反向遺傳學(xué)以及其相關(guān)技術(shù)_第1頁
反向遺傳學(xué)以及其相關(guān)技術(shù)_第2頁
反向遺傳學(xué)以及其相關(guān)技術(shù)_第3頁
反向遺傳學(xué)以及其相關(guān)技術(shù)_第4頁
反向遺傳學(xué)以及其相關(guān)技術(shù)_第5頁
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文檔簡介

1、關(guān)于反向遺傳學(xué)及其相關(guān)技術(shù)第一張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月一、概述(一)遺傳研究的二條途徑1、表里:正向遺傳學(xué)研究雜交或誘變表型觀察遺傳規(guī)律確定存在的基因及數(shù)目基因的功能及作用性質(zhì)。這一途徑是從生物體的性狀、表型變化來研究遺傳物質(zhì)的組成、分布與傳遞規(guī)律,屬于正向遺傳學(xué)采用的研究方法。第二張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月2、里表:反向遺傳學(xué)研究在已知DNA序列的基礎(chǔ)上,通過DNA重組、定點突變、插入/缺失等遺傳修飾手段創(chuàng)造突變體并研究突變所造成的表型效應(yīng),從而研究基因的生物學(xué)功能,闡明生命的本質(zhì)現(xiàn)象與規(guī)律。與反向遺傳學(xué)相關(guān)的遺傳操作技術(shù)為反向遺傳學(xué)技術(shù)。第三張,PPT共七

2、十五頁,創(chuàng)作于2022年6月(二)RNA病毒的反向遺傳學(xué) 采用病毒的遺傳材料,在培養(yǎng)細(xì)胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或類似病毒物質(zhì)。 能夠拯救病毒的遺傳材料稱為感染性克隆,一般是在細(xì)菌質(zhì)粒中含有整個病毒基因組的cDNA拷貝,使得cDNA本身或從cDNA體外轉(zhuǎn)錄所得的RNA具有感染性。 RNA病毒的反向遺傳系統(tǒng)通過定向修飾病毒的基因組序列,檢測被拯救的人工改造病毒的表型,可以在體內(nèi)(in vivo)有效地研究病毒基因結(jié)構(gòu)、功能和病毒-宿主相互作用。 第四張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月RNA病毒的反向遺傳操作 RT-PCR構(gòu)建RNA病毒的全長cDNA,并進(jìn)行遺傳修飾 與RNA聚合酶啟動

3、子結(jié)合 體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA 轉(zhuǎn)錄物RNA感染哺乳動物細(xì)胞 拯救到活病毒 拯救病毒的表型變化 病毒基因組的表達(dá)、調(diào)控、致病機(jī)理、 病毒與宿主細(xì)胞互作、疫苗制造等第五張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月單正股RNA病毒:RNA聚合酶+mRNA + +中間型 結(jié)構(gòu)蛋白+子代正股RNA單負(fù)股RNA病毒:RNA聚合酶 +結(jié)構(gòu)蛋白子代負(fù)股RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒:RNARNA/DNA中間體逆轉(zhuǎn)錄酶DNA/DNA宿主子代RNA正股RNA與負(fù)股RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒?第六張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月(三)真核生物的反向遺傳學(xué)采用反向遺傳學(xué)鑒定基因功能是真核生物功能基因組學(xué)的主要內(nèi)容。研究手段包括基

4、因的互補(bǔ)實驗、超表達(dá)、反義抑制、基因敲除/基因打靶、基因陷阱、基因激活等手段。利用基因敲除或基因沉默而產(chǎn)生的功能變化研究基因功能是主要的反向遺傳學(xué)技術(shù)。第七張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月二、反向遺傳學(xué)相關(guān)技術(shù)1、基因的同源重組2、基因的位點突變3、基因沉默基因敲除第八張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月利用DNA轉(zhuǎn)化技術(shù),將含有目的基因和靶基因同源片段的重組載體導(dǎo)入靶細(xì)胞,通過載體與靶細(xì)胞染色體上同源序列間的重組,將外源基因整合入內(nèi)源基因組內(nèi),使外源基因得以表達(dá)。通過研究靶細(xì)胞或者個體在目的基因插入前后遺傳特性的改變,達(dá)到研究基因功能的目的。1、基因的同源重組第九張,PPT共

