土壤中砷的處理

1、土壤中砷的處理1引言砷是一類廣泛存在于土壤中的具有致癌作用的類金屬元素，主要來源于含砷農(nóng)藥、化肥的施用及含砷污水灌溉等據(jù)雷鳴等(2008)的調(diào)查，湖南郴州、衡陽等地稻田砷污染較嚴(yán)重，土壤砷含量最高達(dá)245mgkg-l,導(dǎo)致大米砷含量超標(biāo)，造成嚴(yán)重的健康威脅和巨大的經(jīng)濟(jì)損失.同時(shí)，砷作為一種變價(jià)元素，不同價(jià)態(tài)毒性及生物有效性有較大差異，如三價(jià)砷生物毒性是五價(jià)砷的60100倍此外，水分可通過改變土壤氧化還原電位、鐵錳氧化物等變價(jià)元素的價(jià)態(tài)而影響砷的生物有效性及其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，如淹水導(dǎo)致As(V)向As(III)轉(zhuǎn)化，提高了土壤中As(III)的含量；同時(shí)，土壤水分會(huì)影響水稻籽粒中砷含量，灌漿期后濕潤灌

2、溉可顯著降低糙米中砷含量研究表明，稻田土壤水分含量可影響并改變土壤溶液及稻米中砷含量，而控制土壤水分含量是解決稻田土壤砷污染問題的有效途徑之一，并揭示出水分是影響砷毒性的主要因素之一，尤其是在稻田土壤上.因此，需對(duì)二者作用關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)探討土壤酶是土壤的重要組成成分，土壤中所有生物化學(xué)過程的發(fā)生都得益于土壤酶的作用酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶催化反應(yīng)速度及各種因素(如污染物等)影響的方法,其結(jié)果不僅可顯示土壤酶總量的高低，而且還可以反映酶與底物、重金屬污染物等之間結(jié)合的緊密程度和作用過程，從而能深入探討污染物與酶作用機(jī)理，故被認(rèn)為是一種理想的研究手段目前，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)砷的土壤酶效應(yīng)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)有激

3、活、抑制和無關(guān)3種作用，如As(V)會(huì)抑制堿性磷酸酶及芳基硫酸酯酶活性，而As(III)則不敏感;砷能激活土壤脲酶活性對(duì)不同水分下土壤酶作用機(jī)理的研究也有零星報(bào)道，如Zhang等(2009a;2009b)發(fā)現(xiàn)，土壤脫氫酶活性及酶促最大反應(yīng)速度均隨水分含量升高而增加；高水分含量增強(qiáng)了磷酸酶與底物親和力，提高了最大反應(yīng)速度;淹水對(duì)土壤脲酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)無顯著影響(雋英華等，2011).但目前對(duì)不同水分條件下砷與酶作用機(jī)理的研究則鮮見報(bào)道因此，本文擬采用室內(nèi)模擬培養(yǎng)試驗(yàn)的方法，從酶動(dòng)力學(xué)角度研究水分對(duì)砷與土壤堿性磷酸酶關(guān)系的影響，揭示砷對(duì)堿性磷酸酶的作用受水分影響的機(jī)理，以期為稻田土壤砷污染的準(zhǔn)確監(jiān)測和

4、保護(hù)修復(fù)提供依據(jù)2材料與方法2.1供試土壤供試土壤為采自江蘇省中國科學(xué)院常熟農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站的水稻土(底潛鐵聚水耕人為土，EndogleyicFe-accumuli-StagnicAnthrosols).采樣時(shí)，先去除05cm表層土，采用五點(diǎn)法取520cm土樣，混勻風(fēng)干，過1mm尼龍篩備用.常規(guī)方法測定土壤基本化學(xué)性質(zhì)(鮑士旦，1997)，結(jié)果為有機(jī)質(zhì)47.69gkg-1，pH=6.93(水土比2.5:1),全氮3.1gkg-1，全磷0.61gkg-1,全鉀18.02gkg-1，堿解氮10.66mgkg-1，速效磷11.74mgkg-1，速效鉀112.90mgkg-1，陽離子交換量26.20cm

5、olkg-1，游離氧化鐵2.43gkg-1，總砷8.70mgkg-1，有效砷(0.5molL-1NaHC03)0.32mgkg-1.2.2試驗(yàn)方案向600g土樣中添加不同濃度的As(V)(Na3AsO412H20,AR)溶液，使As(V)含量分別為0、25、50、100、200、400mgkg-1，并調(diào)節(jié)土壤含水量為最大持水量(WHC)的35%、65%、110%,分別代表土壤水分條件為干燥、濕潤及淹水混勻后加蓋密閉，于(251)C的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，期間稱重法控制土壤水分含量；定期(1、8、15、30d)取樣測定并計(jì)算酶動(dòng)力學(xué)參數(shù).土壤堿性磷酸酶動(dòng)力學(xué)測定：在3.00g土壤中加入0.25mL甲苯

