方琪-遺傳性肌肉疾病的診斷方法和策略

1、遺傳性肌肉疾病的診斷方法和策略方 琪蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 副院長博士生導(dǎo)師、 教授、 主任醫(yī)師肌病分類肌營養(yǎng)不良先天性肌病:中央軸空病、桿狀體肌病、還原體肌病等遺傳性包涵體肌病代謝性肌病糖原累積病脂質(zhì)沉積病線粒體肌病內(nèi)分泌性肌病炎性肌病其它繼發(fā)于藥物、毒物等遺傳代謝性肌病獲得性肌病桿狀體肌病中央軸空病皮肌炎：束周萎縮征肌肉疾病的重要診斷方法1、臨床癥狀、體征 2、血生化檢驗(yàn)3、電生理檢查 4、肌肉MRI5、肌肉活檢病理 6、基因檢測MRI目前主要在炎性肌病 的診斷和病情評估中有很好的應(yīng)用。如多發(fā)性肌炎（PM）MRI表現(xiàn)：T1為等或低信號，T2為高信號T1相為等信號T2相為高信號肌活檢適應(yīng)癥：肌

2、肉疾病，脊髓前角或周圍神經(jīng)病，凡訴肢體無力、肌肉萎縮或肌肉疼痛者，都可送檢肌活檢的適應(yīng)癥肌源性：多發(fā)性肌炎、皮肌炎、包涵體肌炎、肌痛綜合癥等；肌營養(yǎng)不良者，肌紅蛋白尿等。肌活檢的適應(yīng)癥神經(jīng)源性：中樞性運(yùn)動神經(jīng)元病，脊髓性肌萎縮，青年單側(cè)上肢遠(yuǎn)端肌萎縮（平山?。┑?周圍性恢復(fù)緩慢的GBS，糖尿病性周圍神經(jīng)病、Isaacs綜合癥（也稱持續(xù)性肌纖維興奮或神經(jīng)性肌強(qiáng)直，已發(fā)現(xiàn)12號染色體基因突變，可導(dǎo)致周圍神經(jīng)鉀離子通道異常，表現(xiàn)為肌肉疼痛、抽搐、痙攣，卡馬西平對部分患者有效）肌活檢的適應(yīng)癥代謝和內(nèi)分泌性肌?。禾窃练e性肌病，脂肪沉積性肌病，線粒體肌病、甲亢性肌病等中毒性和外傷性肌肉病變：肌活檢可根據(jù)

3、萎縮的程度，同型肌纖維群化的多少，判斷受損神經(jīng)和肌肉的病變程度、范圍，并給出預(yù)后判斷NADH染色：同型肌纖維群組化ATP染色（PH9.3）：選擇性II型肌纖維萎縮肌肉活檢部位的選擇上肢重 選肱二頭肌下肢重 選股四頭肌外側(cè)頭肌下肢遠(yuǎn)端重 選腓腸肌和脛前肌軀干病變選腹直肌肌肉活檢部位的選擇肌源性病變：急性病變 選最重的部位，慢性病變 選4度肌力部位神經(jīng)源性病變：要求取與中樞或周圍神經(jīng)支配相一致的節(jié)段，以保證查到病變肌肉活檢部位的選擇避免選取肌電圖、針灸針刺或肌肉注射損傷部位，遺留的纖維結(jié)締組織對損傷的修復(fù)易誤診為局限性肌病取材后制片液氮快速冷凍恒冷箱切片零下20左右厚度8-10um，5-10張備作

4、常規(guī)、酶組織或免疫組化染色 肌纖維類型的組織化學(xué)和酶組織化學(xué)區(qū)別 組織化學(xué) 型肌纖維 a型肌纖維 b型肌纖維 HE 深紅 紅 紅肌球蛋白ATP酶 預(yù)培育液pH 9.4 +（淡色） + （深色） + （深色） 預(yù)培育液pH 4.6 + + + （中間）NADH-TR + + +SDH + + +MGT + + +PAS + + +油紅O / 蘇丹黑 + 肌磷酸化酶 + + + 型肌纖維也叫紅肌纖維、慢縮肌纖維，耐力好，主要在維持姿勢中起作用；型肌纖維也叫白肌纖維、快縮肌纖維，爆發(fā)力好，主要在運(yùn)動中起作用；各種染色方法的作用HE染色下型肌纖維呈深紅色，型肌纖維呈淡紅色；好的HE染色片可以看到不同的

