試驗(yàn)原理步驟注意事項(xiàng)

1、MTT實(shí)驗(yàn)原理； 步驟； 注意事項(xiàng)； 一、原理MTT 全稱為 3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3,5-di- phenytetrazoliumromide ，漢語(yǔ)化學(xué)名 為3-（4, 5-二甲基曝陛-2）-2, 5-二苯基四氮陛澳鹽， 商品名：曝口坐藍(lán)。是一種黃顏色的染料。 MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸 脫氫酶能使外源性 MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞碉（DMSO ）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在 490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，

2、可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。這不僅使工 作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害。 MTT溶液的配制方法： 通常，此法中的MTT濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克， 溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無(wú)酚紅的培養(yǎng)基中，用 0.22科m濾膜過(guò)濾以除去溶液 里的細(xì)菌，放4 c避光保存即可。在配制

3、和保存的過(guò)程中，容器最好用鋁箔紙包住。實(shí)驗(yàn)的 時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺(tái)上的日光燈來(lái)避光，覺(jué)得這樣比較好。需要注意的是，MTT法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT吸光度最好在0-0.7范圍內(nèi)。MTT 一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過(guò)濾后4C避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以 免分解。我一般都把 MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒(méi)必要 一下子配那么多，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了。MTT有致癌性，用的時(shí)候小心

4、，有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的 時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉.配制MTT時(shí)用PBS （ph=7.4）溶解。PBS 配方：Nacl 8g + Kcl 0.2g + Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g 調(diào) pH 7.4，定容 1L。 二、幾種MTT法實(shí)驗(yàn)步驟 普通MTT法實(shí)驗(yàn)步驟： 1:接種細(xì)胞：用含10 %胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔 1000-10000個(gè)細(xì) 胞（細(xì)胞濃度的問(wèn)題見(jiàn)后面的注意事項(xiàng)）接種到 96孔板，每孔體積200ul. 2:培養(yǎng)細(xì)胞：同一般

5、培養(yǎng)條件，培養(yǎng) 3-5天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。3:呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加 MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4）10ul.繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。 每孔加100ul DMSO ,振蕩10min,使結(jié)晶物充分融解。4：比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為 橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線藥物MTT法實(shí)驗(yàn)步驟（1）貼壁細(xì)胞： 1:收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度 1000- 10000 /孔，（細(xì)胞濃度

6、的問(wèn)題見(jiàn)后面的注意事項(xiàng)）。5%CO2 , 37 c孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上， 細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午） 加藥.一般5-7個(gè)梯度，每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況 3: 5%CO2 , 37c孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。4:每孔加入10U1MTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT ）,繼續(xù)培養(yǎng) 4h。若藥物與 MTT能夠 反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用 PBS沖2-3遍后，再加入含 MTT的培養(yǎng)液。5:終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6:每孔加入100u

7、l二甲基亞碉，置搖床上低速振蕩10min ,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。7:同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞碉），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、 MTT、二甲基亞碉）。（2）懸浮細(xì)胞：1:收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1xi06/ml （細(xì)胞濃度的問(wèn)題見(jiàn)后面的注意事項(xiàng)） ，按次序?qū)⒀a(bǔ)足的1640 （無(wú)血清）培養(yǎng)基 40ul ;加Actinomycin D （有毒性）10ul用培 養(yǎng)液稀釋（儲(chǔ)存液100mg/ml,需預(yù)試尋找最佳稀釋度， 1:10-1:20）;需檢測(cè)物10ul;細(xì) 胞懸液50ul （即5X 104cell/孔），共

8、100ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）。每板設(shè) 對(duì)照（加 100ml 1640）2:置37 C, 5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。3:每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml ,即0.5%MTT ）,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用 WST-1 ,培養(yǎng)4 h后可跳過(guò)步驟4）,直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 OD570nm （630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各 孔的吸光值）4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min）,小心吸掉上清，每孔加入 100 ul二甲基亞碉，置搖床上低速振 蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 OD570nm （630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸 光值。5、同時(shí)設(shè)置