5、七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月完全敲除:通過同源重組直接將靶基因在細(xì)胞或者動物個體中的活性完全消除。條件敲除:將某個基因的修飾限制于特定類型的細(xì)胞或個體發(fā)育特定的階段。完全敲除條件敲除特定組織/時間基因敲除基因敲除第十張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月1)通過同源重組的基因敲除步驟構(gòu)建重組載體 重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi) 篩選目的細(xì)胞 轉(zhuǎn)基因生物重組載體的類型:a)替換性載體系統(tǒng):包括同源序列片段、替換基因的啟動子、報道基因等成分。b)插入性載體系統(tǒng):插入基因片段(目的基因)、同源序列片段、標(biāo)志基因片段。第十一張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月用替換型(a)或插入型(b)載體進(jìn)

6、行完全基因敲除實驗第十二張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月2)Res同源重組系統(tǒng)源于噬菌體Res重組酶的重組系統(tǒng)Ha 和Hb: 同源重組區(qū)域 Pa 和Pb: 引物位點sm: 篩選標(biāo)記Red 同源重組技術(shù)用于基因打靶第十三張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月3)Cre-LoxP同源重組系統(tǒng) 源自P1噬菌體的重組系統(tǒng) 屬于傳統(tǒng)的同源重組載體,但具有時空調(diào)控的功能。該系統(tǒng)由P1噬菌體的Cre重組酶和LoxP位點兩部分組成。Cre重組酶:由Cre基因編碼,識別LoxP位點,介導(dǎo)兩個LoxP位點(序列)之間的特異性重組,使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。LoxP位點:由2個13bp的

7、反向重復(fù)序列和1個8bp的間隔區(qū)域構(gòu)成。第十四張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月Cre酶 Cre酶 Cre酶 Cre重組酶13bp的反向重復(fù)序列 第十五張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月Cre-LoxP 重組系統(tǒng)的特點CreCre Cre 重組酶所催化的是一個可逆的重組事件 Cre催化重組不需要任何輔助因子的參與介導(dǎo)兩個同向LoxP位點之間序列的插入/缺失(下左)介導(dǎo)兩個反向LoxP位點之間序列顛倒(下右)介導(dǎo)兩條含LoxP位點DNA鏈的交換或染色體易位。 第十六張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月Cre-Loxp gene knock-out system第十七張,PP

8、T共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月4) 高等動物基因敲除技術(shù)真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重組基因載體,用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中,使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組,將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。顯微注射命中率較高,技術(shù)難度相對大些。電穿孔法命中率比顯微注射低,操作使用方 便。胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。第十八張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月模式動物小鼠中完全基因敲除的步聚近交系,白色,易產(chǎn)生免疫缺陷 第十九張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月2、基

9、因的位點突變1)點突變TILLING技術(shù)TILLING (targeting induced local lesions in genomes) 定向誘導(dǎo)基因組局部突變,是一種快速有效地從由化學(xué)誘變劑(EMS)誘變過的突變?nèi)后w中鑒定出點突變的方法。 先用化學(xué)誘變劑(甲基磺酸乙酯,EMS)誘發(fā)產(chǎn)生一系列的點突變,再用設(shè)計的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性和退火形成異源雙鏈核酸分子,再用特異切割錯配的內(nèi)切酶CELl酶切,最后變性處理后采用雙色聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳檢測分析。第二十張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月(建池)第二十一張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022