5、肌組織結(jié)構(gòu)，是病理診斷的可靠依據(jù)。 ATP酶染色法可以很好的區(qū)分兩型肌纖維，預(yù)培育液PH4.6時(shí)，型肌纖維呈深色，型肌纖維呈淡色。各種染色方法的作用 琥珀酸脫氫酶（SDH）染色，此酶定位于線粒體，線粒體肌病時(shí)，活性增高。 改良Gomori三色染色對各種特征性肌病有重要價(jià)值，如線粒體肌病中可見破碎紅纖維；桿狀體肌病中可見桿狀小體；周期性癱瘓或先天性肌強(qiáng)直癥中出現(xiàn)紅染的肌小管聚集各種染色方法的作用PAS染色可觀察和研究肌糖原累積病中糖原的含量及分布油紅O染色主要用于顯示中性脂肪，能將較小的脂肪滴顯示出來，診斷脂質(zhì)沉積性肌病肌肉病的病理診斷中，除了酶組織化學(xué)染色，免疫組織化學(xué)染色 也起到非常重要的作

6、用Dystroglycan:抗肌萎縮蛋白糖蛋白復(fù)合物； Dystrophin：抗肌萎縮蛋白；Dysferlin：肢帶型肌營養(yǎng)2B不良相關(guān)蛋白；Calpain：鈣蛋白酶； Laminin：層粘蛋白 比如大家熟知DMD表現(xiàn)為：Dystrophin蛋白缺失Dystrophin缺失Dystrophin存在Dystrophin部分缺失DMDBMD正常肢帶型肌營養(yǎng)不良2B型表現(xiàn)為：Dysferlin蛋白缺失Dysferlin缺失（LGMD2B）Dysferlin存在（LGMD2A）病理診斷在肌肉病診斷中意義重大，但有一定創(chuàng)傷性；且病理診斷在某些情況下不能做出準(zhǔn)確診斷： 1、病理表現(xiàn)類似的肌病，如表現(xiàn)為肢帶

7、型肌營養(yǎng)不良綜合癥的各種肌??； 2、遺傳咨詢或遺傳干預(yù)，需要依靠準(zhǔn)確的基因診斷； 3、部分癥狀前診斷。近20年余來基因診斷技術(shù)與方法日新月異。拿DMD來說，自從1987年KOENIG等人克隆了整個(gè)DMD基因14kb的cDNA開始，DMD基因檢測取得了突破性進(jìn)展之后，基因檢測技術(shù)不斷進(jìn)步。如Southern blotting、PCR、多重PCR、熒光原位雜交（FISH）、限制性片段長度多態(tài)性連鎖分析（RFLP） 、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）、基因芯片等。隨著測序技術(shù)的進(jìn)步，尤其是二代測序的出現(xiàn)，許多以往檢測不到的點(diǎn)突變以及未知的新突變都能得到解決。并且，二代測序較一代sanger測序而言，

8、有費(fèi)用更低、通量更高、速度更快的優(yōu)點(diǎn)。疾病基因備注DMD/BMDDMDDMD、BMD肢帶型肌營養(yǎng)不良CAPN3、DYSF（詳見注1）LGMD2A、LGMD2B埃德肌營養(yǎng)不良EMD先天性肌營養(yǎng)不良LAMA2等（詳見注2）層粘連蛋白-a2缺乏癥等先天性肌病RYR1等（詳見注3）中央軸空病等肌原纖維病MFM1等肌原纖維病包涵體肌病STIM1、DPAGT1、SCN4A、GFPT1、CACNA1S糖原累積癥GAA等（詳見注4）糖原累積病2型等脂肪酸代謝性肌病ETFDH （詳見注5）核黃素反應(yīng)型脂質(zhì)沉積性肌病線粒體功能異常線粒體基因組（詳見注6）管聚集性肌病STIM1、DPAGT1、SCN4A、GFPT1

9、、CACNA1S離子通道病CACNA1S等（詳見注7）（低鉀型周期性麻痹等）遠(yuǎn)端型肌病17（詳見注8）先天性肌無力綜合征32關(guān)注其他類似癥狀的遺傳病進(jìn)行性眼外肌麻痹線粒體全基因組測序+缺失重復(fù)分析部分遺傳肌肉病及相關(guān)基因病例分析例17歲男孩行走不穩(wěn)進(jìn)行性加重5年余。足月順產(chǎn)，1歲半會走，易跌倒否認(rèn)家族史。查體：屈頸3；四肢近端4，遠(yuǎn)端5。腓腸肌假肥大Gower征（）輔檢：CK 12800 U/L；肌電圖肌源性損害。臨床診斷：DMD?患者對照DystrophinHE杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)例1患者肌肉HE染色顯示：肌纖維大小明顯不等，小纖維多呈圓形，可見壞死伴吞噬及再生纖維。肌間質(zhì)增生明顯。免疫