9、調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞碉），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞碉），每組設(shè)定3復(fù)孔。三、注意事項(xiàng)：（1）選擇適當(dāng)?shù)?細(xì)胞接種濃度和培養(yǎng)時(shí)間 。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行 MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其貼壁率、倍增時(shí)間以及 不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以防止細(xì)胞過(guò)滿。這樣，才能保證 MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性 降低，太少觀察不到差異。因此，很多高手總結(jié)出“ 寧少勿多”的原則，這一原則在大多數(shù) 情況下是

10、適用的。對(duì)于體積大，增殖快的細(xì)胞，比如腫瘤細(xì)胞，在96孔板中不能接種太多數(shù)目的細(xì)胞。一般應(yīng)該少于104個(gè)/孔。同時(shí)，細(xì)胞貼壁后不可培養(yǎng)過(guò)久，以防過(guò)于密集。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞最佳點(diǎn)板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會(huì)很大。對(duì)于體積小，增殖慢、懸浮的細(xì)胞，在96孔板中可以接種更多數(shù)目的細(xì)胞。甚至可以超過(guò)105個(gè)/孔。同時(shí)，為了觀察藥物對(duì)這類細(xì)胞的效果，可以較上一種細(xì)胞培養(yǎng)更長(zhǎng)時(shí)間。在做腫瘤細(xì)胞的時(shí)候，往往要根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度以及藥物的特性（有時(shí)間依賴性和濃度依賴性白藥物）來(lái)確定培養(yǎng)時(shí)間是 48小時(shí)還是72小時(shí).(2)設(shè)置調(diào)零孔(只加培養(yǎng)基100ul、MTT10U1、二甲基亞碉100ul)。(

11、3)設(shè)置空白孔 (細(xì)胞、藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液共 100U1、10U1MTT、100U1二甲基亞碉)。MTT實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系。96孔板邊緣32孔用無(wú)菌PBS填充，因?yàn)檫吘壍?2孔中水分蒸發(fā)很快，藥物易被濃縮， 對(duì)實(shí)驗(yàn)影響大。同時(shí)加入pbs液填充后，可以一定程度上保持中間孔的水分。(6)防止藥物與MTT反應(yīng)。如果96孔板中加入了具有氧化還原性的藥物，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC,那建議你用PBS 將細(xì)胞洗洗，否則這些藥物會(huì)將MTT還原成棕褐色沉淀，這種效果可能是你不需要的。(7)吸收值分析在理想的 MTT實(shí)驗(yàn)中，如果是細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)，不加藥物處理的空

12、白組的吸收值應(yīng)該在0.8-1.2左右，太小檢測(cè)誤差占的比例較多，太大吸收值可能已經(jīng)超出線性范圍。這個(gè)原理 在朗伯-比爾定律中有解釋。(8)培養(yǎng)過(guò)程中換液100ul的培養(yǎng)液對(duì)于10的45次方的增殖期細(xì)胞來(lái)說(shuō)，很難維持50h以上，如果營(yíng)養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會(huì)由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果。如果培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，在48h應(yīng)該換液一次。(9)避免血清干擾高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一 般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。(10)判斷污染如加入MTT后都有個(gè)別孔立即變?yōu)樗{(lán)黑色，則污染的可能性趣大。在加 MTT前可以先在

13、 鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的。(11)加DMSO前要把液體小心吸掉但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會(huì)吸去，可在這之前先用平板離心機(jī)離心96孔板，2000r ,5分鐘，然后吸掉上清(如果是懸浮細(xì)胞，則推薦此法 ，懸浮細(xì)胞要離心 2500rpm x 10min.且 其做MTT最好用圓底型96孔板，清除上清時(shí)注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉。對(duì)于貼壁細(xì)胞，可以試著將 96孔板傾斜30度角，然后用槍尖慢慢吸。如有錯(cuò)誤，請(qǐng)您提出更正；如有遺漏，請(qǐng)您補(bǔ)充。祝您實(shí)驗(yàn)順利！一、MTT是什么MTT 是一種粉末狀化學(xué)試劑，全稱為 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5

