除溫度外,可排除其他因素的干擾。103.2.3

34、 Cd對(duì)其他(qt)水生生物CAT活力(hul)的影響(yngxing) = 1 * GB2 鎘對(duì)河蜆過(guò)氧化氫酶活力的影響：通過(guò)查閱文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)，鎘對(duì)河蜆過(guò)氧化氫酶的活力有明顯影響，50g/L及100g/L Cd作用24h使河蜆過(guò)氧化氫酶活力上升，但不顯著(p0.05)，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)以及質(zhì)量濃度的增加, Cd作用48 h對(duì)河蜆過(guò)氧化氫酶的活力產(chǎn)生了顯著的抑制(p0.05)。推測(cè)由于過(guò)氧化氫酶含有豐富的巰基,重金屬與酶的巰基或其它活力基團(tuán)相互作用,從而改變了酶的活力。結(jié)果表明, CAT活力的變化可以作為監(jiān)測(cè)金屬鎘污染的有效生物標(biāo)記11。 = 2 * GB2 鎘對(duì)牙鲆組織CAT活力的影響：據(jù)

35、文獻(xiàn)可知，當(dāng)鎘濃度設(shè)置參照牙鲆的亞致死濃度時(shí),在7天的蓄積試驗(yàn)中重金屬鎘對(duì)CAT酶活力影響與自然海水對(duì)照組比較均表現(xiàn)為對(duì)酶活力的誘導(dǎo)。鎘的這種誘導(dǎo)作用很強(qiáng)。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),CAT活力下降。當(dāng)重金屬Cd進(jìn)入生物細(xì)胞后,會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)大量活力氧包括超氧陰離子自由基(O-2)、氫過(guò)氧自由基(HO-2)、過(guò)氧化氫(H202)、羥基自由基(OH)以及單線態(tài)氧(O2-),從而對(duì)機(jī)體誘發(fā)多種損害,生物體內(nèi)存在抗氧化作用的酶防御系統(tǒng),如CAT等活力會(huì)降低,隨時(shí)間的增加,生物體對(duì)污染有所適應(yīng),細(xì)胞的應(yīng)激系統(tǒng)被激活,增強(qiáng)機(jī)體消除活力氧自由基的能力,表現(xiàn)為酶活力增加,即誘導(dǎo)效應(yīng) 12。 = 3 * GB2 鎘對(duì)鯽

36、魚肝臟中CAT活力的影響：根據(jù)實(shí)驗(yàn)得出，暴露于Cd2+溶液后,觀察到明顯的氧化應(yīng)激現(xiàn)象(P0.05)?？赡艿脑蚴荂d2+直接毒害了構(gòu)成CAT的特定蛋白質(zhì)的合成。在抗氧化防御系統(tǒng)中CAT的作用是分解清除細(xì)胞器中所產(chǎn)生的H2O213。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與鎘對(duì)鯽魚肝臟中CAT活力的影響不同，這可能是不同水生動(dòng)物對(duì)鎘的耐受性有差異。3.2.4 實(shí)驗(yàn)中的一些體會(huì)本次試驗(yàn)是我本科期間所進(jìn)行的時(shí)間最長(zhǎng)，操作最復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)，也是對(duì)我四年來(lái)所學(xué)的知識(shí)的綜合性考察和運(yùn)用。這次實(shí)驗(yàn)讓我收獲很大，主要有以下幾個(gè)方面：第一，團(tuán)隊(duì)協(xié)作對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的成功與否起著至關(guān)重要的作用，雖然測(cè)定階段的工作由個(gè)人獨(dú)立完成，但同學(xué)們一起進(jìn)行的前期

37、工作減輕了個(gè)人的工作量，在實(shí)驗(yàn)中和實(shí)驗(yàn)后與老師和同學(xué)的交流也讓我學(xué)到了很多知識(shí)。第二，只有通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟僮鞑拍塬@得正確的數(shù)據(jù)，在操作過(guò)程中，有幾組數(shù)據(jù)測(cè)得的酶幾乎沒(méi)有活力，后來(lái)發(fā)現(xiàn)是由于暴露在室溫下時(shí)間過(guò)長(zhǎng)所導(dǎo)致，雖然后來(lái)補(bǔ)充這些數(shù)據(jù)花費(fèi)了很多時(shí)間，但我更加嚴(yán)格要求了自己，使以后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到更好的保障。第三，實(shí)驗(yàn)需要有吃苦耐勞的精神。在預(yù)實(shí)驗(yàn)期間，換水和加藥品的時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格遵守，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所以每天無(wú)論天氣如何，一定要按時(shí)操作，并保質(zhì)保量。通過(guò)這次實(shí)驗(yàn)，讓我體會(huì)到了整天在實(shí)驗(yàn)室忙碌的感覺(jué)，為我下一步的學(xué)習(xí)打下了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1Coogan T P,Bare R M,Waalkes M P.Cadmium-induced DNA strand damage in cultured liver cells ; reduction in cadmium genotoxicity following zinc pretreatment,Toxicol Appl Pharmaco,1992,113 : 227-2332Shukla G S,Hussain T,Chandra S V.Possible role of regional superoxide dismbltase activity and lipid peroxi