10、年6月第二十二張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月TILLING特點: TILLING技術(shù)屬于高頻率點突變和PCR篩選相結(jié)合的技術(shù),可發(fā)現(xiàn)基因的錯義突變、基因截短型損傷等突變類型。可獲得大量的等位基因系列,對長度很小基因,復(fù)等位基因等具有獨特的技術(shù)優(yōu)勢。可誘導(dǎo)產(chǎn)生高頻率的點突變,篩選目的基因需要較小的突變?nèi)后w。不依賴于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或內(nèi)源標(biāo)簽系統(tǒng),無需耗時的轉(zhuǎn)基因和復(fù)雜的組織培養(yǎng)。需要知道所研究基因的序列。第二十三張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月2)隨機(jī)插入突變T-DNA插入突變 以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的一種插入突變研究方法,根據(jù)插入位點的基因序列與植物表型變異等的相互關(guān)系可

11、以從基因組中分離出相應(yīng)的基因并鑒定其功能。構(gòu)建T-DNA載體轉(zhuǎn)化突變體的篩選及遺傳分析分離T-DNA 插入位點的側(cè)翼序列基因的定位、結(jié)構(gòu)與功能分析。第二十四張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月T-DNA法敲除植物基因及突變體篩選: a.引物設(shè)計。LP和RP分別代表插入基因兩端的引物,LB是指載體上的一段 引物。旁鄰序列是經(jīng)測序后獲得的DNA序列。 b. PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。分別代表野生型、雜合子和純合子PCR條帶。第二十五張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月T-DNA插入特點:不能控制其在生物體基因組中的插入位點。在植物中用T-DNA 插入來敲除一個特定基因仍需要運(yùn)氣。隱性突變與顯

12、性突變:隱性表型的變化只能在轉(zhuǎn)化體的部分后代中體現(xiàn)出來(基因敲除);顯性可以在轉(zhuǎn)化體中直接觀察到(基因激活)。某些特定基因,由于其特性在基因敲除后并不體現(xiàn)出功能的喪失。原因:重要的功能基因突變致死和冗余基因。染色體重排:突變體表型與T-DNA 插入無關(guān)。效率不高,工作量大。建立飽和的突變體庫。第二十六張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)座子插入突變利用某些能隨機(jī)插入基因序列的轉(zhuǎn)座子,在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變,建立一個攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫,然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。由轉(zhuǎn)座子引起的突變可以轉(zhuǎn)座子DNA為探針,從突變體的基因組DNA文庫中篩選到突變的基因

13、,再利用這部分序列從野生型基因文庫中獲得完整的基因。也可以利用PCR的方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列,進(jìn)而得到完整的基因信息。第二十七張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)座子插入特點:插入的是完整的元件,便于分析??蓮牟迦胛稽c切除,產(chǎn)生回復(fù)突變,因此不僅可以據(jù)此確認(rèn)真正由轉(zhuǎn)座子引起的突變,還可以進(jìn)一步驗證突變基因的功能。轉(zhuǎn)座子傾向于插入轉(zhuǎn)座子的臨近區(qū)域,可以用來研究基因組某一局部區(qū)域的結(jié)構(gòu)。通過不斷跳動產(chǎn)生新的突變,相對較少的起始轉(zhuǎn)化系就可以獲得整個基因組的飽和突變,大大減少了工作量。可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化效率不高的植物。第二十八張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)Ac/ Ds 系統(tǒng)

14、 由自主性元件(Ac)和非自主性元件(Ds)構(gòu)成。Ds元件能夠在Ac編碼的轉(zhuǎn)座酶的作用下移動,去除Ac元件可使其自身不能轉(zhuǎn)座。 通過遺傳雜交引入自主性元件,轉(zhuǎn)座子插入序列可以重新移動。因此,Ac/Ds 轉(zhuǎn)座子插入系統(tǒng)只需要少量的轉(zhuǎn)基因品系(啟動品系)作為轉(zhuǎn)座源即可。第二十九張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月在真核系統(tǒng)中,轉(zhuǎn)座插入事件常不能產(chǎn)生可見的表型,這是因為功能基因的冗余或在早期產(chǎn)生致死效應(yīng)。采用經(jīng)修飾的轉(zhuǎn)座子可克服這些困難。修飾:轉(zhuǎn)座因子后帶一個報告基因,報告基因的表達(dá)只有在轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的情況下才能獲得,這樣就可以通過報告基因來檢測轉(zhuǎn)座子的表達(dá)情況。修飾的Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)第三

