HIV檢測技術-PPT課件

1、HIV檢測技術艾滋病實驗診斷技術 HIV抗體測定 抗原測定 核酸測定 病毒分離 CD4淋巴細胞計數(shù)急性期潛伏期窗口期HIV感染以后的血清學動態(tài)Anti-P24Anti-gp41/120(anti-gp36)HIV RNAAnti-Ag感染 1周 2周 3周 4周.1年 2年 3年.10年.艾滋病期Anti-Ab濃度 HIV抗體檢測的目的和要點 HIV抗體檢測可用于診斷、血液篩查、監(jiān)測等。以診斷為目的的檢測是為了確定個體HIV感染狀況，包括臨床檢測、自愿咨詢檢測、根據(jù)特殊需要進行的體檢等。以血液篩查為目的的檢測是為了防止輸血傳播HIV，包括獻血員篩查和原料血漿篩查。以監(jiān)測為目的的檢測是為了解不同

2、人群HIV感染率及其變化趨勢，包括各類高危人群、重點人群和一般人群。初篩實驗室設備條件獨立實驗室用房，建筑設備和儀器要符合要求II級生物安全實驗室酶標儀，洗板機，精確移夜管，專用冰箱，離心機，水浴箱，溫箱等消毒和污染處理設施安全防護設施艾滋病檢測方法的意義HIV抗體篩查檢測 HIV/AIDS的篩查，但初篩陽性結(jié)果不能做為艾滋病診斷依據(jù)，需將該標本送確證實驗室進行確證。HIV抗體確認檢測（免疫印跡試驗） HIV/AIDS診斷的唯一依據(jù) 艾滋病確認實驗室負責HIV核酸檢測輔助診斷：在特殊情況下，如出現(xiàn)某些非典型的抗體反應，特別是不確定反應時，RNA的測定可提供有用的證據(jù)。感染早期：在HIV感染的窗

3、口期，無法使用抗體檢測進行診斷，此時RNA的測定具有特殊的意義，提示是否有感染的可能，但仍需追蹤檢測HIV抗體，最終根據(jù)抗體的檢測情況做出診斷。病程監(jiān)控：幫助確定疾病發(fā)展的階段。指導治療方案及療效測定。預測疾病進程 ?？贵w檢測 根據(jù)檢測HIV感染后產(chǎn)生的HIV抗體的間接指標而 發(fā)展起來的血清學診斷技術，分為初篩試驗和確認試 驗。 初篩試驗 用于對檢測對象感染情況的初步篩查，檢測結(jié)果可能會有假陽性，不能發(fā)抗體陽性報告確認試驗 確定檢測對象是否有HIV抗體，可發(fā)抗體陽性報告 酶聯(lián)免疫試驗 ( ELISA )最早用于檢測血清中HIV抗體的有效篩檢方法很高的敏感性和特異性根據(jù)檢測方法，可分成4類間接法

4、、雙抗原夾心法、競爭法和捕獲法 HIV抗體檢測試劑根據(jù)其抗原的來源和檢測方式可分為四代 篩查試驗篩查試劑經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準在試劑有效期內(nèi)酶聯(lián)免疫試劑應批批檢合格臨床質(zhì)量評估敏感性和特異性高第一代ELISA試劑包被抗原：全病毒裂解抗原窗口期：6-8星期優(yōu)點：靈敏度高，可檢出各種抗體缺點：制備麻煩，成本高，假陽性1985年，F(xiàn)DA批準第一個HIV抗體篩選試劑第二代ELISA試劑包被抗原：重組抗原、合成多肽 窗口期：4-5星期優(yōu)點：重組抗原可消除HLA（人類白細胞抗原）所致的抗體假陽性，生產(chǎn)成本低，不使用HIV病毒顆粒，較為安全，敏感性特異性較高缺點：仍有一定的假陽性1990年，F(xiàn)DA

5、批準第一個重組抗原篩選試劑第三代ELISA試劑包被抗原：重組抗原加合成多肽合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高窗口期：3星期左右優(yōu)點：可檢測所有不同種類的抗體，增加了試劑的敏感性和特異性1994年發(fā)展了雙抗原夾心法，酶標物由抗人IgG改變?yōu)樘禺愋訦IV抗原第四代ELISA試劑包被物：重組或多肽抗原+重組抗體窗口期：2星期左右優(yōu)點：同時檢測HIV抗原抗體，縮短窗 口期注意：抗原檢測敏感性低于單獨抗原試 劑(5070pg/ml,510pg/ml)2019年第四代試劑首次上市HIV抗體試劑盒進展代次抗原方法檢測時間1全病毒間接 2個月2

