氨基酸類型和綜合分析

1、1氨基酸類型和綜合分析2 苯丙酮尿癥（PKU）是一種常見的氨基酸代謝病，是由于苯丙氨酸（Phe）代謝途徑中的酶缺陷，使得苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)變成為酪氨酸，導(dǎo)致苯丙氨酸及其酮酸蓄積，并從尿中大量排出。 本病在遺傳性氨基酸代謝缺陷疾病中比較常見，其遺傳方式為常染色體隱性遺傳。臨床表現(xiàn)不均一，主要臨床特征為智力低下、精神神經(jīng)癥狀、濕疹、皮膚抓痕征及色素脫失和鼠氣味等、腦電圖異常。如果能得到早期診斷和早期治療，則前述臨床表現(xiàn)可不發(fā)生，智力正常，腦電圖異常也可得到恢復(fù)。苯丙酮尿癥（PKU）3病因: 苯丙氨酸是人體必需的氨基酸之一。正常人每日需要的攝入量約為200500毫克，其中1/3供合成蛋白，2/3則通過肝

2、細(xì)胞中苯丙氨酸羥化酶（PAH）的轉(zhuǎn)化為酪氨酸，以合成甲狀腺素、腎上腺素和黑色素等。苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸的過程中，除需PAH外，還必須有四氫生物蝶呤（BH4）作為輔酶參與?；蛲蛔冇锌赡茉斐上嚓P(guān)酶的活性缺陷，致使苯氨酸發(fā)生異常累積。治療:主要是飲食療法。開始治療的年齡愈小，效果愈好。苯丙酮尿癥（PKU）1. 氨基酸是一種小分子的兩性化合物，分子質(zhì)量在75200Da之間，其化學(xué)通式為R-CH(NH2)-COOH，在生物體內(nèi)出現(xiàn)的氨基酸都是L型，僅在少數(shù)微生物來源的多肽中出現(xiàn)D型氨基酸。2. 氨基酸分析技術(shù)的發(fā)展始于1820年，由Braconnot最早將甘氨酸從白明膠水解物中分離出來。3. 色譜技術(shù)

3、的引入為氨基酸分析打開了一扇新的大門。1941年，Martin等運(yùn)用色層法分析氨基酸，主要采用乙?；被嵩诠枘z柱上或?yàn)V紙上半定量；隨后，Moore、Stein應(yīng)用離子交換柱直接分離游離的氨基酸，在1958年，Spackman、Stein、Moore制造了自動(dòng)化的氨基酸分析儀，使氨基酸定量分析進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段，至今仍是經(jīng)典的方法。氨基酸分析組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸除甘氨酸外、都有一個(gè)不對(duì)稱碳原子，即-碳原子。-碳原子有四個(gè)不同取代基：羧基、氨基、氫原子和R基團(tuán)，不同氨基酸的R基團(tuán)不同。每種氨基酸有D-構(gòu)型和L-構(gòu)型，蛋白質(zhì)中的氨基酸都是L-構(gòu)型。RHCCOOH_NH2_氨基酸的基本結(jié)構(gòu)及性

4、質(zhì)6 氨基酸的基本結(jié)構(gòu)及性質(zhì)氨基酸是分子中含有氨基和羧基的一類化合物。組成蛋白質(zhì)的氨基酸只有二十種。其中有八種為人體必需氨基酸。人體必需的氨基酸：人體內(nèi)不能合成，只有靠食物供給的氨基酸。各種蛋白質(zhì)含氨基酸的種類和數(shù)量都各不相同。7中文名稱英文名稱三字母縮寫單字母縮寫分子量等電點(diǎn)甘氨酸GlycineGlyG75.076.06丙氨酸AlanineAlaA89.096.11纈氨酸ValineValV117.156.00亮氨酸LeucineLeuL131.176.01異亮氨酸IsoleucineIleI131.176.05苯丙氨酸PhenylalaninePheF165.195.49色氨酸Trypto