6、，15min后添加20mL采用緩沖液(pH=9.4)配制的不同濃度(0.0010、0.0025、0.0050、0.010molL-1)的磷酸苯二鈉溶液，37C培養(yǎng)，定時(shí)取樣，采用磷酸苯二鈉比色法測定土壤磷酸酶活性(關(guān)松蔭，1987).每個(gè)處理重復(fù)3次，并設(shè)無底物和無土壤處理為對(duì)照2.3數(shù)據(jù)處理土壤酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax的計(jì)算參考文獻(xiàn)，具體而言，米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax可用Michaelis方程的積分式計(jì)算：v=-冥S/(心+S)(1)經(jīng)數(shù)學(xué)變換和整理得到：1AXln(VSJW1/心SA+匸心(2)式中，t為酶促反應(yīng)時(shí)間(h)，S0、St分別是初始時(shí)刻和t時(shí)刻底物濃度(mmolL1

7、).可見,上式是一條1/tXln(S0/St)對(duì)1/tX(S0-St)的直線方程在反應(yīng)期間通過測定不同時(shí)間段利用的底物濃度(或生成的產(chǎn)物濃度)，并通過線性回歸，即可求得Km和Vmax值.土壤酶促反應(yīng)速度常數(shù)k計(jì)算如下(和文祥等，2001):(3)式中，t為酶促反應(yīng)時(shí)間(h)，S0、St分別是初始時(shí)刻和t時(shí)刻底物濃度(mmolL-1).砷對(duì)土壤酶抑制常數(shù)Ki的計(jì)算見文獻(xiàn)(朱銘莪，2011;譚向平，2014)，其中，競爭性抑制動(dòng)力學(xué)方程為：式中，Ki為抑制常數(shù)(mmolL-1);Km*為抑制劑存在下表觀米氏常數(shù)(mmolLT);C為外源砷劑量(mgkg-1).線性混合抑制動(dòng)力學(xué)方程為:K；+S（a

8、/3）A；+5式中，Vmax*為抑制劑存在時(shí)酶表觀最大速率gg-lh-l);KS*為酶-底物表觀解離常數(shù)(mmolLT).對(duì)于線性混合型抑制，V*max=Vmax/p，Ks*=(a/p)Ks;其中:式中，I為抑制劑濃度(mgkg-1),6Ki為酶-底物-抑制劑解離常數(shù)(mmolL-1),6可表示酶-抑制劑對(duì)底物的親和力.采用MicrosoftExcel2013和SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及模型擬合，LSD法對(duì)各處理間差異進(jìn)行多重比較3結(jié)果與分析3.1砷對(duì)堿性磷酸酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征影響3.1.1米氏常數(shù)Km的變化米氏常數(shù)Km表征酶與底物結(jié)合牢固程度，在數(shù)值上等于初速度達(dá)到最大反應(yīng)速

9、度1/2時(shí)的底物濃度.Km值越小，表明酶與底物結(jié)合越牢固，親合力越大(和文祥等，1997).從表1可以看出：不同水分下堿性磷酸酶Km總體呈現(xiàn)35%WHC65%WHC110%WHC的變化規(guī)律，3個(gè)水分下Km均值分別為6.08、4.78、3.66mmolL-1,表明隨水分含量增加，土壤堿性磷酸酶與底物的親和力增強(qiáng)，酶與底物更易結(jié)合除個(gè)別處理外，其余處理土壤堿性磷酸酶Km隨砷含量增加而顯著增大，表明砷污染導(dǎo)致堿性磷酸酶與底物親和力減弱不同處理下Km值雖有差異，但處于同一數(shù)量級(jí)，整個(gè)試驗(yàn)處理中Km變幅為2.3410.95mmolL-1.不同培養(yǎng)時(shí)間的Km變化較小，如砷含量為100mgkg-1時(shí)，35%

10、WHC、65%WHC、110%WHC下Km變化范圍分別為5.126.44、4.235.54、2.354.41mmolL-1，表明培養(yǎng)時(shí)間對(duì)土壤酶與底物親和力影響較弱.相關(guān)分析顯示，35%WHC、65%WHC下砷含量與Km呈顯著相關(guān)(r0.913*)，而110%WHC下則相關(guān)性較差，表明干燥條件下砷顯著降低土壤酶與底物的親和力.表1供試土壤堿性磷酸酶米氏常數(shù)水分含里米氏常y（mmolL1）1d3d15d30d35%WHC03.880.28c4.昶士0岔4.0410.394.830.43c5.63254.160.35c5.350.34d4.720.42d0.49te5.75505.4610.37s