6、 重組或多肽 間接3-4 周3 重組+多肽夾心2-3 周4抗原+抗體夾心2周左右Closing the window4th gen3rd gen= =1st-2nd genHIV antigenIgM abIgG abDetection limit1ng/ml水平上,因此要盡量避免標本間的污染。標本在保存中如出現(xiàn)細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉淀后取上清檢測。ELISA試驗中可能出現(xiàn)的問題及原因分析問題可能的原因（非試劑盒本身的原因） 弱陽性質(zhì)控樣本檢測不出 溫育的時間或溫度不夠；顯色反應時間太短； 測定的重復性差（相同樣本兩次測定結(jié)果不一致） （1）加樣本及試劑量不準；孔間不一致；（2

7、）加樣過快，孔間發(fā)生污染；（3）加錯樣本；（4）加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區(qū)；（5）不同批號試劑盒中組分混用；（6）溫育時間、洗板、顯色時間不一致；（7）孔內(nèi)污染雜物；（8）酶標儀濾光片不正確；（9）血清標本未完全凝固即加入，反應孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細胞，易出現(xiàn)假陽性反應等。 問題可能的原因（非試劑盒本身的原因） 白板（陽性對照不顯色） （1）漏加酶結(jié)合物；（2）洗板液配制中出現(xiàn)問題，如量筒不干凈，含酶抑制物（如疊氮鈉）等。（3）漏加顯色劑A或B；（4）終止劑當顯色劑使用。 全部板孔均有顯色 （1）洗板不干凈；（2）顯色液變質(zhì)；（3）加底物的吸尖受酶或金屬離子污染；（4）洗板液

8、受酶等污染。（5）由于儀器或加樣頭造成的交叉污染。 化學發(fā)光或免疫熒光試驗這類試劑采用發(fā)光或熒光底物，既可檢測抗體，也可聯(lián)合檢測抗原抗體。原理：HIV抗原或抗體包被于固相載體，加入待檢樣品和酶或熒光標記的HIV抗原或抗體，加發(fā)光或熒光底物，用發(fā)光或熒光儀測定結(jié)果。有效試驗的陰性和陽性對照必須符合試劑盒規(guī)定?？焖贆z測（RT）及其它檢測試驗這類試驗簡便快速，適用于應急檢測、門診急診檢測。一般可在1030分鐘內(nèi)得出結(jié)果。 明膠顆粒凝集試驗（PA）：原理：將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢樣品作用。當待檢樣品含有HIV抗體時，明膠顆粒與抗體發(fā)生凝集反應，根據(jù)凝集情況判讀結(jié)果。PA試劑有兩種:同時

9、檢測HIV-1和HIV-2抗體以及分別檢測HIV-1和HIV-2抗體。有效試驗必須有陰性和陽性質(zhì)控。凝集實驗常用的載體：紅細胞、聚苯乙烯乳膠顆粒、明膠顆粒、活性碳或硅膠鋁顆粒前滯現(xiàn)象：反應中抗體含量過多，影響抗原抗體的理想結(jié)合，大量抗體結(jié)合于抗原阻礙了交叉聯(lián)結(jié)符合體的形成，使肉眼觀察不到凝集現(xiàn)象，造成假陰性。解決辦法：稀釋樣品凝集試驗注意事項試驗應設對照，特別是未包被抗原的載體對照，以防止非特異載體凝集反應的干擾乳膠試劑對于凍融過的血清假陽性率高，對于新鮮血清沒有這種現(xiàn)象。乳膠試劑切忌凍結(jié)，凍結(jié)后易發(fā)生自凝結(jié)果判讀要及時，避免假陽性HIV抗體檢測（明膠顆粒凝集試驗）材料 血清標本 , U型板

10、, PA試劑盒(“A”溶解用液,”B”血清稀釋液,”C”致敏顆粒,”D”非致敏顆粒,陽性對照血清,專用滴管.方法 (1)從4冰箱取出試劑盒,恢復至室溫后使用. (2)從1:4開始做倍比稀釋. (3)用專用滴管,第二孔加1滴(25ul)非致敏顆?！盌”,第三孔加1滴(25ul)致敏顆?！盋”. (4)輕輕拍打微量板或在振蕩器上振蕩1分鐘混合后,室溫(20)靜置2小時后觀察結(jié)果.HIV抗體檢測（明膠顆粒凝集試驗）結(jié)果判斷 明膠顆粒沉積在孔底,周邊平滑,或形成致密圓圈者為陰性結(jié)果.(-) 明膠顆粒沉積在孔底,中央形成致密小環(huán),周邊平滑為可疑反應.(+_) 孔內(nèi)有清晰的寬環(huán)且外緣粗糙者,為陽性結(jié)果.(

