細胞死亡檢測和生物學(xué)意義

1、細胞死亡檢測和生物學(xué)意義概述細胞死亡是生命體的重要生命活動之一；細胞的死亡與新生之間的動態(tài)平衡對于維持組織和器官的正常功能、保持機體內(nèi)環(huán)境平衡和穩(wěn)定具有重要作用；細胞死亡調(diào)控的異常可導(dǎo)致腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病等多種疾病的發(fā)生。概述根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，三種重要的細胞死亡方式：apoptosis/凋亡autophagic cell death/自噬性細胞死亡necrosis/壞死The Nomenclature Committee on Cell Death (NCCD)Cell Death and Differentiation (2009) 16, 311細胞凋亡Apoptosis細

2、胞凋亡概念的形成1972年Kerr和Wyllie正式提出細胞凋亡 （apoptosis） 的概念 apoptosis源于希臘語，apo意為from， ptosis意為fall，用于描述花兒凋謝、樹葉落下的自然景色。這里用來描述以染色質(zhì)凝聚、核固縮、細胞皺縮、細胞膜發(fā)泡等為特征的細胞死亡。 (Br J Cancer. 26: 239257, 1972)細胞凋亡概念的形成細胞凋亡深入到基因水平的研究起始于秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）Sydney Brenner, John E. Sulston系統(tǒng)研究了線蟲整個發(fā)育過程中的細胞分裂和分化，于1998年完成了線蟲的基因

3、組測序工作。1970-1980年間，美國科學(xué)家Robert H. Horvitz 研究了線蟲細胞凋亡過程中的基因調(diào)控機制。三位科學(xué)家獲得2002年生理和醫(yī)學(xué)諾貝爾獎。羅伯特-霍維茨 悉尼-布雷內(nèi) 約翰-蘇爾斯頓細胞凋亡的概念細胞在凋亡因子的刺激下發(fā)生的一種由基因調(diào)控的、主動的程序性死亡；具有獨特的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征一、細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征1. 凋亡的起始階段： 細胞變圓,偽足收縮； 細胞質(zhì)、細胞核體積縮?。ü炭s）； 細胞器多無明顯變化 核染色質(zhì)密度增高,凝聚在核膜周邊（邊緣化），呈新月形。一、細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征2. 凋亡小體的形成：核仁裂解，核染色質(zhì)斷裂，細胞膜內(nèi)陷將細胞進行分割;細胞表面

4、產(chǎn)生許多泡狀或芽狀突起;形成單個的凋亡小體（apoptotic body）。一、細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征3. 凋亡小體被鄰近的細胞吞噬并消化NATURE CELL BIOLOGY | VOL 2 | JUNE 2000,E1042 細胞呈現(xiàn)沸騰運動，細胞膜發(fā)泡3 凋亡小體 形成5 單核巨噬細胞吞噬1 細胞體積變小，染色質(zhì)凝集，周邊化，呈新月形4 上皮細胞吞噬 一、細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征細胞壞死的形態(tài)學(xué)特征 膜通透性增加；細胞質(zhì)、細胞器腫脹（線粒體腫脹）；溶酶體破壞；細胞膜破裂；核染色質(zhì)不規(guī)則位移； 引起嚴重的炎癥反應(yīng)； 成群細胞丟失； 最終被巨噬細胞吞噬。 細 胞 凋 亡 細 胞 壞 死1.單個細胞

5、丟失 細胞成群丟失2.細胞膜發(fā)泡但仍完整 細胞膜不完整3.細胞膜內(nèi)陷將細胞 細胞腫脹、溶解 分割成凋亡小體 4.不發(fā)生炎癥反應(yīng) 發(fā)生嚴重炎癥反應(yīng)5.被鄰近正常細胞 被巨噬細胞所吞噬或吞噬細胞所吞噬6.溶酶體完整 溶酶體裂解7.染色質(zhì)均一凝集 染色質(zhì)聚集成塊、不均一細胞凋亡與壞死在形態(tài)學(xué)上的差別A 壞死細胞B 凋亡細胞細胞凋亡與細胞壞死在形態(tài)學(xué)上的區(qū)別3. SEM of a necrotic cell. Numerous lesions appear on the cell surface. 4. SEM of an apoptotic cell. Surface blebbing is evi