14、-di- phenytetra zoliumromide ,漢語(yǔ)化學(xué)名為3-(4, 5-二甲基曝陛-2)-2, 5-二苯基四氮陛澳鹽，商品名：曝陛藍(lán)。是一種黃顏色的染料。二、MTT法用來(lái)做什么簡(jiǎn)單地說(shuō)：是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。MTT主要有兩個(gè)用途.藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測(cè)定;.細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定。三、為何MTT可以用來(lái)做上述工作檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶 甲瓚（Formazan ）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞碉（ DMSO ）能溶解細(xì) 胞中的甲瓚，用 酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處

15、測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值（ OD值），來(lái)判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測(cè)藥物毒性，則表示藥物毒性越?。Ｋ?、實(shí)驗(yàn)所需材料. MTT溶液的配制 通常MTT配成的終濃度為 5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。市面上一般 MTT的包裝為100mg,250mg 或1g對(duì)于100mg這樣的小包裝，廠家都是將 MTT放入小管中的，個(gè)人建議不要再用天平稱 量分裝，而應(yīng)該一次性將其全配制成溶液，如 100mg用20mlPBS來(lái)溶解。 具休做法：預(yù) 先在50ml離心管（沒(méi)有的話,可用 培養(yǎng)瓶替代）加入20ml PBS,從中先

16、吸取500-1000U l PBS裝入含MTT的小管中，吹打若干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻。可以重復(fù)幾次，以使小管中的 MTT不殘留于管內(nèi)。將MTT完全混勻后，用0.22 濾膜過(guò)濾以除 去溶液里的細(xì)菌，分裝避光 （避光袋或是黑紙、錫箔紙包住 ）可長(zhǎng)期保存于-20度。按細(xì)胞培 養(yǎng)板每孔需加10ul計(jì)算，一般每96孔板約需1ml,所以分裝時(shí)可考慮每管分裝1ml。對(duì)于大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加。注意事項(xiàng)：l在配制和保存的過(guò)程中，容器最好用鋁箔紙包住。l配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對(duì)菌很敏感l(wèi)MTT 一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配， 過(guò)

17、濾后4度避光保存兩周內(nèi)（個(gè)人曾做過(guò)4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不錯(cuò)）有效，或配制成 5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融， 最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當(dāng) MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就 絕對(duì)不能再用。lMTT有致癌性，用的時(shí)候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套. MTT甲瓚溶解液二甲基亞碉DMSO ,可以直接溶解，無(wú)需配制，使用方便，溶解速度快，但對(duì)人體毒性 較大，且需去除原培養(yǎng)液，在去除培養(yǎng)液的過(guò)程中，可能會(huì)把結(jié)晶去掉，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。三聯(lián)溶解液：SDS 10g ,異丁醇5ml, 10M HCl 0.1ml用雙蒸水溶解配成 100ml溶液（文獻(xiàn)方

18、法：周建軍等，評(píng)價(jià)抗癌物質(zhì)活性的改良MTT方法，中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993, 24（10） : 455-457 ）,該溶解液不需去除原培養(yǎng)基，但溶解較慢。（個(gè)人覺(jué)得其溶解的能力不如DMSO強(qiáng)） 該溶解液因含有 SDS,在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。五、MTT法實(shí)驗(yàn)步驟1:胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至5-10X104/mlo 細(xì)胞詳細(xì)計(jì)數(shù)方法請(qǐng)參照易生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的相關(guān)文章。對(duì)于初學(xué)者而言， 要使細(xì)胞達(dá)到5-10X104/ml往往不知從何處著手， 我在這里向大家提供一 個(gè)簡(jiǎn)單的方法以初步確定