10、組化顯示：Dystrophin完全缺失。杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)多重PCR結(jié)果：可見1號樣本45、47、48、50、51外顯子缺失，基因診斷明確DMD/BMD發(fā)病率高：占出生男嬰的20-30/10萬，中國每年新增2000例。遺傳方式特殊：為X-連鎖隱性遺傳。主要是男孩發(fā)病。激素治療可改善，但無特效治療，易診斷遺傳咨詢意義重大DMD不同檢測方法比較1、多重PCR-目前很少用2、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)-適用缺失重復(fù)（65%）- ￥ 2000-30003、一代測序(Sanger測序)-適用點(diǎn)突變和小的插入和缺失（33-34%）-￥6000-100004、DMD -NGS-適用缺失重復(fù)和點(diǎn)突

11、變（98%）- ￥ 4000-6000二代測序技術(shù)(NGS)在DMD/BMD診斷中已經(jīng)可以很好的應(yīng)用了。二代測序技術(shù)可以一次性檢測DMD相關(guān)幾乎所有突變臨床癥狀、體征、家族史、血生化（肌酶、甲功、乳酸、血糖、免疫、酶、代謝物等）肌肉MR肌電圖肌肉活檢病理基因檢測某些單基因遺傳肌病可以直接進(jìn)行基因檢測例223歲女性。進(jìn)行性四肢無力4年。父母近親婚配，其弟有類似病史。查體抬頭肌力5，雙上肢3-4-4-5，雙下肢3-4-4-4翼狀肩，跟腱攣縮。輔檢CK3000-4000u/LEMG：肌源性損害。臨床診斷：？ 例2肢帶型肌營養(yǎng)不良(LGMD2A)HEDysferlin免疫組化顯示Dysferlin存在

12、。Western Blot 提示Calpain3完全缺失基因檢測發(fā)現(xiàn)CAPN3存在致病突變：該基因2號外顯子對應(yīng)的編碼區(qū)第25位堿基有CT的突變；20-25號外顯子有缺失。通過多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)驗(yàn)證患者父母，確定突變不在同一染色體?；蛉旧w位置轉(zhuǎn)錄本編號Exon編號核苷酸變化氨基酸變化測序深度Hom/Het正常人群攜帶率CAPN3chr15-42695016NM_173088exon2c.25CTp.Q9X225/189(0.46)het-肢帶型肌營養(yǎng)不良癥2A型是一種常染色體隱性遺傳病，由鈣蛋白酶3（calpain-3）缺乏引起的，是肢帶型肌營養(yǎng)不良癥的常見類型。發(fā)病年齡2-

13、40歲，臨床主要表現(xiàn)為肩甲帶肌、骨盆帶肌的無力和萎縮。肢帶型肌營養(yǎng)不良(LGMD2A)肢帶型肌營養(yǎng)不良癥基因相關(guān)研究近年進(jìn)展迅速LGMD2A國外有學(xué)者認(rèn)為對于LGMD2A診斷，只有基因檢測才是可靠的。LGMD2A型1、LGMD2A型的致病基因CAPN3， CAPN3(Calpain3)是鈣蛋白酶基因家族的成員之一,有2個(gè)變異剪接體,CAPN3a(p94)全長約50kb,含有24個(gè)外顯子,預(yù)測的多肽鏈含有821個(gè)氨基酸殘基,分子量為94kd。2、在國外最常見的肢帶型肌營養(yǎng)不良，在中國為第二常見。3、因?yàn)镃APN3是個(gè)鈣蛋白酶，很多突變，引起蛋白功能喪失，但不引起蛋白表達(dá)量的變化，所以部分患者用免

14、疫組化或者WB 都無法確定是否存在問題。4、國外對于2A診斷，基因檢測為金標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)100例臨床排除DMD和LGMD2B的病例檢測結(jié)果中，臨床最容易漏檢的肢帶肌營養(yǎng)不良為LGMD2A。這主要因?yàn)镃APN3基因編碼的是個(gè)酶，很多功能的喪失不是表達(dá)量降低而是酶活性降低，這個(gè)通過免疫組化或者Western都無法檢測，這個(gè)論據(jù)在國外報(bào)告的文章也得到充分支持。對非典型肢帶型肌營養(yǎng)不良癥（肌活檢排除DMD及LGMD2B），二代測序技術(shù)能進(jìn)一步提高檢出率。例325歲女性。進(jìn)行性四肢近端無力4年。激素治療似有效，但近來自覺癥狀有加重。查體柯興面容。抬頭3+，雙上肢3-4-4-5，雙下肢3-4-4-5。雙下肢后

