體內(nèi)藥物分析

1、體內(nèi)藥物分析Biopharmaceutical analysis1第一章 體內(nèi)藥物分析概述一、體內(nèi)藥物分析的定義 狹義：利用現(xiàn)代分析儀器和分離手段對(duì)人和動(dòng)物血液、尿和組織等樣品進(jìn)行定性定量的分析 廣義：通過(guò)體內(nèi)藥物濃度的分析，了解藥物在體內(nèi)的數(shù)量和質(zhì)量的變化，獲得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為藥品的生產(chǎn)、臨床應(yīng)用作出評(píng)價(jià)2二、體內(nèi)藥物分析的意義（一）在新藥評(píng)價(jià) 和開(kāi)發(fā)中的意義 1全面質(zhì)量控制 2新藥報(bào)批 3為設(shè)計(jì)新藥提供信息 從代謝產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)新藥 保泰松羥基保泰松（作用強(qiáng)、副作用?。?非那西丁撲熱息痛 前藥設(shè)計(jì) 新劑型的研究，緩控釋、經(jīng)皮制劑等 以上內(nèi)容必須通過(guò)測(cè)定體內(nèi)藥物濃度得以解決3（二）臨床合理用藥

2、中的意義 1血藥濃度與藥理作用42. 影響血藥濃度的因素（1）機(jī)體因素 a生理因素 年齡、性別、生理狀況 b病理因素 c遺傳因素（2）藥物因素 a劑型因素（生物利用度問(wèn)題） b藥物合并使用（酶抑、酶促） c時(shí)間因素5（三）藥物中毒解救的意義（四）興奮劑檢測(cè)的意義6三、體內(nèi)藥物分析的對(duì)象3從樣品的來(lái)源分1從分析物分母體藥物代謝物內(nèi)源性物質(zhì)2從生物樣品種類分均勻樣品 非均勻樣品人體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7四、體內(nèi)藥物分析的任務(wù)（一）方法學(xué)的研究（二）治療藥物監(jiān)測(cè) TDM，therapeutical Drug Monitoring1定義2哪些藥物需進(jìn)行體內(nèi)血藥濃度監(jiān)測(cè)8有效血藥濃度范圍窄，稍高毒性大，稍低無(wú)療效劑

3、量小，毒性大的藥物個(gè)體差異大，劑量難以控制藥物毒性反應(yīng)與疾病癥狀相似多種藥物合并應(yīng)用，有中毒危險(xiǎn)胃腸道、肝臟、腎臟疾病呈非線性動(dòng)力學(xué)的藥物判斷患者用藥的依從性 9（三）藥代動(dòng)力學(xué)的研究（四）代謝分型的應(yīng)用（五）內(nèi)源性物質(zhì)測(cè)定 10五、體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)1干擾雜質(zhì)多2樣品濃度低3取樣量少4工作量大5時(shí)間短6有一定設(shè)備11六、體內(nèi)藥物分析的發(fā)展1國(guó)外發(fā)展概況60年代初發(fā)現(xiàn)藥效與血藥濃度關(guān)系70年代體內(nèi)藥物分析方法建立80年代至今發(fā)展迅猛，新儀器不斷涌現(xiàn)書籍出版Drug Level Monitoring1980Therapeutical Drug Monitoring1981Textbook of

4、Biopharmaceutic Analysis1981 122國(guó)內(nèi)情況 80年代初，藥物分析工作者倡導(dǎo)，1980年版藥物分析教材中納入部分內(nèi)容，第二、三版增加體內(nèi)藥物分析一章。第四版、第五版取消，各學(xué)校開(kāi)設(shè)體內(nèi)藥物分析課程。 80年代開(kāi)始在醫(yī)院進(jìn)行臨床藥學(xué)工作，主要測(cè)定藥物濃度。13有關(guān)書籍吳如金體內(nèi)藥物分析人衛(wèi)版1984陸明廉血藥濃度測(cè)定與臨床應(yīng)用上?？萍?986陳剛治療藥物監(jiān)測(cè)理論與實(shí)踐人民軍醫(yī)1988吳萊文治療藥物監(jiān)測(cè)人衛(wèi)版 1989曾經(jīng)澤生物藥物分析 北京大學(xué)出版社 1998姚彤煒體內(nèi)藥物分析浙大2001張君仁體內(nèi)藥物分析 化學(xué)工業(yè)出版社2002143學(xué)科前沿 游離藥物濃度測(cè)定 直接