11、6.120.63c4.740.29d0.46k5.011005.1E1珂6.440.495.800.Uc0.412005.150.31b6.740.54b7.U0.54s6.690.49s10.954007.440.90aS.490.75a0.97a9.651.11a65%WHC03.0&0.19d2.710.16eS.510.24c4.03254.300.34c0.253.52+0.29d3.550.24c5.16504.460.43c0.4Sw3.39D.3卡4.11035b4.631000.395.540.6S54.990.43c4.230.29d2005.590.41b5.930.76

12、b5.850.50b4.590.40b4007.501.24a3.O01.1Oa6.630.61a5.060.40a110%02.61O.10d2.34+0.19c4.00+WHC2.50O.36b0.30352.74S.74250.200.53*2.000.233.710.292.97500.2214.550.6Sa3.240.3Ss4.450.31aS.261000.264.0710.61a2.35+0.21c4.410.30s2003.670.3355.041.17a3.740.55a3.800.2554.014005.3610.65a4.600.S3a3.690.36a0.44=：!：

13、同列數(shù)據(jù)(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差后的不同小寫字母克示差異顯著(P0.912*)，表明淹水下Vmax可在一定程度上監(jiān)測土壤砷的污染程度，且機(jī)理為完全抑制作用.生態(tài)劑量值(EcologicalDose)ED10是指酶活性變化10%時(shí)外界污染物的濃度，可表征土壤輕度污染時(shí)的臨界濃度(Doelmanetal.，1989).計(jì)算獲得水稻土砷污染ED10值為73.52156.67mgkg-1.表2供試土壤堿性磷酸酶最大反應(yīng)速率Vmax水分含里神含W(mgkg-最夫反應(yīng)速率臨打11d8d15d30d329.20422.9235%WHC014.40*390.5315.03a21.00430.9324.45a312.9

14、52515.89401.2915.69a385.9221.98432.3925.71a50350.2115.61a409.2926.79a400.0015.37s421.0S23.20a100290.41111.00c379.7619.65a3S4.3019.61s392.591S.96a200260.269.S7a343.0519.265394.7921.06c394.3320.63a400264.3S22.60d323.13+20.39s450.6631.07a400.2634.71a65%WHC0244.64+10.S25236.378.24te241.237.07a278.7311.6

15、0a25242.4311.66a245.10S.92b254.9312.17a251.749.95b224.3450d仃na3277.2716.73a249.5311.66a248.0012.75d260.30100215.09+11.10b21.47247.4213.22a247.24111.10b200204.579.49b215.4617.S2C252.了狂4.4產(chǎn)226.10111.62c400210.2123.30210.9S20.07c237.7014.54a1S4.309.2Sd110%0254.5311.1SaWHC210.717.22a23S.3016.2531S6.007.

16、33a24S.1225203.247.7122O.6710.7Oa176.277.013S11.2935173.S950192.067.55230.9122.54a10.30229.61+9.06100102.35+3.IO032O0.651S.S3a16907.20214.250.44c200172.203.63*211.4610.S3a151.2712.40c1S9.S27.33d400166.1912.67e159.2018.17s116.096.5Sd160.3310.52e表3堿性磷酸酶最大反應(yīng)速率Vmax與砷含量(C)的擬合關(guān)系氷分含里培許時(shí)間旭攙合方程R2ED10/(mg-kg-

17、135%WHC0=0.21/1+6.59x1oC0.070163.6965%WHC30O.WCI-hI.IOOC0.945101.42110%WHC111/(1+7.09*10*C)O&49I156.673=0.12(1+9.35x10_1C)0.050-112.79150.09/(1+1.03x100)0.032-107.3230=0.11+1.51x1000.99173.52注：frp0.05,p0.01,下同.3.1.3Vmax/Km及反應(yīng)速度常數(shù)k的變化在較大范圍內(nèi)，Vmax/Km是衡量酶促反應(yīng)初速度的重要指標(biāo)，可作為土壤質(zhì)量的指標(biāo)之一.反應(yīng)速度常數(shù)k是酶總體催化能力的指標(biāo)，從本質(zhì)上反

