醫(yī)學(xué)資料6細(xì)胞核和線粒體的分離和觀察

1、細(xì)胞核與線粒體的分級分離 2021/7/18 星期日 1. 初步了解細(xì)胞內(nèi)各種成分的分離方法 2、掌握差速離心方法細(xì)胞核和線粒體的分離方法 3、對分離得到的細(xì)胞核及線粒體進(jìn)行活性鑒定。一、實驗?zāi)康?021/7/18 星期日細(xì)胞器分離基本步驟二、實驗原理細(xì)胞破碎分離、純化細(xì)胞器鑒定2021/7/18 星期日（一）細(xì)胞破碎的方法1.桿狀玻璃勻漿器法2.高速組織搗碎機(jī)法3.超聲波處理法4.化學(xué)裂介法5.反復(fù)凍融法二、實驗原理2021/7/18 星期日細(xì)胞破碎的注意事項：1、勻漿介質(zhì)：常用介質(zhì)是緩沖的蔗糖水溶液（0.25mol/L ）。它比較近細(xì)胞質(zhì)的分散相，具有足夠滲透壓，防止顆粒膨脹破裂，對酶活性

2、干擾小，在pH7.2-7.4的條件下細(xì)胞器不易發(fā)生聚集。2、盡可能在低溫條件下進(jìn)行，避免酶失活。 3、若是采用低滲方式破碎細(xì)胞，勻漿物在低滲溶液中的時間要越短越好，通常從開始收獲細(xì)胞到勻漿結(jié)束不要超過5分鐘。否則勻漿物在低滲溶液中時間太長，導(dǎo)致細(xì)胞器破裂，溶酶體酶泄漏，各種物質(zhì)降解。2021/7/18 星期日（二）分離純化的方法 根據(jù)細(xì)胞器的大小、形狀、密度等物理特性差異，離心成為亞細(xì)胞組分分離過程中最廣泛應(yīng)用的技術(shù) 離心是利用旋轉(zhuǎn)運動的離心力以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差異進(jìn)行分離、濃縮和提純的一種方法 主要包括差速離心、密度梯度離心等方法。二、實驗原理2021/7/18 星期日差速離心法

3、根據(jù)顆粒大小和密度的不同存在的沉降速度差別，分級增加離心力，從試樣中依次分離出不同組分的方法。從低速到高速逐級沉淀分離，一般用于分離沉降系數(shù)相差較大（10倍及以上）的顆粒。優(yōu)點是：操作簡單，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點是：分離效果差，不能一次得到純顆粒；須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化。壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時，在離心管一側(cè)會出現(xiàn)沉淀；顆粒被擠壓，離心力過大、離心時間過長會使顆粒變形、聚集而失活。2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日密度梯度離心下次課講2021/7/18 星期日（三）細(xì)胞器的鑒定分析 分析分級分離得到的組分，可

4、用細(xì)胞化學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。細(xì)胞器標(biāo)記酶的測定是評價細(xì)胞器內(nèi)膜組分和分離純度的主要依據(jù)，如線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色，從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色。（也可使用羅丹明123或MitoTracker等熒光探針標(biāo)記法等）細(xì)胞核：DNA亞甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、Hoechst染料等2021/7/18 星期日方法和步驟（一）細(xì)胞核的分離提取 1、肝臟，剪成小塊(去除結(jié)締組織)盡快置于盛有0.9NaCl的燒杯中，反復(fù)洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。 2、稱取肝組織1 g，剪碎；用預(yù)冷的0.25 molL蔗糖-0.05mol

5、L Tris-HCI緩沖液，pH7.4（0.25moll蔗糖0.003moll氯化鈣）溶液洗滌數(shù)次。2021/7/18 星期日 3、按每克肝加8ml-9ml預(yù)冷的0.25molL蔗糖 0.05m/L Tris-HCI溶液，用高速組織勻漿器勻漿（已完成） 4、取一定量勻漿液，在04冰浴中用玻璃勻漿器將肝再次勻漿（勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動研磨）（因已事先勻漿，本步驟研磨次數(shù)和時間可縮短） 5、肝勻漿用雙層紗布過濾，濾液制一張涂片,自然干燥.2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日6、濾液以2500rpm，離心15分鐘；(1)緩緩取上

6、清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待分離線粒體用；(2)同時涂一張上清液片做好標(biāo)記，自然干燥；(3)余下的沉淀物進(jìn)行下一步驟。2021/7/18 星期日7、用6ml 蔗糖一Tris-HCI溶液懸浮沉淀物，以2500rpm離心15分鐘棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，涂片，自然干燥。8、將、涂片用l甲苯胺蘭（或亞甲基藍(lán)）染色后蓋片即可觀察。2021/7/18 星期日（二）高速離心分離提取線粒體1、將裝有上清液的高速離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000g離心20分鐘，棄上清，留取沉淀物。（本實驗用12000rpm,非冷凍離心）2、加入蔗糖-Tris-Hcl 1ml，用吸管吹打成懸液，以17000g離心20分鐘，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物，加入0.1ml蔗糖-Tris-Hcl氯化鈣溶液混勻成懸液(可用牙簽)。2021/7/18 星期日3、取上清液和沉淀物懸液，分別滴一滴于干凈載玻片上(分別標(biāo)記、涂片)，各滴一滴1詹納斯綠b染液染20分鐘, 蓋片觀察。4、油鏡觀察。2021/7/18 星期日注意事項1、各步驟加入的溶液的量需根據(jù)離心管的大小自行調(diào)整。2、線粒體的染色必須先染色20分鐘后蓋蓋片，以便充分氧化。3、本實驗所有操作本應(yīng)在低溫下進(jìn)行，但實驗室的冷凍離心機(jī)損壞，用普通離心機(jī)離心，溫度和轉(zhuǎn)速