5、進(jìn)樣方法研究 代謝物測(cè)定 對(duì)映體分析15第二章 體內(nèi)藥物存在的狀態(tài)與 體內(nèi)藥物分析的關(guān)系一、藥物的體內(nèi)變化 吸收分布代謝排泄 ADME過(guò)程 發(fā)生兩種變化 物理變化 可逆變化 化學(xué)變化 結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生變化16二、藥物與血漿蛋白的結(jié)合1游離型藥物與結(jié)合型藥物（非特異性的結(jié)合）在血漿、組織中均存在游離型和結(jié)合型的藥物尿液中含微量P，血漿中含大量P，唾液中P為血漿1/10與藥物 結(jié)合的蛋白主要有白蛋白，a1-酸性糖蛋白、脂 蛋白 弱酸性藥物主要與白蛋白結(jié)合 弱堿性藥物與白蛋白、a1-酸性糖蛋白結(jié)合藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合通過(guò)共價(jià)鍵（氫鍵，離子間靜電力等）172血漿蛋白結(jié)合率Df+P Db K= 解離常數(shù)血漿

6、蛋白結(jié)合率： = =PDfDbDbDb+Df11+K/np+Df/np18 結(jié)合力強(qiáng)的藥物可以置換結(jié)合力弱的藥物，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)蛋白是藥物相互作用類型之一。由此可見(jiàn)，K、np是影響的重要因素 np K 藥物在足夠高濃度時(shí)使結(jié)合部位飽和，濃度再增高，多余的藥物均呈游離狀態(tài)，結(jié)合部分比率降低，藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥代動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)之一。 193血漿蛋白結(jié)合的測(cè)定平衡透析法、超濾法、凝膠過(guò)濾法、光譜法等。（1）平衡透析法 原理 計(jì)算= 100% =Ct-Cf/Ct100%袋內(nèi)-袋外袋內(nèi)藥物20注意事項(xiàng)a. 蛋白質(zhì)溶液 新鮮血漿 pH7.4，至少三個(gè)濃度測(cè)定b. 緩沖液 0.13mol/L磷酸鹽緩沖液，因

7、為Na3PO4 抑制酸性藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合c. 溫度與平衡時(shí)間 37 1648h 注意防腐劑加入，藥物的分解d. 透析袋 滲漏檢測(cè) 3%三氯醋酸e. 攪拌 保持動(dòng)態(tài)平衡21影響因素a. 藥物膜上吸附b. Donnan效應(yīng) 由于電荷的影響，可造成平衡時(shí)半透膜兩側(cè)游離藥濃不同，donnan效應(yīng)，加入中性鹽可消除。c. 空白值增加d. 緩沖液體積變化，水分進(jìn)入血漿 游離藥濃 此法用于測(cè)定藥物時(shí)，耗費(fèi)時(shí)間太長(zhǎng)，一般少采用22（2）超濾法原理 計(jì)算注意事項(xiàng) a裝置 50l5ml，選擇不同型號(hào)超濾膜，保濕。 b速度與時(shí)間 300010000r/min 515min c溫度 37，25，4影響因素 a膜吸附

8、b超濾液的體積 超濾液/總體積0.30.6 c超濾膜溫度23三、藥物與血漿蛋白結(jié)合對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響1血漿不同對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響 2平衡狀態(tài)不同對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響 3平衡狀態(tài)受破壞對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響4游離與結(jié)合同時(shí)出現(xiàn)時(shí)對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響24四、藥物代謝1研究藥物代謝的意義了解藥物在體內(nèi)的命運(yùn)及相互作用，保證臨床用藥安全 有效研究藥物代謝途徑、藥物結(jié)構(gòu)與藥理作用關(guān)系，尋找新 藥研究藥物相互作用機(jī)制有利于建立體內(nèi)藥物分析新方法，避免代謝物干擾252藥物代謝的途徑 第一相反應(yīng)：在酶作用下發(fā)生的氧化、還原、水解，使極性增加，水溶性增強(qiáng) 第二相反應(yīng)：藥物或經(jīng)一相反應(yīng)后的代謝物與葡萄糖醛酸、硫

9、酸鹽結(jié)合等，使分子極性進(jìn)一步加大，有利于從尿中排出，結(jié)合過(guò)程通常使藥物滅活。26 氧化反應(yīng) 還原反應(yīng) 水解反應(yīng) 結(jié)合反應(yīng) a葡萄糖醛酸結(jié)合 b硫酸酯化 c谷胱甘肽綴合 d乙?；Y(jié)合 e氨基酸結(jié)合27五、藥物代謝與體內(nèi)藥物分析的關(guān)系1樣品的保存 樣品可能會(huì)分解，如血漿酯酶可使酯類藥物水解，酶類可使藥物繼續(xù)代謝，加入酶抑制劑和冷藏保存。2分析方法選擇 光譜法 色譜法 免疫法3樣品的提取、分離法 代謝物極性大、水溶性強(qiáng)，pH緩沖系統(tǒng)分開(kāi) 尿液中藥物多以結(jié)合型存在，要進(jìn)行水解（酸水解、酶水解，溶劑解）28第三章 生物樣品的預(yù)處理一、生物樣品的采集與貯藏 體內(nèi)藥物分析常用的分析品種有血液、尿液、唾液，也

