堿性磷酸酶報告【上課用】(共6頁)

1、堿性磷酸酶的提取(tq)及其比活性測定實(shí)驗(yàn)報告班級(bnj)： 12級生物(shngw)一班小組成員：陳明珠、鄧家穎、范潔婷、梁彥珺 指導(dǎo)老師：許華1、實(shí)驗(yàn)(shyn)原理 本實(shí)驗(yàn)采取有機(jī)溶劑沉淀法從豬肝勻漿液中提取分離堿性磷酸酶(AKP)。正丁醇能使部分雜蛋白變性，過濾除去(ch q)雜蛋白即為含有AKP的濾液，AKP能溶于終濃度為33的丙酮或30的乙醇中，而不溶于終濃度為50的丙酮或60的乙醇中，通過離心即可得到初步純化的AKP。根據(jù)國際(guj)酶學(xué)委員會規(guī)定，酶的比活性(specific activity)用每mg蛋白質(zhì)具有的酶活性單位(u/mgpr)來表示。因此，測定樣品的比活性必須

2、測定：(1)每ml樣品中的蛋白質(zhì)mg數(shù)(mg/m1); (2)每ml樣品中的酶活性單位數(shù)(u/ml)。酶的純度越高酶的比活性也就越高。 本實(shí)驗(yàn)以磷酸苯二鈉為底物，由堿性磷酸酶催化水解，生成游離酚和磷酸鹽。酚在堿性條件下與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化，生成紅色的醌衍生物，顏色深淺和酚的含量成正比。于510nm處比色，即可求出反應(yīng)過程中產(chǎn)生的酚含量，而堿性磷酸酶的活性單位(King-Armstrong法)可定義為：在37保溫15min每產(chǎn)生lmg的酚為一個酶活性單位（U）。樣品中蛋白質(zhì)含量測定用考馬斯亮藍(lán)法測定。2、實(shí)驗(yàn)試劑 10.5mol/L乙酸鎂溶液：稱取乙酸鎂107.25g溶于蒸餾水

3、中，稀釋至1000ml。 20.1mol/L乙酸鈉溶液：稱取乙酸鈉8.2g溶于蒸餾水中，稀釋到1000ml。 30.01mol/L乙酸鎂-0.01mol/L乙酸鈉溶液：取0.5mol/L乙酸鎂溶液20ml及0.1mol/L乙酸鈉溶液100ml，混合后加蒸餾水稀釋到1000ml。 40.01mol/L Tris-0.01mol/L乙酸鎂pH8.8緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷12.1g，用蒸餾水溶解并稀釋至1000ml，即為0.1mol/L Tris溶液。取0.1mol/L Tris溶液100ml，加蒸餾水約800ml，再加0.5mol/L乙酸鎂溶液20ml，混勻后用1乙酸調(diào)pH至8.8，用蒸餾水

4、稀釋至1000ml即可。 5 丙酮(分析純) 6 95乙醇(分析純) 7 正丁醇(分析純) 8 0.04mol/L底物液：稱取磷酸苯二鈉(C6H5PO4Na22H2O)15.16g或磷酸苯二鈉(無結(jié)晶水)8.72g，用煮沸冷卻的蒸餾水溶解，稀釋至1000ml。加氯仿4ml盛于棕色瓶中，冰箱內(nèi)保存，可用一周。 90.01mg/ml酚標(biāo)準(zhǔn)液：稱取重蒸酚l00mg，用pH8.8 Tris液配制成100ml，臨用前稀釋100倍。100.5mol/L NaOH110.3 4-氨基安替比林：稱取4-氨基安替比林0.3g及碳酸氫鈉4.2g，用蒸餾水溶解(rngji)并稀釋至100ml，置棕色瓶中冰箱保存。1

5、20.5鐵氰化鉀：稱取鐵氰化鉀5g和硼酸15g，各溶于400ml蒸餾水中，溶解(rngji)后兩液混合，再加蒸餾水至1000ml，置于棕色瓶中，暗處保存。3、實(shí)驗(yàn)(shyn)器材1研缽2刻度離心管3移液管4電動離心機(jī)5玻璃漏斗和玻棒6托盤天平7恒溫水浴8石英比色皿9.725型分光光度計(jì)3、操作步驟 3.1 AKP的提取(1)取2g新鮮豬肝，剪碎后加入0.01mol/L乙酸鎂-0.0lmoL/L乙酸鈉溶液2.0ml，研磨成勻漿。將勻漿倒人刻度離心管中，記錄其體積VA，此為A液。吸取A液0.1ml于另一試管A1中，加pH8.8Tris緩沖液1.9ml稀釋，此為稀釋A1液(1：20)，供測比活性用。

6、再取A液0.1ml于另一試管A2中，加生理鹽水4.9ml稀釋，此為稀釋A2液（1:50），此供測蛋白質(zhì)含量用。(2)在剩余A液中加入正丁醇2.0ml，用玻棒充分?jǐn)嚢?至5min，室溫放置30min，用濾紙過濾，濾液置于刻度離心管中，加入等體積的冷丙酮，立即混勻后離心(2000r/min)5min，棄上清液，沉淀加入0.5mol/L乙酸鎂4.0ml，用玻棒充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，記錄其體積VB，此為B液。取B液0.1ml于另一試管中，加人pH8.8 Tris緩沖液1.9ml，此為稀釋B液(1：20)，供測比活性用。再取B液0.1ml于另一試管B2中，加生理鹽水4.9ml稀釋，此為稀釋A2液（1:50）