5、phanTrpW204.235.89酪氨酸TyrosineTyrY181.195.64天冬氨酸Aspartic acidAspD133.102.85組氨酸HistidineHisH155.167.60天冬酰胺AsparagineAsnN132.125.41谷氨酸Glutamic acidGluE147.133.15賴氨酸LysineLysK146.199.60谷氨酰胺GlutamineGlnQ146.155.65甲硫氨酸MethionineMetM149.215.74精氨酸ArginineArgR174.2010.76絲氨酸SerineSerS105.095.68蘇氨酸ThreonineThr

6、T119.125.60半胱氨酸CysteineCysC121.165.05脯氨酸ProlineProP115.136.3020種氨基酸的中英文名稱及縮寫 人體必需氨基酸賴氨酸 H2N(CH2)4CHCOOH纈氨酸 CH3CHCHCOOH蛋氨酸CH3SCH2CHCOOH蘇氨酸 CH3CHCHCOOH亮氨酸CH3CHCH2CHCOOH苯丙氨酸 CH2CHCOOH異亮氨酸CH3CH2CHCHCOOH色氨酸 CH2CHCOOH2、幾種常見的氨基酸 名稱俗稱結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式氨基乙酸-氨基丙酸 -氨基-苯基丙酸 -氨基戊二酸 甘氨酸 丙氨酸 谷氨酸 苯丙氨酸 10氨基酸的分類1、根據(jù)氨基酸的酸堿性酸性氨基酸堿性氨

7、基酸中性氨基酸氨基酸11酸性氨基酸二個(gè)羧基一個(gè)氨基天冬氨酸谷氨酸堿性氨基酸一個(gè)羧基二個(gè)或二個(gè)以上氨基賴氨酸精氨酸組氨酸中性氨基酸一個(gè)羧基一個(gè)氨基實(shí)際水溶液呈弱酸性： 電離能力 COOH NH2122、根據(jù)氨基酸的化學(xué)特性疏水性：Ala Val Leu Ile Phe Pro Met帶電：Arg Lys Asp Glu (His)極性：Ser Thr Cys Asn Gln His Tyr Trp特殊：Gly (Pro)氨基酸的分類13帶電氨基酸14極性氨基酸15氨基酸的立體化學(xué) 由蛋白質(zhì)水解的氨基酸都為-氨基酸，除甘氨酸外，所有- C都為手性碳原子。 天然的氨基酸均為L(zhǎng)-氨基酸16-CDEP修

8、飾的Fe3O4磁微球用于手性化合拆分圖3.9 不同功能化磁微球作用DL-色氨酸后毛細(xì)管電泳分離圖 (A) 以及相對(duì)應(yīng)的峰面積圖(B)，(a) 0 , (b) 100, (c) 200, (d) 300 mg17氨基酸的理化性質(zhì)1. 溶解度2. 熔點(diǎn):高3. 旋光性有旋光性4. 味感：D-氨基酸大多帶甜味，L-氨基酸有苦、甜、鮮、酸等四種不同味感。1. 兩性性質(zhì)：氨基酸分子中含有氨基及羧基，使其既能象酸又能象堿一樣解離；2. 與甲醛作用：3. 與2,4-二硝基氟苯作用：4. 與茚三酮的作用：5. 與異硫酸苯酯的作用：6. 與熒光胺的作用：7. 與5,5-雙硫基-雙(硝基苯甲酸)反應(yīng)18等電點(diǎn)概念