15、十張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月增強(qiáng)子陷阱( enhancer trap ):轉(zhuǎn)座子含有一個具弱小啟動子驅(qū)動的報告基因。報告基因的表達(dá)只有在轉(zhuǎn)座發(fā)生在內(nèi)源增強(qiáng)子附近時才能獲得。啟動子陷阱(promoter trap):轉(zhuǎn)座子帶有一個無啟動子的報告基因,這個基因只有在轉(zhuǎn)座子插入一個植物活躍的內(nèi)源啟動子下游時才能表達(dá)。修飾的方法-增強(qiáng)子陷阱與啟動子陷阱第三十一張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月Mu轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)座子打靶載體是以兩種噬菌體Mu為基礎(chǔ)的mini-Mu轉(zhuǎn)座子,每個轉(zhuǎn)座子上都攜帶標(biāo)記基因。可以在擬刪除基因兩側(cè)各插入一個mini-Mu轉(zhuǎn)座子,然后在兩個插入位點之間制造缺失。

16、這種缺失可以使兩個轉(zhuǎn)座子加上靶區(qū)之間的部分基因轉(zhuǎn)移。特點:不需要知道基因組序列,僅已知外顯子即可載體構(gòu)建迅速,技術(shù)簡單載體可以攜帶多種不同抗性基因,可以同時處理多基因。第三十二張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月三、基因沉默技術(shù) 反義RNA RNA干擾(RNAi)第三十三張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月反義RNA技術(shù)反義RNA技術(shù)是根據(jù)RNA序列人工合成的互補(bǔ)RNA。根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將其分為三類:1、反義RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白體結(jié)合位點或與靶mRNA直接結(jié)合形成雙鏈RNA,從而直接抑制mRNA的翻譯或被RNA酶識別降解。2、反義RNA是與mRNA的非編碼

17、區(qū)結(jié)合,引起mRNA構(gòu)象的變化,從而抑制其翻譯。3、反義RNA是作用于基因的啟動子,直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。第三十四張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月(一)概念RNA干擾(RNA interference,RNAi):與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導(dǎo)的一種序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。RNA干擾第三十五張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月基因沉默轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)基因沉默第三十六張,PPT共七十五

18、頁,創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(TGS)是指基因在細(xì)胞核內(nèi)RNA合成受到了阻止而導(dǎo)致基因沉默。轉(zhuǎn)錄水平基因沉默可以通過有性世代傳遞,表現(xiàn)為減數(shù)分裂的可遺傳性。引起轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的機(jī)制主要有以下幾種: 基因及其啟動子甲基化:通常發(fā)生在DNA的CG序列的堿基上,該區(qū)域堿基甲基化往往導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受抑制。 同源基因間的反式失活:擁有同源序列的沉默位點和其他位點的DNA的相互作用而引起的基因沉默。甲基化并失活的基因能作為一種“沉默子”,對其他具有同源性的靶基因施加一種反式作用,使具有同源序列的靶基因發(fā)生甲基化并導(dǎo)致失活。反式失活的靶基因既可以與沉默基因是等位基因,也可以是非等位基因。 第三十七