11、+/+) 孔內(nèi)凝聚顆粒形成均一的膜覆蓋在整個孔底者為強陽性反應.(+/+) 孔內(nèi)樣品與致敏和非致敏顆粒均產(chǎn)生凝集者,則需作重吸收試驗后進一步檢測. 免疫滲濾試驗：斑點ELISA和斑點免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗原理：均以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原點狀固定在膜上，加待檢樣品。陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點。反應時間在10分鐘以內(nèi)。有效試驗的質(zhì)控點必須顯色。 免疫層析試驗原理：以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原線狀固定在膜上，待檢樣品（血液或唾液）沿著固相載體遷移，陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效試驗的質(zhì)控帶必須顯色。ELISA試劑（13種） 麗珠、生物梅里埃、萬泰、MUREX、綠

12、科、永華、金豪、科華、新創(chuàng)、普生、中山、華美、吉比愛快速試劑（7種） 科華、新創(chuàng)、PA、雅培、EY、艾康、萬泰抗體初篩試驗的局限性陽性結(jié)果不能確認，需用其他試劑復查陰性結(jié)果不能排除HIV感染：在感染早期，血清陽轉(zhuǎn)前存在“窗口期”，在感染晚期，某些抗體可能檢測不到（如p24抗體）。反應中抗體過量，抗原抗體比例不合適而不能形成特定結(jié)購，出現(xiàn)凝集抑制。不能診斷18月齡嬰兒的母嬰垂直感染新出現(xiàn)的亞群難以檢測HIV抗體初篩檢測結(jié)果解釋如何判斷嬰兒是否感染了HIV？感染了HIV的母親所生的嬰兒可能通過胎盤帶有來自母體的HIV的IgG抗體，此時HIV抗體檢測陽性并不意味著已被感染。建議在嬰兒9個月時進行HI

13、V初篩檢測 如陰性，則判定為未感染HIV。 如陽性，則應在嬰兒18個月時進行復檢 陰性：判定為未感染。 陽性：則將血樣送至確證實驗室進行HIV抗體的確認試驗。 確認試驗的試劑 必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準、在有效期內(nèi)的試劑。 確認試驗方法 包括免疫印跡試驗（WB）、條帶免疫試驗（LIATEK HIV）、放射免疫沉淀試驗（RIPA）及免疫熒光試驗（IFA）。 國內(nèi)常用的確認試驗方法是WB。HIV抗體確認試驗 確認檢測流程 先用HIV-1/2混合型試劑進行檢測，如果呈陰性反應，則報告HIV抗體陰性；如果呈陽性反應，則報告HIV-1抗體陽性；如果不滿足陽性標準，則判為HIV抗體檢測結(jié)果不確

14、定。 如果出現(xiàn)HIV-2型的特異性指示條帶，需用HIV-2型免疫印跡試劑再做HIV-2的抗體確認試驗，呈陰性反應，報告HIV-2抗體陰性；呈陽性反應則報告HIV-2抗體血清學陽性,并將樣品送國家參比實驗室進行核酸序列分析。艾滋病實驗室診斷確認試驗(蛋白印跡Western-Blot)原理 病毒裂解物抗原經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離,然后將分離后的抗原轉(zhuǎn)移(印跡)到硝酸纖維薄膜上,采用類似ELISA的技術, 當樣品中含有HIV抗體時,它和印跡在硝酸纖維薄膜上的病毒抗原相結(jié)合呈現(xiàn)肉眼可見的特異性帶型. HIV-1抗體特異帶包括：env帶 gp160/gp120、gp41；gag帶 p5

15、5、p24、p17（或p18）； pol帶 p66（或p65）、p51、p31。 HIV-2抗體特異條帶包括：env帶 gp140/gp105、gp36；gag帶 p56、p26、p16；pol帶 p68、p53、p34。（由于使用的毒株不同，HIV-2 env帶也可為gp125/gp80、gp36）。WB原理 確認試驗結(jié)果的判定下面是我國使用WB確認HIV感染的判定標準和判定結(jié)果的基本原則。在實際工作中還應參照所用試劑盒說明書綜合判定，遇疑難情況應報上級實驗室解決。 & HIV-1抗體陽性（+） 至少有2條env帶（gp41和gp160/gp120）出現(xiàn)，或至少1條env帶和p24帶同時出現(xiàn)。 & HIV-2抗體陽性（+） 同時符合以下2條標準可判為HIV-2抗體血清學陽性：（1）符合WHO陽性判定標準，即出現(xiàn)至少2條env帶（gp36和gp140/ gp105）。（2）符合試劑盒提供的陽性判定標準。 & HIV抗體陰性（-） 無HIV抗體特異帶出現(xiàn)。 & HIV抗體不確定（） 出現(xiàn)HIV抗體特異帶，但不足以判定陽性。HIV抗體WB實驗的陽性判斷標準 1 3 2 4GP160GP120 P66 P55 P51 GP41 P31 P24 P17 血清對照 P39 HIV-2特異帶W