15、群肌明顯萎縮。輔檢：肌酶：CK 4000-20000 U/LEMG：肌源性損害肌肉活檢（外院）（股四頭?。┘甭匝装Y臨床診斷：？HE：多發(fā)性肌炎？其他？例3HEDysferlin肢帶型肌營養(yǎng)不良(LGMD2B)免疫組化顯示Dysferlin缺失Western Blot 提示Dysferlin完全缺失LCA(抗白細(xì)胞共同抗原抗體)陽性提示白細(xì)胞浸潤免疫病理學(xué)改變可作為炎性肌病與肢帶型肌營養(yǎng)不良2B的鑒別CD8/MHC-I復(fù)合體被認(rèn)為多發(fā)性肌炎的炎性標(biāo)志性免疫病理學(xué)改變 CD8/MHC-I復(fù)合體雙標(biāo)記肢帶型肌營養(yǎng)不良(LGMD2B)1、幾乎所有的2B型，通過活檢均能明確（取決于活檢水平）。2、DY

16、SF基因巨大（55外顯子），一代測序很難解決。3、在一些遠(yuǎn)端損害為主的病人，DYSF的活檢很多時(shí)候不典型。4、臨床明確的2B 型，在基因?qū)用鎺缀醵寄苷业诫p雜合突變點(diǎn)，而且大部分明確報(bào)道過的突變位點(diǎn)（臨床符合度大于95%）。肢帶型肌營養(yǎng)不良2B型基因染色體位置轉(zhuǎn)錄本編號Exon編號核苷酸變化氨基酸變化測序深度Hom/Het正常人群攜帶率DYSFchr2-71896273NM_001130980exon49c.5512ATp.R1838X111/95(0.46)het-臨床確診LGMD2B。測序發(fā)現(xiàn)DYSF基因49號外顯子對應(yīng)5512位堿基發(fā)生AT突變； 7-43號外顯子存在重復(fù)。多重連接探針擴(kuò)增

17、技術(shù) (MLPA)確證DYSF重復(fù)存在，同時(shí)驗(yàn)證患者父母，確定突變不在同一染色體。肢帶型肌營養(yǎng)不良2B基因檢測問題DYSF基因巨大，所以部分非2B患者，也常能檢測到單雜合的突變，存在假陽性問題。A、臨床符合，可建議患者進(jìn)行肌肉活檢確認(rèn)。B、臨床不符合：考慮可能為非致病突變。因此，在肢帶型肌營養(yǎng)不良2B的診斷中仍需依靠肌肉活檢。臨床癥狀、體征、家族史、血生化（肌酶、甲功、乳酸、血糖、免疫、酶、代謝物等）基因檢測核磁共振、電生理等肌肉活檢病理檢查建議部分單基因遺傳肌病診斷流程例447歲男性。進(jìn)行性四肢乏力3月。3個(gè)月前爬山時(shí)感雙小腿酸脹，持續(xù)4-5天緩解。2周后再次出現(xiàn)四肢無力、酸脹，外院查CK

18、11171480 U/L。無茶色尿。否認(rèn)家族史。查體抬頭、四肢近端肌力5，腱反射（+）。輔檢CK 1308 U/L，LDH 668U/LEMG+NCV：肌源性損害臨床診斷：？例4脂質(zhì)沉積病HEOROHE染色顯示：肌纖維大小輕度不等，肌纖維形態(tài)不規(guī)則，部分肌纖維內(nèi)可見大小不等的空泡及裂隙形成，可見壞死伴吞噬現(xiàn)象，肌間質(zhì)輕度增生。油紅O染色顯示：多數(shù)纖維脂滴含量明顯增多。ETFTH報(bào)道與脂質(zhì)沉積性肌病相關(guān)，為常染色體隱性遺傳，理論上必須有兩條染色體上都出現(xiàn)致病性突變才有可能致病。該樣本在此基因發(fā)現(xiàn)兩處雜合突變：2號外顯子對應(yīng)的109位堿基發(fā)生GA突變； 154位堿基發(fā)生CG突變；并驗(yàn)證不在同一條染