10、可用乳汁、淚液、腦脊液、膽汁等。29（一）樣品的采集1血樣 血樣濃度與作用點(diǎn)的濃度密切相關(guān)，可以反映靶器官的濃度。 血細(xì)胞血漿（plasma）血小板血清（serum）血細(xì)胞測(cè)定血樣中平均分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的藥濃抗凝自然全血血液302尿樣 目的：藥物劑量回收，藥物清除，藥物代謝和生物利用度 特點(diǎn)：濃度高，易于收集，體內(nèi)代謝研究，應(yīng)水解分 離3唾液 唾液中藥濃與血濃相關(guān)性 收集方法 離心 收集31（二）樣品的貯藏1血樣（血漿、血清）及時(shí)分離冷藏， -70加入穩(wěn)定 劑NaF2尿樣 尿中水、無(wú)機(jī)鹽、尿素等細(xì)菌的生長(zhǎng)， 4保存 加入防腐劑 a1%甲苯 b飽和氯仿 cpH改變3唾液：同血樣32二、生物樣

11、品的預(yù)處理（一）預(yù)處理的目的 存在形式的多樣性 游離 結(jié)合 代謝物 濃度低，雜質(zhì)多（分離濃縮） 出現(xiàn)渾濁和沉淀 與試劑起反應(yīng) 影響色譜柱壽命33（二）處理方法選擇的一般原則1藥物理化性質(zhì) pKa 親脂性 揮發(fā)性 溶解度 光譜特征 穩(wěn)定性2濃度范圍 靈敏的方法3測(cè)定的目的 定性 定量 母體 代謝4生物樣品的種類5樣品處理與分析方法的選擇 專一性 靈敏性34（三）生物樣品去蛋白處理1加入與水能混溶的有機(jī)溶劑及中性鹽 甲醇 乙腈 甲醇1:2 乙腈1:1.5 （NH4）2SO4 NaCl2加入酸性沉淀劑 三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等 使蛋白質(zhì)分子的陽(yáng)離子形成不溶性鹽而，pH低于等電點(diǎn)353組織酶消化法加

12、入酶使蛋白質(zhì)水解優(yōu)點(diǎn)：平衡條件下進(jìn)行，可避免反應(yīng)和降解 可改善對(duì)蛋白結(jié)合率強(qiáng)的藥物的回收率 不產(chǎn)生乳化4其他 加熱 超濾 36（四）生物樣品綴合物水解1酸水解 2酶水解 -葡萄糖醛酸苷酶 芳基硫酸酯酶 混合酶 pH4.5-7.0 373溶劑解 某些藥物的硫酸酯，往往加入率取溶劑時(shí)發(fā)生分解，同時(shí)提取有機(jī)溶劑中37（五）生物樣品的萃取1液-液萃?。?）優(yōu)點(diǎn)：與雜質(zhì)分離 簡(jiǎn)便 濃集 提取率高（2）提取率：在有機(jī)相與水相中的溶解度的比值分配系數(shù)，一般少量多次，對(duì)生物樣品一般一次萃取， 70%重現(xiàn)性38（3）影響提取率的因素 pH 堿性藥物在堿性pH 酸性 酸性pH 提取溶劑 相似相溶原理 沸點(diǎn)低，不影

13、響檢測(cè),性質(zhì)穩(wěn)定，不起化學(xué)反應(yīng) 離子強(qiáng)度 加入中性鹽 增加離子強(qiáng)度，與水結(jié)合強(qiáng)，便于有機(jī)溶劑提取 39（4）離子對(duì)提取對(duì)于離子性特強(qiáng)，水溶性極大的藥物，可采用離子對(duì)提取原理應(yīng)用陰離子：COOH+ SO3H- 反離子 四丁基銨陽(yáng)離子：NH2+ 反離子烷基或芳基磺酸鹽（5）提取技術(shù) 一般在試管中進(jìn)行 有機(jī)相與水相比1:1或2:140（6）乳化問(wèn)題措施 輕緩振搖 含有分散度大或不溶物應(yīng)過(guò)濾掉 避免在高pH條件下，從水中提取藥物 避免使用易發(fā)生乳化的溶劑 萃取劑水中加入少量NaCl41破孔方法 機(jī)械法 加入少量高級(jí)脂肪醇 改變表面張力 改善混合溶劑比例，增加分散相分?jǐn)?shù)42（7）藥物的吸附玻璃容器吸附