19、張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月后成修飾作用導(dǎo)致的基因沉默:指轉(zhuǎn)基因的序列和堿基組成不發(fā)生改變,但是其功能卻在個體發(fā)育的某一階段受到細(xì)胞內(nèi)因子的修飾作用后而關(guān)閉。這種修飾作用所造成的轉(zhuǎn)基因沉默是可以隨著修飾作用的解除而被消除。后成修飾作用導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因沉默與受體植物的核型構(gòu)成有關(guān)。重復(fù)序列:外源基因如果以多拷貝形式整合到同一位點上,形成首尾相連的正向重復(fù)或頭對頭、尾對尾的反向重復(fù),則不能表達(dá),而且拷貝數(shù)越多,基因沉默現(xiàn)象越嚴(yán)重。這種重復(fù)序列誘導(dǎo)的基因沉默可能是重復(fù)序列間自發(fā)配對,甲基化酶特異性識別這種配對結(jié)構(gòu)而使其甲基化,從而抑制其表達(dá)。第三十八張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6

20、月轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默(PTGS)則是指基因能夠在細(xì)胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄,但在細(xì)胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的mRNA存在的現(xiàn)象。引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制主要有以下幾種:共抑制:由Napoli在轉(zhuǎn)CHS基因的矮牽?;ㄖ邪l(fā)現(xiàn),普遍存在于轉(zhuǎn)基因植物中。其發(fā)生是由于外源基因編碼區(qū)與受體細(xì)胞基因間存在同源性而導(dǎo)致外源基因與內(nèi)源基因的表達(dá)同時受到抑制。 具有同源性的外基因和內(nèi)源基因在細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄速率很高,但在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無mRNA積累,是典型的轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默。共抑制的產(chǎn)生不僅同內(nèi)、外源基因間編碼區(qū)的同源性有關(guān),還與控制外源基因的啟動子的強(qiáng)度等因素有關(guān)。 第三十九張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月基因壓制:C

21、ogoni等首先在粗糙脈孢霉的轉(zhuǎn)化實驗中發(fā)現(xiàn),外源基因可以抑制自身和相應(yīng)內(nèi)源基因的表達(dá),他們把這一現(xiàn)象定為基因壓制?;驂褐剖强赡娴?,而且這種逆轉(zhuǎn)會伴隨有外源拷貝的丟失。基因壓制發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平,導(dǎo)致已復(fù)制的穩(wěn)定態(tài)mRNA大量減少。 RNA干擾:指將與靶基因的mRNA同源互補(bǔ)的雙鏈RNA (dsRNA) 導(dǎo)入細(xì)胞后并被切割成2123個核苷酸長度的短核苷酸雙鏈,在其它作用因子的參與下能夠特異地與其同源的mRNA結(jié)合并導(dǎo)致其降解,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。 第四十張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月RNAi 一種新的遺傳工具RNAi是植物、果蠅、線蟲和包括哺乳動物在內(nèi)的許多生物抵抗病毒感染

22、和限制轉(zhuǎn)座子運(yùn)動的一種自然存在的防御機(jī)制。RNAi可以作為一種簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具,來制備特定基因缺失表型的個體,從而研究該基因的功能. 這項技術(shù)在疾病的基因治療上也有光明的應(yīng)用前景。特別可以用于阻斷某些突變基因的表達(dá),或者由蛋白過量表達(dá)引起的疾病。 第四十一張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月(二)、RNA干擾的發(fā)現(xiàn) 1994年 Cogoni等證明真菌中亦有類似現(xiàn)象,此稱為基因壓制(quelling)。共抑制現(xiàn)象(cosuppression) 上世紀(jì)90年代初,美國和荷蘭的兩個轉(zhuǎn)基因植物實驗組在對矮牽牛(petunias)的研究中發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒有新基因表達(dá),反而

23、使原有的色素基因也受到了抑制。第四十二張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月1995年,康乃爾大學(xué)的Su Guo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(C.elegans)的par-1基因?qū)嶒炛邪l(fā)現(xiàn):反義RNA與正義RNA(對照)都能切斷par-1基因的表達(dá)。該研究小組一直未能給這個意外以合理解釋。 Guo S, Kemphues KJ, Par L. Cell, 1995,81:611-620.秀麗新小桿線蟲轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灧戳xRNA與正義RNA?反義RNA -與靶核酸(如mRNA或有義DNA)鏈互補(bǔ)的RNA分子,可抑制靶核酸的功能。 正義RNA-與mRNA對應(yīng)的RNA分子。第四十三張,PPT共七十五頁