9、：將氨基酸水溶液的酸堿度加以適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)，使氨基酸的酸性電離程度與堿性電離程度相等。此時(shí)，氨基酸帶有的正電荷數(shù)目和負(fù)電荷數(shù)目相等，此溶液的pH值稱為氨基酸的等電點(diǎn)，用 pI 表示。在等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸的溶解度最小，易沉淀等電點(diǎn)可用酸堿滴定方法測(cè)定，也可通過pK值計(jì)算側(cè)鏈無解離基團(tuán)時(shí)：pI=(pK1+pK2)/2側(cè)鏈有解離基團(tuán)時(shí), pI相當(dāng)于氨基酸的兩性離子狀態(tài)兩側(cè)的基團(tuán)pK值和的一半19pH = pI凈電荷為零在電場(chǎng)中不移動(dòng)pH pI帶負(fù)電荷等電點(diǎn)要使氨基酸達(dá)到等電狀態(tài)：中性氨基酸： pI pH 7 加少量酸酸性氨基酸： pI pH 7 加堿20與茚三酮的顯色反應(yīng)水合茚三酮CO221藍(lán)紫色化合物

10、根據(jù)CO2的量或藍(lán)紫色的深淺程度 作為-氨基酸定量分析的依據(jù)。與茚三酮的顯色反應(yīng)22氨基酸的斑點(diǎn)分析 大多數(shù)氨基酸不含有特征發(fā)色基團(tuán)。因此，氨基酸的分析依賴于衍生化反應(yīng)。對(duì)衍生化試劑的要求是反應(yīng)快，并且 產(chǎn)物與試劑本身的光譜性質(zhì)有明顯的差異。常用的衍生化試劑有2，4-二硝基氟 苯、熒光胺及鄰苯二甲醛等。根據(jù)產(chǎn)物性質(zhì)的不同，衍生化試劑可分為顯色劑及熒光衍生化試劑兩大類。23斑點(diǎn)顯色分析法 茚三酮是氨基酸的斑點(diǎn)顯色分析中非常簡(jiǎn)單的衍生化試劑。 它可以與一級(jí)和二級(jí)胺在酸性介質(zhì)中pH（34）加熱反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生氨、二氧化碳和藍(lán)-紫色的絡(luò)合物。一級(jí)和二級(jí)胺的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為570和440nm。若二者同時(shí)存在

11、，一般在500 nm處測(cè)定，靈敏度有所降低。24另一種常用的顯色反應(yīng)試劑是2，4-二硝基氟苯，它可以與樣品中氨基酸及一級(jí)和二級(jí)胺反應(yīng)，生成黃色絡(luò)合物，檢測(cè)波長(zhǎng)在420nm。該法測(cè)定的是氨基酸的總量。斑點(diǎn)顯色分析法25斑點(diǎn)熒光分析法熒光胺是用于氨基酸分析的高靈敏熒光衍 生化試劑，可用于氨基酸的表面分析，如 薄層色譜。鄰苯二甲醛（OPA）是用于氨基酸熒光分 析的另一種常見的衍生化試劑。26色譜方法測(cè)定氨基酸離子交換色譜法反相色譜分析法液相色譜-質(zhì)譜法毛細(xì)管電泳法氣相色譜法27離子交換色譜法離子交換色譜的基本原理是基于帶電荷的陰陽離 子與帶相反電荷的離子交換基團(tuán)的相互作用。氨基酸、肽和蛋白質(zhì)在溶液中

12、帶電荷，可與離子 交換基團(tuán)產(chǎn)生靜電作用而保留。其固定相應(yīng)具有分離效能高、物化性質(zhì)穩(wěn)定、柱 容量大、分辨率高、能快速保持生物分子活性和 構(gòu)象完好。28陽離子交換樹脂：強(qiáng)酸型磺酸化的 聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。陰離子交換樹脂：只有在特殊情況下 用于強(qiáng)酸性氨基酸的分析。離子交換色譜法291、直接檢測(cè)法 離子交換色譜法用于氨基酸分析時(shí)，可在200nm處對(duì)各種氨基酸進(jìn)行直接檢測(cè)，檢出限在110 pmol之間。30（1）選擇性差：生物樣品中多種內(nèi)源 性成分在200 nm處均有吸收；（2）背景高：HPIC常用的各種溶劑在 200 nm處也有吸收。直接檢測(cè)的缺點(diǎn)312、柱后衍生化法衍生化是將氨基酸衍生為有利