14、1%三甲一氯硅烷 10%二甲二氯硅烷血漿 432液固萃取固相萃取solid phase extraction SPE針管式 抽空減壓 加壓 過(guò)濾44（1）固相萃取步驟固相選擇 樣品1ml 1ml規(guī)格固相 125ml 3ml規(guī)格固相固相處理 反相C18 固定相的610倍體積甲醇洗柱，使溶劑化 610倍水緩沖服液沖洗達(dá)分離狀態(tài)上樣分離 用適當(dāng)?shù)娜跞軇┫礈?洗去雜質(zhì)，通N2干燥固相洗脫待測(cè)物 改變pH或極性 45（2）影響固相萃取的因素（1）流速 流速快，按觸不充分，樣品流失 回收率低 柱處理 510mlmin-1 洗脫 0.21mlmin-1（300mg 25mlmin-1（300mg）（2）裝樣

15、 過(guò)載 突破性試驗(yàn) 已知濃度樣品液 小體積上柱洗脫回收百分率 加大體積洗脫回收百分率 繪圖 當(dāng)回收率下降時(shí)為過(guò)載 46（六）生物樣品的組分濃集（七） 衍生化處理 GC衍生化 HPLC衍生化47第四章 體內(nèi)藥物分析方法的建立與評(píng)價(jià)一、分析方法根據(jù)藥物理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)特征，藥物濃度，干擾成分大小，實(shí)驗(yàn)?zāi)康?8二、分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù)方法的建立原始方法改進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)立方法491做好文獻(xiàn)總結(jié)2充分了解藥物特征及體內(nèi)狀況 pH、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、藥動(dòng)學(xué)參數(shù)、體內(nèi)代謝情況3明確測(cè)定目的、要求目的4結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件 設(shè)備條件 預(yù)處理方法藥濃監(jiān)測(cè)藥代動(dòng)力學(xué)研究母體藥物和代謝物50三、分析方法的建立1純品進(jìn)

16、行測(cè)定 確定線性范圍、靈敏度、反應(yīng)條件（pH、t、T）2空白樣品測(cè)定 確定空白樣品是否有干擾3以水代替空白樣品，加標(biāo)準(zhǔn)液后測(cè)定 了解提取率、檢測(cè)濃度 確定萃取條件、pH、揮發(fā)濃縮等4空白樣品加入標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 回歸方程 回收率5實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)定 51四、分析方法的評(píng)價(jià)可行性和可靠性 1準(zhǔn)確度 accuracy 測(cè)定結(jié)果與真實(shí)性的差異 用回收率表示 接近100% 相對(duì)恒定52絕對(duì)回收率也稱萃取回收率、提取回收率測(cè)定血漿樣品中藥物濃度/相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液=絕對(duì)回收率考慮3個(gè)濃度（高、中、低） 分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線成上、中、下一般要求絕對(duì)回收率在70%一般方法HPLC內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)法時(shí)注意：藥物與內(nèi)標(biāo)用各自

17、外標(biāo)法測(cè)定回收率應(yīng)相近，差值10%53相對(duì)回收率方法回收率藥物系列濃度+血樣標(biāo)準(zhǔn)曲線取高、中、低三濃度加入到空白血漿中，處理后測(cè)定，與加入標(biāo)準(zhǔn)量相比，得方法回收率，測(cè)定值15%，定量限20%54注意問(wèn)題： a加入藥量與實(shí)際測(cè)定值相近 b加入物與實(shí)際存在狀態(tài)相近 c空白試驗(yàn) 與已確定方法進(jìn)行比較552精密度precision標(biāo)準(zhǔn)差SD相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)性偏差 RSD不大于15%，定量限不大于20% 日間精密度日內(nèi)精密度563靈敏度（sensitivity） 檢測(cè)的最小量（1）檢測(cè)限（LOD） 從背景中檢測(cè)到的最小藥物濃度：S/N3的絕對(duì)量 LOD=3N/S （N噪間 S被測(cè)物信號(hào)/單位重量）N=1mm 取2gml樣品，20l進(jìn)樣 峰度30mm LOD=4ng57（2）定量限(LOQ) 在一定精密度和準(zhǔn)確度前提下求得最低檢測(cè)量，通常以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)作為一定量限，也可S/N=10作為定量限，實(shí)際測(cè)定時(shí)，滿足35個(gè)半衰期濃度，或Cmax1/101/2058（3）最低檢測(cè)濃度可以進(jìn)行定量測(cè)定的某一藥物的最低濃度，它與樣品體積大小等因