24、,創(chuàng)作于2022年6月RNA干擾的發(fā)現(xiàn) 1998年,F(xiàn)ire和Mello(美)首次在秀麗新小桿線蟲中證明上述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。他們發(fā)現(xiàn)Su Guo博士遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象,以及過去的反義RNA技術(shù)對基因表達(dá)的阻斷,都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起:將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲,基因抑制效應(yīng)變得十分微弱,而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反,能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá),其抑制基因表達(dá)的效率比純化后的反義RNA至少高2個數(shù)量級。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾。 Fire A, Xu S, Montgomery ME, et al. Na

25、ture. 1998,391:806-811.第四十四張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (對照,缺mex-3 ,不著色)(B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (正常野生型,紫)(C) Embryo from parent injected with purif

26、ied mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (野生型+反義RNA,淺紫)(D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA

27、and in situ probes were largely non-overlapping.) (野生型+雙鏈RNA,不著色)Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization (原位雜交)of 4-cell stage embryos. 第四十五張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月“沉默”是金Fire與Mello獲2006年諾貝爾獎第四十六張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月在1999年一年

28、內(nèi),發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物細(xì)胞中。2000年,又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在RNA干擾現(xiàn)象。2000年提出RNAi作用機(jī)制模型。Hannond SM et al. Nature, 2000, 404(6775):293-296Zamore PD. Cell, 2000,101(1):25-332001年,RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象。Nature,2001,411(6836):494498RNAi技術(shù)被Science評為2001年度的十大科技進(jìn)展之一。第四十七張,PPT共七十

29、五頁,創(chuàng)作于2022年6月2002年5月,Lindenbach(美),雙鏈RNA艾滋病病毒細(xì)胞減少艾滋病病毒基因表達(dá)90%以上。2002年7月,Novina等用RNAi技術(shù)實現(xiàn)了HIV1病毒的阻抑。2002年7月, McCaffrey(美)等人, 雙鏈RNA+肝炎病毒-標(biāo)志基因鼠肝臟抑制標(biāo)志基因的表達(dá)/肝炎病毒基因的表達(dá)。利用RNAi可以直接和有效地起到抗病毒的作用。第四十八張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月共抑制、基因壓制和RNAidsRNA降解靶mRNA抑制靶基因的表達(dá)。均屬于PTGS!dsRNA導(dǎo)入線蟲RNAi ;dsRNA注射線蟲體腔RNAi ;dsRNA浸潤線蟲/dsRNA的

30、工程菌喂養(yǎng)線蟲RNAi。dsRNA導(dǎo)入植物RNAi;同樣,dsRNA注射植物韌皮部RNAi;吸附500bp基因片段的金屬片插入植物侵入點組織發(fā)生RNAi。RNAi普遍存在于各種生物中,具有抗病毒、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子及監(jiān)控異常表達(dá)mRNA的生物學(xué)功能。第四十九張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月(三)、RNA干擾的機(jī)制 dsRNA:雙鏈RNA,包含正義鏈和反義鏈。Dicer:屬于RNase 家族的一員,是dsRNA的特異性核酸內(nèi)切酶,能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA。siRNA (small interfering RNA) :小干擾RNA

31、,是長度為21-23個nt大小的雙鏈RNA,為RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子。名詞解釋:第五十張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月Dicer contains two RNAse III domainssiRNAslong dsRNA第五十一張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月siRNA第五十二張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月RISC(RNA-inducing silencing complex): RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物,是一種核蛋白復(fù)合物,具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活性。RdRP(RNA-dependent RNA polymerases): 依賴RNA的RNA聚合酶,是RN