13、于測(cè)定或分離的化合物。大多數(shù)氨基酸不含有芳香環(huán)等生色團(tuán)，無法直接用紫外法檢測(cè)，需要先將氨基酸衍生為具有較強(qiáng)紫外或熒光吸收的衍生物。為了提高靈敏度及選擇性，一般采用柱后衍生化，再用紫外或熒光法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。常用衍生化試劑：茚三酮、鄰苯二甲醛、熒光胺。32柱后衍生化法的優(yōu)點(diǎn)1、幾乎不需要樣品處理步驟，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可以直接進(jìn)樣分析；2、反應(yīng)產(chǎn)物與副產(chǎn)物的混合物無需分離；3、離子色譜柱的穩(wěn)定性高，因而樣品間的重現(xiàn)性好；4、反應(yīng)無需完成，產(chǎn)物也可以是多種。只要混合時(shí)間及反應(yīng)產(chǎn)物的比例是一定的，則分析的重現(xiàn)性就不會(huì)受到影響。5、對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性要求低，因?yàn)榉磻?yīng)及檢測(cè)幾乎是同時(shí)進(jìn)行的。33氨基酸分析儀

14、 原理：采用經(jīng)典的陽離子交換色譜分離、茚三酮柱后衍生法，對(duì)蛋白質(zhì)水解液及各種游離氨基酸的組分含量進(jìn)行分析。 兩種系統(tǒng)：蛋白水解分析系統(tǒng)（鈉鹽系統(tǒng)）和游離氨基酸分析系統(tǒng)（鋰鹽系統(tǒng)），利用不同濃度和pH值的檸檬酸鈉或檸檬酸鋰進(jìn)行梯度洗脫。鈉鹽系統(tǒng)一次最多分析約25種氨基酸；鋰鹽系統(tǒng)一次最多分析約50種氨基酸。 分析效果：靈敏度（最低檢測(cè)限）比HPLC柱前衍生方法稍低以外（HPLC：；氨基酸分析儀：10pmol)，其他如分離度、重現(xiàn)性、操作簡(jiǎn)便性、運(yùn)行成本等方面，都優(yōu)于其他分析方法。35氨基酸分析儀日立7180全自動(dòng)生化儀樣品的制備（一）蛋白質(zhì)的水解（二）游離氨基酸樣品的制備（三）生理體液樣品的前處

15、理（一）蛋白質(zhì)的水解 用于全氨基酸測(cè)定的樣品，凡是以蛋白質(zhì)形式存在的都要進(jìn)行水解處理，水解方法有三種：1、酸水解法：標(biāo)準(zhǔn)水解法，水解徹底，但色氨酸被破壞。2、堿水解法：用NaOH作為水解劑，色氨酸不被破壞，但有消旋作用，絲氨酸、蘇氨酸等被破壞。3、酶水解法：水解條件溫和，無需特殊設(shè)備，氨基酸不受破環(huán)，但水解時(shí)間長(zhǎng)，而且不易水解完全。（二）游離氨基酸樣品的制備 游離氨基酸的樣品在分析前必需進(jìn)行磨碎、脫脂、提取、脫鹽、去蛋白、脫色等處理。在進(jìn)行分析前建議使用C18小柱處理一下。（三）生理體液樣品的處理 生理體液的樣品首先要除去樣品中的蛋白質(zhì)，獲得游離氨基酸。除去蛋白質(zhì)化學(xué)方法為： 1、苦味酸法 2