18、映酶促反應(yīng)是“快”還是“慢”，且其值與底物濃度無關(guān)(和文祥等，2009).從表4可知：Vmax/Km、k隨水分含量增加總體呈降低趨勢，35%WHC下的Vmax/Km、k顯著大于65%WHC、110%WHC下，表明較低水分含量有利于土壤酶催化反應(yīng)的進(jìn)行3種水分下，Vmax/Km、k均隨砷含量的增加而顯著降低，表明砷污染本質(zhì)上降低了酶促反應(yīng)初速度35%WHC、65%WHC下，Vmax/Km、k隨培養(yǎng)時(shí)間延長而增加，這與Vmax變化規(guī)律一致利用模型Y=A/(1+BXC)擬合二者關(guān)系，結(jié)果(表5)表明，Vmax/Km、k在一定程度上可作為土壤砷污染程度的監(jiān)測指標(biāo)，且砷對(duì)土壤堿性磷酸酶的作用機(jī)理為完全抑

19、制(包括競爭性抑制和非競爭性抑制)作用(Speiretal.，1999).計(jì)算獲得Vmax/Km、k的ED10范圍分別為20.4570.87mgkg-1和66.00131.89mgkg-1.綜合Vmax的結(jié)果可看出，Vmax/Km獲得的ED10較小，且不同水分下均呈現(xiàn)出較好相關(guān)性，表明Vmax/Km對(duì)砷污染最為敏感，且其比Vmax可更全面、準(zhǔn)確地表征不同水分下土壤砷污染程度.根據(jù)劑量最小最敏感原則獲得水稻土砷輕度污染的臨界值為20.45mgkg-l,此值與國家土壤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的二級(jí)污染標(biāo)準(zhǔn)值(25mgkg-l)較為接近，從側(cè)面表明動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax/Km可較好評(píng)價(jià)土壤砷污染程度.表4供試土壤堿性

20、磷酸酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax/Km及反應(yīng)速度常數(shù)k水分含重神含Wmgkg-反應(yīng)速度常敎陽心h1tfSd15d30d1d8d15d116.75122.31124.67134.6S35%WHC0122.013.2Sa42.76+0.S2a43.6&0.73.002.61a3.63a0.37a103.59107.30S3.25+25“96.19+1.67114.16+3.3230.49：+0.45s37.79+1.03.26b2.70O.90b117.9210234+33.25508S.25-+1.91C93.S53.17b39.09+1.0?40.00+0.42.53ab2.440.99d29.271

21、0080.2S1.51d82.691.90c92.642.11c94.4212.020.64c36.231.16c35.150.425.1g土20069.571.47e71.411.59d77.311.56d82.38+1.65e0.54d30.27+0.9133.400.421.5540040.S7+1.55553.391.27e57.40+1.02s57.971.4Sf25.670.24e31.0S0.60.87101.7712S.3165%WHC005.982.5Oa90.392.55a113.493.01a25.10O.07a26.260.52.67a0.702571.072.10d7

22、6.241.S2b92.362.8Bb90.762.34b21.93+0.43b23.81O.6O3024.990.E19.325063392.22l68.201.98c31.S32.50c77.272.45c0.43c23.4311.0124.690.E19.021005S.471JT159.692.17d63.241.S7d74.901.72c0.4022.640.S7i22.900.t17.3220046.091.13e46.141.06e55.131.51e63.062.01c0.40d17.340.54c22.690.E45.731.2715.1840034.92+1.59t33.1

23、51.20;46.601.24e0.52s17.32O.0SC19.170.E110%71.O61.&0a18.87WHO090.042.S3a3332+5.31a76.132.90.40a15.21：0.62aU.440.l13.10114.562582.7S2.84d65.553.17b6&.392.47b73.112.17a0.36s0.6716.1S0.E17.2614.8315.255072.032.36c56.622.5SC59.912.96c63.491.7360.34c0.6039O.653010062.452.04d57.252.95c51.942.24d64.601.72b

24、15.130.61c14.05+0.70510.100j15.2520052.42+1.92e46845.44d45.092.5Se55.761.42O.UC11.490.63c12.19+0.S12.4240034.571.36,38.62+2.1T35.071.35f44.601.S1c0.279.750.32d9.6S0.4表5堿性磷酸酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax/Km、k與砷含量(C)的擬合關(guān)系培羔時(shí)i日cf反應(yīng)速度常數(shù)k擬臺(tái)方程屮EDia/(mqkg-1)擬合方程R2EDia/(mg-k!35%WHC1=o.112/(1+3.50 x1q-co.gee-31.753.40/(1+1,6010