32、Ai的調(diào)節(jié)因子,使RNAi可以在生物體內(nèi)傳遞。第五十三張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月RISC: RNA-Induced Silencing ComplexExonucleaseHomology search activityEndonucleaseHelicase53Target mRNAOH35P核酸外切酶 解旋酶 核酸內(nèi)切酶 第五十四張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月dsRNA介導(dǎo)的同源性靶mRNA降解過程主要分為兩步:第一步(起始階段)較長dsRNA在ATP參與下,被RNase的特異核酸酶切割加工成2123nt的,由正義和反義鏈組成的小干擾RNA(small inte

33、rfering RNA,siRNA)。 siRNA的兩條單鏈末端為5-磷酸和3-羥基,且3端均有2個突出的核苷酸。 Dicer有解旋酶活性并含有 dsDNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)域。Dicer的類似物相繼在擬南芥、秀麗線蟲及哺乳動物等機(jī)體中被發(fā)現(xiàn)。步驟第五十五張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月第二步(效應(yīng)階段)siRNA 在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈,并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)?;罨腞ISC在單鏈siRNA引導(dǎo)下識別互補(bǔ)的mRNA,并在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNA引導(dǎo)鏈中心所對

34、應(yīng)的靶基因位置切割靶mRNA,最后可能再被核酸外切酶進(jìn)一步降解,從而干擾基因表達(dá)。第五十六張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月RNAi的放大效應(yīng)機(jī)制siRNA不僅可引導(dǎo)RISC切割靶RNA,而且可作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA。新合成的長鏈dsRNA同樣可被RNase核酸酶切割、降解而生成大量的次級siRNA。次級siRNA又可進(jìn)入合成-切割的循環(huán)過程,進(jìn)一步放大RNAi作用。這種合成-切割的循環(huán)過程稱為隨機(jī)降解性PCR(random degradative PCR)。第五十七張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月Gisela

35、 Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.異常的單鏈RNA依賴RNA的RNA聚合酶特異性核酸內(nèi)切酶RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物第五十八張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制;RNAi具有很高的特異性:只有dsRNA才能誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi;只有針對編碼區(qū)的dsRNA才能產(chǎn)生有效的和特異性的干擾;注射同源dsRNA可以引起內(nèi)源性mRNA特異性的降解;dsRNA不得短于21個堿基,大于30bp的dsRNA不能在哺乳動物中誘導(dǎo)特異的RNA干擾,而是細(xì)胞非特異性和全面的基因表達(dá)受抑制凋亡; RNAi具有高效性: RNAi抑制基因表達(dá)

36、具有很高的效率,可達(dá)到缺失突變體表型的程度,而且相對很少量的dsRNA分子就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá),這是通過催化放大的方式進(jìn)行的;RNAi干擾的幾個重要生物學(xué)特征第五十九張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月RNAi具有很好的穩(wěn)定性:siRNA分子3端有突出的非配對堿基的雙鏈分子,在細(xì)胞內(nèi)可穩(wěn)定存在3- 4d,以3端懸垂TT堿基的雙鏈RNA尤為穩(wěn)定,半衰期遠(yuǎn)長于反義寡聚核苷酸。 RNAi的可傳播性和遺傳性:RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機(jī)體以及可遺傳給F1,但F2往往恢復(fù)為野生型。RNAi效應(yīng)的依賴性:只有連續(xù)產(chǎn)生dsRNA才能產(chǎn)生長期效應(yīng),否則只產(chǎn)生

37、短暫的沉默反應(yīng)。RNAi作用迅速,mRNA快速降解;第六十張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月miRNA及其作用機(jī)制miRNA(microRNA) : 微小RNA,指長度約2125nt的小分子單鏈RNA,位于基因組的非編碼區(qū),進(jìn)化上高度保守,可在翻譯水平上對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的RNA家族。其介導(dǎo)的沉默機(jī)制也屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。miRNA基因的表達(dá)具有特定模式: 階段特異性和組織特異性,在不同組織中表達(dá)有不同類型的miRNA,在生物發(fā)育的不同階段里有不同的miRNA 表達(dá)。第六十一張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月miRNA的作用機(jī)制第六十二張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6