7、，此供測蛋白質(zhì)含量用。剩余B液記體積VB。 （3）在剩余B液中加入96%的冷乙醇0.45VB，混勻，離心（2500r/min）5min，棄沉淀。上清液入離心管，記體積VB”，加0.83 VB”96%冷乙醇，混勻，離心 2500 rpm，5 分鐘 。棄上清，沉淀加 0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc混合液4ml ，攪拌，記體積VC，此為C液。吸取C液0.1ml于另一試管C1中，加pH8.8Tris緩沖液0.9ml稀釋，此為稀釋C1液(1：10)，供測比活性用。再取C液0.1ml于另一試管C2中，加生理鹽水0.4ml稀釋，此為稀釋C2液（1:5），此供測蛋白質(zhì)含量用。剩余C液記體

8、積VC。 (4)在剩余C液中加入(jir)冷丙酮0.5VC，混勻，離心（2000r/min）5min，棄沉淀(chndin)。上清液入離心管，記體積VC”，加1/3VC”冷丙酮(bn tn)，混勻，離心 2000 rpm ,5 分鐘 。棄上清，沉淀加 0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc混合液5ml ，攪拌，記體積VD，此為D液。吸取D液0.1ml于另一試管D1中，加pH8.8Tris緩沖液0.9ml稀釋，此為稀釋D1液(1：10)，供測比活性用。剩余D液入D2管，直接待測蛋白質(zhì)含量。 3.2 AKP的比活性測定(1)AKP的活性測定：取試管5支，按表1操作： 表1 試劑ml

9、B 1 2 3 4A1稀釋液 0.1 B1稀釋液 0.1C1稀釋液 0.1D1稀釋液 0.1pH8.8Tris緩沖液 0.1 0.04molL底物液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.00.5mol/L NaOH 1.0 1.0 1.0 1.0 1.00.3% 4-氨基安替比林 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0立即混勻，37水浴預(yù)溫15min 0.5% 鐵氰化鉀 2.02.02.02.0 2.0混勻，終止酶促反應(yīng)，室溫放置10min后，B管試劑調(diào)零，510nm處測吸光度，記錄各管OD。做一只酚標(biāo)準(zhǔn)管：依次加入0.1mlpH8.8Tris緩沖液、1ml0.01mg/ml苯酚標(biāo)準(zhǔn)液、1ml

10、0.5mol/L NaOH、1ml0.3% 4-氨基安替比林。混勻，510nm處測吸光度。(2)蛋白質(zhì)含量測定：取3支試管，按表2操作：表2 試劑(shj)ml B 1 2 3 4生理鹽水(shnglynshu) 0.1 A2稀釋液 0.1B2稀釋液 0.1C2稀釋液 0.1D溶液(rngy) 0.1考馬斯亮藍(lán)試劑 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 混勻。2分鐘后，B管試劑調(diào)零，595nm處測吸光度，記錄各管OD。 用牛血清蛋白制數(shù)只不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，用考馬斯亮藍(lán)法測得其分光光度，并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線表。4、計(jì)算方法測定管的吸光度每ml待測酶液中AKP活性單位數(shù)(U/ml)= 標(biāo)準(zhǔn)管的酚

11、含量 標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度 稀釋倍數(shù)待測酶液中蛋白質(zhì)濃度(mg/m1)= 查標(biāo)準(zhǔn)曲線表所得值稀釋倍數(shù) 每ml待測酶液中AKP的活性單位數(shù)（U）3）AKP的比活性(U/mg)= 每ml待測酶液中蛋白質(zhì)的毫克數(shù)（mg）4）總蛋白量(mg)= 蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) 總體積(ml)5）酶總活性單位數(shù)(U) = AKP活性單位數(shù)(U/ml) 總體積(ml)6）純倍數(shù)計(jì)算 =各階段AKP比活性數(shù)(U/mg)A液的AKP比活性數(shù)(U/mg)7）得率(%)=各階段酶的總活性單位數(shù)(U) A液中酶的總活性單位數(shù)(U) 100%5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果測得表一各管OD值如下：試劑B1234OD00.1520.2100.0930

12、.342苯酚標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)管測得吸光度為0.02A表二各管OD值如下(rxi)：試劑B1234OD01.9891.1510.8650.799標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線得出y=60.333x+0.028，其中(qzhng)y為吸光度（A），x為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）19343.798.7得率(%)4.6671.52.5純化倍數(shù)0.0280.0090.0150.006比活性（U/mg）10.262.3255.255.32總AKP活性單位（U）1710.4651050.76AKP活性單位（U/ml）366.96261.08347.355840.21總蛋白量（mg）61.1652.21669.471120.030蛋白含量（mg/ml）6557總體積（ml）第三次丙酮提取（D液）第二次乙醇提?。–液）第一次丙酮提取（B液）勻漿A液經(jīng)過計(jì)算得出下表：6、注意事項(xiàng)1在純化過程中，各步加入的有機(jī)溶劑量要計(jì)算準(zhǔn)確；2加入有機(jī)試劑混勻后應(yīng)立即離心，不宜放置過久；3在測定酶活性時，每加入一種試劑須立即混勻，避免渾濁；低溫條件進(jìn)