25、0)0.90069.240WKm-0.11371+3.201OC)0.92534.774.17/(1+1.601000.97366.0015=0.125/(1+2.910C0.96737.S6=4.11/(1+g.7410_iC)0.792*114.0930褊F-州鼬蠱籐血瀚0.9743.124.36/(1+1.22100)0.94690.3365%WHC1怖i=0.。閃片+肖盯明屮匚0.96220.712.35/(1-h1.5710:C)0.90070.93S負(fù)觀碩鱷昭涼填0.96220.45虻Z5引門+13站(T30.33477.7315=0.107/(1+5.00 x1000.92022

26、.232.50/(1+8.4210_iC0.95131.S330K卓畝1騒抽護(hù)40.95637.952.737(1+1.6SIOC)0.&98-6&.S7110%WHC1VW心二D.ogg片+3.9費(fèi)口心0.9928.22E；問CfH：厚喚3鬆0.92606.333W0.075/d+3.0110-C)0.049-36.961.55/(1+1.47101，表明酶-抑制劑對(duì)底物的親和力比酶對(duì)底物的親和力低，進(jìn)一步揭示出線性混合抑制中非競爭性抑制為主要抑制方式（朱銘莪，2011;譚向平，2014）.表6砷對(duì)供試土壤堿性磷酸酶抑制常數(shù)Ki影響35%WHC（爭性抑制複型性抑制模型110%WHC總主性混合

27、抑制複型MmmolL-1)R2R2L-1R26R217.350.SS3-5.490.903*3360.9934390.766S8.710.8674.S40.8922.380.703-4.670.374-153.500.979-4.950.064-3.130.861-2.940.976305.98o.9&r13.090.8S6-7.710.7821.110.9824討論不同水分及砷污染處理下Km值雖有差異，但處于同一數(shù)量級(jí)，這與土壤堿性磷酸酶主要來源于土壤微生物有關(guān)（Frankenbergeretal.，1983;Dicketal.，1984）.不同水分下Km隨砷含量增加而增大，表明砷污染減弱了

28、堿性磷酸酶和底物的親和力，這可能是因?yàn)樯樗岣c磷酸根結(jié)構(gòu)相似，二者共同競爭磷酸酶活性中心（朱銘莪，2011;王紫泉等，2013）.35%WHC、65%WHC下Vmax隨砷含量增大變化不明顯，而110%WHC下則顯著降低，表明110%WHC下，砷不僅通過與底物競爭堿性磷酸酶活性中心減緩了中間復(fù)合物的形成（Km增大），也減弱了酶-底物復(fù)合物的解離能力（Vmax減?。?這可能是因?yàn)樗诛柡拖?，砷與酶活性或非活性中心結(jié)合，引起酶分子的構(gòu)象改變，致使活性中心的催化作用降低（朱銘莪，2011）;同時(shí)，在水分飽和與砷的雙重脅迫下，土壤微生物活性受到抑制而使分泌的酶減少.Km隨水分含量增加顯著降低，這可能是因

29、為水分含量升高土壤更加分散，被土壤有機(jī)質(zhì)或有機(jī)質(zhì)-粘粒復(fù)合物吸附包裹的酶更多的解離暴露出來，增加了酶與底物的接觸機(jī)會(huì)(雋英華等，2008).Marx等(2005)研究認(rèn)為，營養(yǎng)物質(zhì)(底物)在土壤異質(zhì)體系中的擴(kuò)散能力會(huì)影響土壤酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)在土壤含水量較高情況下，水分可利用性好，底物的擴(kuò)散能力較強(qiáng)，增加了酶與底物接觸的機(jī)會(huì)，故Km減小(Zhangetal.，2009a).另外，供試土壤為水稻土，土壤中有機(jī)質(zhì)、粘粒、鐵錳氧化物等含量較大，水分含量較高情況下外源砷進(jìn)入后砷酸根離子會(huì)迅速與土壤發(fā)生吸附、絡(luò)合和沉淀反應(yīng)等，可能會(huì)置換出部分原來被土壤粘粒吸附的堿性磷酸酶分子，使其從吸附態(tài)轉(zhuǎn)變成游離態(tài)，從而使Km值變小(楊春璐等，2007).Vmax也隨水分含量升高顯著降低，這是由于水分含量增加，酶與底物親和力增強(qiáng)(Km減小)，酶-底物復(fù)合物結(jié)合的更牢固，減弱了其分解為酶和產(chǎn)物的能力，從而降低形成產(chǎn)物的數(shù)量(朱銘莪，2011).另外，淹水條件下，土壤孔隙中氧氣濃度降低，好氧微生物活性受到抑制，土壤酶分泌總量減少，也導(dǎo)致Vmax