38、月相同點:長度都約22 nt 左右;同是Dicer產(chǎn)物,因此具有Dicer產(chǎn)物的特點;二者生成都需Argonaute 家族蛋白的存在;同是RISC的組分。miRNA與siRNA比較第六十三張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月來源不同:siRNA來源于轉(zhuǎn)基因或病毒RNA,由長dsRNA轉(zhuǎn)變而來;miRNA來源于內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本,是細(xì)胞內(nèi)RNA的固有組分之一,由具有發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的pre-miRNA轉(zhuǎn)變而來;結(jié)構(gòu)不同:siRNA主要以雙鏈形式存在,其3端存在2個非配對的堿基,通常為UU;miRNA主要以單鏈形式存在;對靶RNA 的特異性不同: siRNA與靶mRNA完全互補(bǔ)配對結(jié)合;miRNA與靶RN

39、A并不完全互補(bǔ),存在錯配現(xiàn)象。靶序列有一個核苷酸突變,就會影響到siRNA的作用功能,但不會影響到miRNA的功能;作用形式不同:siRNA主要在轉(zhuǎn)錄后通過降解mRNA發(fā)揮作用,而miRNA只在蛋白質(zhì)翻譯水平上負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。不同點:第六十四張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月(四)、RNA干擾的研究方法 一般技術(shù)路線第六十五張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月(五)、RNA干擾的應(yīng)用 1.基因功能研究由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力,可以特異地使特定基因沉默,獲得功能喪失或降低突變,因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。已有研究表明RNAi能夠在哺乳

40、動物中抑制特定基因的表達(dá),制作多種表型,而且抑制基因表達(dá)的時間可以控制在發(fā)育的任何階段,產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比,這一技術(shù)具有投入少,周期短,操作簡單等優(yōu)勢,近來RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型的報道日益增多,標(biāo)志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。 第六十六張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月2.病毒性疾病的治療 使用RNAi技術(shù)來阻止艾滋病病毒進(jìn)入人體細(xì)胞。某研究小組設(shè)計合成的lenti病毒載體引入siRNA,激發(fā)RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5(化介素受體, HIV-1的輔因子)進(jìn)入人體外周淋巴細(xì)胞,而不影響另一種HIV

41、-1主要的coreceptor-CCR4,從而使以lenti病毒載體為媒介引導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了免疫應(yīng)答,由此治療HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。艾滋病第六十七張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月2.病毒性疾病的治療 Shlomai和Shaul設(shè)計了各針對HBV基因19nt的兩種pSUPER載體:pSUPER X-siRNA和pSUPER core-siRNA。已轉(zhuǎn)染含1.3 X wt HBV基因質(zhì)粒載體的Huh7細(xì)胞再被 X-siRNA或 core-siRNA轉(zhuǎn)染后,core蛋白水平分別降低了89%、63%,轉(zhuǎn)染X-siRNA的細(xì)胞中HBsAg降低60%,但轉(zhuǎn)染

42、core-siRNA對HBsAg表達(dá)無明顯影響(X-siRNA干擾沉默了所有的病毒轉(zhuǎn)錄物,而core-siRNA僅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA)。 HBV(乙肝病毒)第六十八張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月2.病毒性疾病的治療 Randall等證明了針對HCV RNA的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞4天后可使細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的HCV RNA降低80倍;將siRNA 轉(zhuǎn)染至已有HCV感染、復(fù)制的細(xì)胞,siRNA對98%以上可檢測到HCV抗原、HCV復(fù)制活躍的細(xì)胞有抑制作用;siRNA干擾沉默HCV RNA具有劑量依賴性和序列特異性。Kapadia等 也證明了siRNA特異抑制HCV RNA復(fù)制、阻止相關(guān)蛋白表達(dá)的作用。 HCV(丙肝病毒)第六十九張,PPT共七十五頁,創(chuàng)作于2022年6月

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