6、dent. 細胞凋亡與細胞壞死在形態(tài)學(xué)上的區(qū)別二、細胞凋亡的生物化學(xué)特征胞膜: 磷脂酰絲氨酸（PS）由膜內(nèi)側(cè)翻到膜外表面 胞質(zhì)：蛋白酶（caspase）活化，發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)（cascade），并伴隨有能量消耗、新基因轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)合成 胞核：細胞核內(nèi)染色質(zhì)DNA被核酸內(nèi)切酶降解；從凋亡細胞中提取的DNA在瓊脂糖凝膠電泳中呈梯狀 （DNA ladder）三、細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控分子 caspase家族Bcl-2 家族三、細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控分子 線蟲(Caenorhabditis elegans) 為細胞凋亡的研究作出了巨大貢獻。 線蟲在發(fā)育過程中，共產(chǎn)生1090個細胞，其中131個細胞發(fā)生凋亡。三、細

7、胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控分子 線蟲中有11個基因與細胞凋亡相關(guān)，其中ced3 （cell death abnormal）和ced4基因是促進細胞凋亡，ced9基因抑制細胞凋亡。突變體ced3: 所有的 131 個細胞存活ced4: 所有的 131 個細胞存活ced9: 在胚胎發(fā)生過程中所有的細胞死亡哺乳動物中 ICE（interleukin-1 converting enzyme, 即caspase-1）， 為ced3的同源蛋白caspase家族半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific proteinase，caspase），其活性部位均含有半胱氨酸殘基，

8、其切割位點為底物的天門冬氨酸殘基后的肽鍵。哺乳動物中15種同源分子，其中7種參與細胞凋亡過程。根據(jù)其激活 方式及在細胞凋亡信號傳遞中的作用，分為： 凋亡起始酶（initiator caspase）：caspase2，8， 9，10 凋亡效應(yīng)酶（effector caspase）：caspase3，6，7caspase家族caspase家族體內(nèi)的存在形式：以胱天蛋白酶原（zymogen）的形式合成，呈低水平組成性表達。酶原主要由原結(jié)構(gòu)域 (prodomain)、大亞單位(p20) 和小亞單位(p10)組成。caspase家族DED: death effector domain; CARD: ca

9、spase activation and recruitment domain caspase的活化同源活化（homo-activation）/自身活化（self-activation）：起始酶（initiators）的活化起始酶含有較長的原結(jié)構(gòu)域，對其活性有抑制作用通過DED、CARD結(jié)構(gòu)域與其它蛋白質(zhì)相互作用形成二聚體/寡聚體而恢復(fù)酶活性caspase的活化caspase的活化異源活化（hetero-activation）：活化的起始酶催化水解效應(yīng)酶將凋亡信號級聯(lián)放大caspase cascadecaspase的活化caspase的效應(yīng)機制效應(yīng)性caspase可裂解多種底物蛋白：多種蛋白激

10、酶，如FAK (focal adhesion kinase)等。FAK的降解可使細胞喪失粘附能力，形成游離細胞核纖層蛋白，導(dǎo)致核纖層的解組裝和核的皺縮細胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白，如微絲、中等纖維等，使細胞變形caspase的效應(yīng)機制 效應(yīng)性caspase可裂解多種底物蛋白：激活核酸酶，caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease，CAD）正常活細胞核酸酶CAD與其抑制物ICAD結(jié)合在一起處于無活性狀態(tài)caspase可以裂解其抑制物ICAD而激活核酸酶CADcaspase的效應(yīng)機制caspase的效應(yīng)機制效應(yīng)性caspase可裂解多種底物蛋白：