19、細(xì)胞數(shù)量。以一般細(xì)胞培養(yǎng)常用的 25cm 2為例，1）細(xì)胞密度在長(zhǎng)到約 80%90% （下圖所示為80%90%密度時(shí)細(xì)胞的大致?tīng)顟B(tài)），消化離心收集后，將上清去掉，加入3ml培養(yǎng)基使其混勻。2）另取一支新的15ml無(wú)菌離心管（為下一步接種96孔板用），裝入約 9ml培養(yǎng)基.3）從第一步準(zhǔn)備的3ml細(xì)胞懸液中取1ml,加入上管，混勻后 細(xì)胞計(jì)數(shù)，此時(shí)一般為或小于 5-10 M04/ml ,該濃度相當(dāng)于細(xì)胞計(jì)數(shù)板 4個(gè)大格內(nèi)每大格平均 5-10個(gè)細(xì)胞（見(jiàn)下圖）；如果不夠該濃度，再根據(jù)計(jì)數(shù)的結(jié)果滴加細(xì)胞懸液，每滴按 50ul計(jì)算。細(xì)胞計(jì)*t氏構(gòu)逋計(jì)械拈痂加胞周到的四個(gè)大樣用W表承1 al Ida Nt

20、旦:* m一錢下就亮到的整威葉毅大格，計(jì)款區(qū)愛(ài)用費(fèi)格標(biāo)出.為1除小格.本用中藥為1g奧電細(xì)跑濃度為：四大格細(xì)胞總數(shù)/4XE（r個(gè)/mi4）細(xì)胞數(shù)量因?qū)嶒?yàn)?zāi)康牟煌瑧?yīng)做相應(yīng)調(diào)整，如一般細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔2000個(gè)就可以（相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為 2X104/ml）,細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔 5000 -10000個(gè)（相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度 為5X104/ml）。此外，還應(yīng)根據(jù)細(xì)胞本身特性，如生長(zhǎng)快慢，來(lái)決定細(xì)胞數(shù)量。比如：生 長(zhǎng)較快的細(xì)胞密度可略小。2.將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入100ul,這樣待測(cè)細(xì)胞的密度為 5000 -10000/孔（邊緣孔用無(wú)菌 PBS填充）。l注意：因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，

21、因此接種的過(guò)程中要反復(fù)多次混勻，如每加6個(gè)孔就混勻一次，以確保接種的細(xì)胞密度在各孔之間完全相同，這對(duì)于 MTT的結(jié)果至關(guān)重要。3.將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天 下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度，每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)6個(gè)，否則難以 反應(yīng)真實(shí)情況。下圖可做為96孔板的的參考步局。l對(duì)于加藥，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認(rèn)為應(yīng)盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好，然后將 96孔板中的培養(yǎng)上清去掉（可以用排槍 吸

22、走）再加入100ul含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，這樣能保證藥物濃度的準(zhǔn)確。另外，需注意 的是，如果用這種方法，不要把 96孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥，應(yīng)該吸完一部分后立 即加樣，避免由于 96孔板干燥引起細(xì)胞死亡。4.5%CO2 , 37 c孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下圖為一典型的藥 物梯度為細(xì)胞的毒性作用。5.每孔加入10U1MTT 溶液（5mg/ml ,即0.5%MTT ）,繼續(xù)培養(yǎng) 4h。若藥物與 MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用 PBS沖2-3遍后，再加入含 MTT的培養(yǎng)液。6.終止培養(yǎng)，準(zhǔn)備溶解結(jié)晶。1溶解結(jié)晶的方法有兩種，第一種，用 DMSO溶解

23、1） MTT加入培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成。將上清去掉，該過(guò)程要注意不能把Formazan結(jié)晶移走。有人直接用 移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張 濾紙?jiān)谧烂妫缓髮?6孔 板輕輕倒置，這樣上清便被 濾紙吸走，以減少結(jié)果的損失。個(gè)人認(rèn)為，這兩種方法都有可能導(dǎo)致結(jié)晶的損失，從而引起結(jié)果的不準(zhǔn)確。采用哪種方法，可以自己摸索一下再?zèng)Q定。2）每孔加入150ul二甲基亞碉，置 搖床上低速振蕩10min ,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免 疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。l另一種方法，用三聯(lián)溶解液（見(jiàn)上面MTT甲瓚溶解液）1） MTT加入培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成。這種方法細(xì)胞上清可以不用去掉，直接在每孔 加入100ul溶解液。（該溶解液因含有 SDS ,在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。）2）放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育 46小時(shí)，鏡下觀察，待結(jié)晶全部溶解后570nm測(cè)吸光度。通常37 c孵育4小時(shí)左右，紫色結(jié)