19、色體。已有文獻(xiàn)報(bào)道此兩突變?yōu)橹虏⌒酝蛔儭?chr4-159603421，c.109GA參考文獻(xiàn)：Liang.Neuromuscul Disord. 2009. chr4-159603466，c.154CG，參考文獻(xiàn)：Chien.JIMD Rep.2013.例528歲女性。反復(fù)咳嗽、咳痰3月，下肢浮腫1月。自幼運(yùn)動受限。父母為近親結(jié)婚。查體：呼吸肌無力， 存在睡眠呼吸暫停。四肢近端肌力減退。輔檢：CK 500-7000u/L心超：右房、右室增大，左心心肌稍厚。臨床診斷：？ 例5糖原累積病HEPASHE染色顯示肌纖維中出現(xiàn)空泡狀改變，空泡大小不等；PAS染色深染，分布不均。GAA基因報(bào)道與糖原累積

20、性肌病2型相關(guān)，為常染色體隱性遺傳，理論上必須有兩條染色體上都出現(xiàn)致病性突變才有可能致病。該樣本在此基因發(fā)現(xiàn)兩處雜合突變：6號外顯子對應(yīng)的995位堿基發(fā)生CA突變； 11號外顯子對應(yīng)的1634位堿基發(fā)生CT突變；并驗(yàn)證不在同一條染色體。已有報(bào)道為致病突變。例619歲女性。右眼瞼下垂8年，左眼瞼下垂伴眼球固定5年余。 07年外院CT提示前縱隔影增寬，考慮胸腺增生，曾予胸腺放療，癥狀無緩解。查體雙瞼下垂，93點(diǎn)，眼球固定，疲勞試驗(yàn)（），閉目閉唇稍差，抬頭4，雙上肢近端4，遠(yuǎn)端5，雙下肢近端4，遠(yuǎn)端5，腱反射，無明顯肌萎縮。輔檢CK 68 U/L。EMG：肌源性損害臨床診斷：? 例6慢性進(jìn)行性眼外肌

21、麻痹（CPEO）HEMGTHE染色顯示：肌纖維大小明顯不等，小纖維多呈不規(guī)則形；偶見散在壞死伴吞噬現(xiàn)象；未見炎細(xì)胞浸潤。MGT染色顯示：可見較多破碎紅纖維(RRFs) 。 線粒體病的電鏡表現(xiàn)：線粒體腫脹、大小不一線粒體基因（mt-DNA）發(fā)現(xiàn)片段缺失臨床癥狀、體征、家族史、血生化（肌酶、甲功、乳酸、血糖、免疫、酶、代謝物等）肌肉MR肌電圖肌肉活檢病理基因檢測糖原累積病、脂質(zhì)沉積病、線粒體肌病等都需要肌肉病理結(jié)合基因檢測小結(jié)：遺傳性肌肉病相比于其他遺傳病利用基因檢測確診優(yōu)勢1、雖然基因眾多，但每類疾病對應(yīng)的高發(fā)基因很集中。（LGMD-DYSF，脂質(zhì)沉積癥-ETFDH）2、臨床常見基因的突變位點(diǎn)研

22、究很清楚，哪些突變致病不致病已經(jīng)基本清楚，可以很好的利用基因結(jié)果預(yù)測致病性。3、肌肉病很多基因巨大，用一代測序無法檢測，且很多基因，像DMD、SMA的突變均是以缺失重復(fù)突變?yōu)橹?，用一代測序無法解決，二代測序可以同時(shí)解決點(diǎn)突變和缺失重復(fù)問題。4、活檢檢查方法復(fù)雜（方法準(zhǔn)確度依賴人員熟練程度），且有創(chuàng)，同時(shí)對于大部分中心，接觸的病人較少，不具有成本優(yōu)勢。肌肉病理陽性（DMD、LGMD2B、ETFDH、GAA etal）肌肉病理陰性（LGMD2A etal）不能取得肌肉病理神經(jīng)肌肉基因組套檢測肌損是否與遺傳相關(guān)？陽性不確定陰性重新進(jìn)行臨床評估及相關(guān)檢查臨床確認(rèn)臨床不確定全外顯子測序神經(jīng)肌肉病基因檢測建議注1：肢帶型肌營養(yǎng)不良綜合征：MYOT、LMNA、CAV3、DES、DNAJB6、TNPO3、HNRNPDL、CAPN3、DYSF、S