11、DNA修復(fù)酶，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（poly (ADP-ribose) polymerase, PARP）鈣不依賴的磷脂酶A2 （iPLA2），生成溶血磷脂酰膽堿 （ LPC），招募單核細胞Bcl-2（B cell leukemia 2）是一種原癌基因；定位于線粒體外膜，可與胞質(zhì)蛋白或同時錨定在線粒體外膜的該家族的其它蛋白相互作用；促進細胞存活（survival），抑制細胞凋亡，而不是促進細胞增殖（proliferation）。Bcl-2家族所有Bcl-2家族成員均含有14個保守的BCL-2同源結(jié)構(gòu)域（BCL-2 homologue, BH），稱為BH1 BH4。根據(jù)對細胞凋亡調(diào)節(jié)功能

12、的不同，將Bcl-2家族成員分為兩類：抗凋亡的負調(diào)節(jié)因子；促進細胞凋亡的正調(diào)節(jié)因子Bcl-2家族Bcl-2家族的分類，Tait and Green, 2010Bcl-2亞家族： Bcl-2、 Bcl-xl、 Bcl-w、Mcl-1、A1，具有BH1、BH2、BH3和BH4四個結(jié)構(gòu)域。定位于線粒體外膜，抑制細胞凋亡Bax亞家族：Bax、Bak、Bok，具有BH1、BH2、BH3三個結(jié)構(gòu)域，促進細胞凋亡的效應(yīng)分子。需轉(zhuǎn)位到線粒體外膜BH3亞家族：Bad、Bid、Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml，僅有BH3結(jié)構(gòu)域，通過與抗凋亡的核心分子結(jié)合，而釋放BAX、BAK等，從而促進細胞凋亡Bcl

13、-2家族四、細胞凋亡的信號通路細胞凋亡的外在途徑（extrinsic pathway ）/死亡受體通路 由細胞膜上的死亡受體接受外環(huán)境中的死亡信號并迅速激活胞內(nèi)胱天蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，使凋亡信號放大并傳遍整個細胞，引起凋亡效應(yīng)。死亡受體（ Death Receptor）屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族其中研究最充分的是FasL/FasR和 TNF-/TNFR-1系統(tǒng)。死亡受體（ Death Receptor）一種跨膜蛋白，包含一個富含半胱氨酸殘基的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域以及一個胞內(nèi)的由約80個氨基酸殘基組成的死亡結(jié)構(gòu)域 （death domain, DD）；死亡結(jié)構(gòu)域可與具有死亡

14、結(jié)構(gòu)域同源序列的蛋白質(zhì)結(jié)合，在細胞凋亡信號的傳遞中起至關(guān)重要的作用。Fas介導(dǎo)的細胞凋亡信號傳遞途徑DED, death effector domain 死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域FADD, Fas-associated death domain, Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白DD, death domain, 死亡結(jié)構(gòu)域死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體（ DISC）FasR招募的FADD一方面通過其C端的DD結(jié)構(gòu)域與死亡受體相互作用，另一方面又可通過其N端的DED結(jié)構(gòu)域與procaspase-8/procaspase-10分子N端的DED結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成死亡受體-接頭蛋白-procaspase-8/10組成的復(fù)合物，即死

15、亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體 (death-inducing signal complex, DISC)，引發(fā)procaspase-8/procaspase-10的二聚化，發(fā)生自我剪切而活化。HIV 介導(dǎo)的細胞凋亡2. 細胞凋亡的內(nèi)在途徑（ intrinsic pathway）/線粒體通路 /應(yīng)激通路 射線、化學(xué)物質(zhì)等造成DNA損傷，氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白累積等應(yīng)激因素，通過調(diào)控Bcl-2家族的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，導(dǎo)致線粒體膜通透化，使線粒體釋放一些細胞凋亡相關(guān)分子，并啟動細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細胞凋亡過程。四、細胞凋亡的信號通路BAX、BAK的活化是線粒體膜通透化的關(guān)鍵，BH3亞家族蛋白被誘導(dǎo)表達或激活