16、、三氯乙酸法 3、乙醇沉淀法 4、磺基水楊酸法（常用的方法）41反相色譜分析法反相色譜法是以表面非極性載體為固定 相，以極性溶劑為流動(dòng)相的一種液相色譜分離模式。反相色譜分析法的效率比離子色譜法高；用于氨基酸分析一般采用柱前衍生化。衍生化不僅可以提高氨基酸被檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度，而且可以提高氨基酸的疏水性，從而可以用反相色譜法進(jìn)行分離。42HPLC法測(cè)定復(fù)合氨基酸膠囊中氨基酸的含量43HPLC法測(cè)定復(fù)合氨基酸膠囊中氨基酸的含量4445HPLC-蒸發(fā)光散射法46反相高效液相色譜法與離子交換色譜法測(cè)定氨基酸對(duì)比47反相高效液相色譜法與離子交換色譜法測(cè)定氨基酸對(duì)比48反相高效液相色譜法與離子交換色譜法測(cè)定氨

17、基酸對(duì)比49液質(zhì)聯(lián)用法大多數(shù)氨基酸本身不具有紫外吸收, 也不發(fā)射熒光, 不能直接檢測(cè)； 傳統(tǒng)的氨基酸分析方法為離子交換色譜法, 該方法操作繁瑣, 成本高;目前多用反相高效液相色譜法, 分析周期至少需要半小時(shí)以上, 后來發(fā)展起來高效毛細(xì)管電泳法。 雖然有較大改進(jìn), 但仍需要采用化學(xué)衍生技術(shù)及梯度洗脫以提高其分離、檢測(cè)性能, 衍生化的缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且損害準(zhǔn)確性, 而且 完全依靠保留時(shí)間來定性, 準(zhǔn)確度不高；LC -MS聯(lián)用技術(shù)利用三級(jí)四極質(zhì)譜儀的分離和定性能力, 提供了可靠的、精確的相對(duì)分子量和結(jié)構(gòu)信息, 顯著提高了準(zhǔn)確度、靈敏度, 操作非常簡(jiǎn)單 , 節(jié)省了樣品準(zhǔn)備時(shí)間和分析時(shí)間。50液質(zhì)聯(lián)用法

18、51液相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析18種游離氨基酸5253毛細(xì)管電泳具有微量、靈敏和柱效高的 特點(diǎn)，適合于氨基酸手性分離和復(fù)雜樣 品中的氨基酸分析。用于氨基酸分析的毛細(xì)管電泳主要采用 兩種分離模式：毛細(xì)管區(qū)帶電泳和膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳。檢測(cè)方式主要有紫外法和熒光法。毛細(xì)管電泳法54毛細(xì)管電泳法可以進(jìn)行柱前、柱內(nèi)和柱后衍生化。柱內(nèi)衍生化要求反應(yīng)速度快，一般采用串聯(lián)或 “夾心餅”兩種形式，具有試劑和樣品用量少的 優(yōu)點(diǎn)。柱后衍生化可以避免柱前或柱內(nèi)衍生化時(shí)其他 化合物對(duì)衍生反應(yīng)的干擾，缺點(diǎn)是柱后反應(yīng)裝 置體積大，會(huì)引起色譜峰變寬而降低分離效果。毛細(xì)管電泳法55毛細(xì)管電泳法快速測(cè)定血清中游離氨基酸56毛細(xì)管電泳法快速測(cè)定血清中游離氨基酸57毛細(xì)管電泳法快速測(cè)定血清中游離氨基酸58氣相色譜法氣相色譜法分析氨基酸具有分離時(shí)間短、 柱效高、容易和質(zhì)譜聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)。氨基酸含有羧基、羥基、氨基和硫基等極 性基團(tuán)，需要先對(duì)其衍生化。59兩步法是先將羧基用短碳鏈脂肪醇酯化， 然后再用各種酸酐將N-（O、S）基團(tuán)乙酰 化。一步法是用烴基氯甲酰酯在水、醇類和吡 啶介質(zhì)中將氨基酸一步衍生化生成烴基碳 氧酰烴基酯。衍生化方法60氨基酸選擇性反應(yīng)的分析方法1、顯