16、后，可與BCL-2家族的抗凋亡核心蛋白質(zhì)結(jié)合，從而解放出BAX、BAK，或者通過直接作用于BAX、BAK，調(diào)控其活化，使其寡聚化，形成蛋白質(zhì)孔道，引起線粒體膜通透化，促進細胞色素（CytC）的釋放，激活caspase cascade，促進凋亡。Bcl-2家族與線粒體膜的通透化細胞凋亡的內(nèi)在途徑凋亡信號刺激細胞引起：線粒體膜通透性增加；跨膜電位（）下降；膜孔變大，導(dǎo)致線粒體膜間隙內(nèi)的凋亡介導(dǎo)因子（如：細胞色素C）釋放。細胞凋亡的內(nèi)在途徑CytC胞質(zhì)中的Apaf-1因子（細胞凋亡蛋白酶激活因子1，apoptotic protease activating factor 1）脫氧三磷酸腺苷多個Pro

17、caspase-9 形成一個活化的凋亡體（apoptosome)。細胞凋亡的內(nèi)在途徑凋亡體使procaspase-9被水解形成有活性的caspase-9，再進一步活化下游的效應(yīng)性caspase的級聯(lián)反應(yīng)，并水解相應(yīng)的底物，引發(fā)細胞凋亡。細胞凋亡的內(nèi)在途徑五、凋亡細胞的檢測1. 細胞形態(tài)學(xué)檢測2. DNA片段化3. 細胞膜的改變4. 線粒體分析5. caspase活性及其底物的生化分析五、凋亡細胞的檢測細胞形態(tài)學(xué)檢測 電鏡： 熒光染色：常用的DNA特異性染料：Hoechst 33342，DAPI 五、凋亡細胞的檢測2. DNA片段化：細胞核內(nèi)染色質(zhì)DNA被核酸內(nèi)切酶降解; 從凋亡細胞中提取的DN

18、A在瓊脂糖凝膠電泳中呈梯狀（DNA ladder）。 Ca+apoptosisExternalization of PS Ca+ Ca+ Ca+PSFACS analysis磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，凋亡時，可從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。五、凋亡細胞的檢測3. 細胞膜的改變FITC-Annexin-V-Fluorescence流式細胞術(shù)檢測PS外翻PI Fluorescence五、凋亡細胞的檢測4. 線粒體分析 正常

19、細胞：線粒體跨膜電位存在， 親脂性陽離子熒光染料：Rhodamine 123等結(jié)合到線粒體，染料聚集，表現(xiàn)出特有的熒光； 凋亡細胞：染料彌散在細胞質(zhì)中五、凋亡細胞的檢測5. caspase活性及其底物的生化分析： Western blot 免疫沉淀 免疫組化 對PARP底物的剪切 利用熒光標記的底物檢測caspase的活性caspase活性的檢測正常：caspase-3以酶原（32KD）形式存在于胞漿，凋亡早期：被激活，其活性形式由兩個大亞單位和兩個小亞單位組成。六、 細胞凋亡的生物學(xué)意義確保正常個體發(fā)育維持組織、器官功能保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定 個體發(fā)育過程中，清除機體內(nèi)不需要的結(jié)構(gòu)六、細胞凋亡的生物學(xué)意義蝌蚪變成青蛙的過程中尾巴的消失六、細胞凋亡的生物學(xué)意義 人手的發(fā)育過程伴隨著細胞的凋亡 個體發(fā)育過程中，組織結(jié)構(gòu)的塑造六、細胞凋亡的生物學(xué)意義調(diào)控細胞的數(shù)目 ：大鼠視覺系統(tǒng)的發(fā)育過程中，清除神經(jīng)軸突出現(xiàn)錯誤連接的細胞 六、