【學(xué)習(xí)課件】第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)

1、生物技術(shù)核心課程Genetic Engineering基 因 工 程基因工程綱要第一章 基因工程概論第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第三章基因工程載體概述第四章基因工程的主要技術(shù)及原理第五章 目的基因的克隆與分離第六章 基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定第七章克隆基因的表達(dá)第八章基因工程的應(yīng)用用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸外切酶核酸修飾酶第二章 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)單鏈DNA內(nèi)切酶核酸酶：通過切割相鄰的兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子多核酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶。第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶一、基本概念及其生物功能核酸酶：通過切割相鄰的兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二

2、酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子多核酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶。第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶一、基本概念及其生物功能特異水解斷裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase），特異水解斷裂DNA分子，脫氧核糖核酸酶（DNase）。從核酸分子末端逐個(gè)降解核苷酸，叫外切核酸酶；從核酸分子內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔研纬尚∑危袃?nèi)切核酸酶按水解斷裂核酸分子的方式:限制性內(nèi)切核酸酶(Restriction endonuclease)是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。第一節(jié) 限制性內(nèi)切核酸酶一、基本概念及其生物功能截至2007年8月，從各種不同的微生物中分離出了

3、限制性內(nèi)切酶3819種，已經(jīng)商品化的有624種。2. 性質(zhì)主要是從原核生物中分離純化出來。內(nèi)切酶，即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。幫助細(xì)菌限制外來DNA的入侵3. 功能1. 來源11兩種不同來源的入-噬菌體 （ 入- K ，入-B ）。2能高頻感染各自大腸桿菌宿主細(xì)胞（ K株 ，B 株 ）。3當(dāng)它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時(shí)， （ 入K-B ，入B-K ）感染下降數(shù)千倍。4一但 入K 噬菌體在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入-K 后代，能感染 B 株, 不能再感染原來 K株. 稱為：宿主細(xì)胞的限制和修飾作用 宿主細(xì)胞的限制和修飾作用限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1

4、）限制（Restriction）細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。（2）修飾（Modification）供質(zhì)粒擴(kuò)增的大腸桿菌菌株多數(shù)含有兩種位點(diǎn)特異性的DNA甲基化酶：GATC 腺嘌呤引入甲基 Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二個(gè)C上引入甲基 Dam甲基化酶2. 入噬菌體長期生長在大腸桿菌宿主細(xì)胞 K株，B株 中， 1）宿主細(xì)胞甲基化酶，將染色體DNA和噬菌體DNA特異性保護(hù). 2）封閉自身所產(chǎn)生的核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)。-（修飾）限制和修飾作用的分子機(jī)制：1. 大腸桿菌宿主細(xì)胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修飾系統(tǒng)。3. 外來DNA

5、入侵時(shí)，遭到宿主限制性內(nèi)切酶的特異降解 -（限制）限制和修飾作用的分子機(jī)制：4. 由于降解不完全，外來少數(shù)DNA分子在宿主細(xì)胞中繁殖過程中被宿主細(xì)胞的甲基化酶修飾，雖然是外來卻不被降解。 5接受了新宿主菌甲基化修飾的同時(shí)，喪失了原宿主菌修飾的標(biāo)記，喪失在原宿主細(xì)胞中的存活能力。I 型限制性內(nèi)切酶 目前主要鑒定出四種不同類型的限制性內(nèi)切酶。二、限制性內(nèi)切酶的類型II 型限制性內(nèi)切酶 III型限制性內(nèi)切酶 IV型限制性內(nèi)切酶 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年從大腸桿菌 B株和 K株分離的。（1）識別位點(diǎn)序列EcoB： TGA*(N)8TGCT EcoK：AA*C(N)6GT

6、GC1. I型限制性內(nèi)切酶 如 EcoB和 EcoK。未甲基化修飾的特異序列。N：表示任何一種核苷酸需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）為輔助因子（3）作用機(jī)理在距離特異性識別位點(diǎn)約1000-1500 bp處隨機(jī)切割。Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位點(diǎn)1970年，H.O. Smith和K.W. Wilcox首先從流感嗜血桿菌d株中分離出來。 （1）識別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列，多數(shù)是回文序列。識別序列長度為46bp，少數(shù)識別8bp（表2-2）。 2. II型限制性內(nèi)切酶 分離的第一個(gè)酶是Hind II，其次是 Hind III 5GAA

7、 TTC3 3CTT AAG5特點(diǎn)有二：回文序列：反向重復(fù)序列，雙鏈DNA中含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)相同，方向相反的序列1、以某一對核苷酸為中軸，左右同數(shù)目的核苷酸彼此呈堿基互補(bǔ)。2、這兩股DNA鏈若按同方向閱讀（如5/ 3/），其核苷酸順序相同。 5GTNAC3 3CANTG5（2）切割位點(diǎn)切開雙鏈DNA。形成粘性末端（sticky end）或平末端（blunt end）。如：識別位點(diǎn)處。EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 產(chǎn)生粘性末端EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 產(chǎn)生平齊末端 DNA是由四種類型的單核苷酸組成，假定DNA的堿基組成是均一的，對于任何一種

8、限制酶的切割頻率，理論上應(yīng)為： 1/4n，n表示該限制酶識別的堿基數(shù)。 識別4個(gè)堿基的，每256 （44）個(gè)堿基有一個(gè)識別序列 識別5個(gè)堿基的，每1024（45）個(gè)堿基有一個(gè)識別序列 識別6個(gè)堿基的，每4096（46）個(gè)堿基有一個(gè)識別序列切割產(chǎn)生的DNA片段的理論大小為？ 限制性內(nèi)切酶的切割頻率：是指限制性內(nèi)切核酸酶在DNA分子中預(yù)測的切點(diǎn)數(shù)。（2）切割位點(diǎn)切開雙鏈DNA。形成粘性末端（sticky end）或平末端（blunt end）。如：識別位點(diǎn)處。EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 產(chǎn)生粘性末端EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 產(chǎn)生平齊末端

9、（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類型： 5端凸出（如EcoR I切點(diǎn)）GAATTC CTTAAG5-3 3-5 從 5-P末端切割雙鏈DNA的兩鏈，產(chǎn)生5-P單鏈延伸的黏性末端G -3 -5 AATTCG5-3-CTTAAEcoR I等產(chǎn)生的5粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoR I 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5 G

10、-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OHPOHP 3端凸出（如Pst I切點(diǎn)）CTGCAG GACGTC 5-3 3-5 在其識別序列的對稱軸兩側(cè)，從 3-OH 末端切割雙鏈DNA的兩條鏈，產(chǎn)生具有 3-OH 單鏈延伸的黏性末端。5-3-GCTGCA-3 -5 G ACGTCPst I等產(chǎn)生的3粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5Pst I 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G

11、-T-C-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OHPOHP 連接便利 粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。 補(bǔ)平成平齊末端 5末端標(biāo)記凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。（5 *p-AATTC-OH 3）粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。（4）同裂酶 (Isoschizomers)來源不同，識別位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶。 （原型酶同裂酶

12、） 完全同裂酶（同切點(diǎn)酶） 識別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同 如Hind 和Hsu I。Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 不完全同裂酶（新裂酶） ：Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5 Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 識別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。如Xma I 和 Sma I。（5）同尾酶 （Isocaudamers）識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 BamH IBcl I5-TGATCA-

13、3 3-ACTAGT-5 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5 Bgl 5-RGATCY-3 3-YCTAGR-5 Xho R代表嘌呤；Y代表嘧啶5-GATC-3 3-CTAG-5 Sau 3AI同尾酶連接后連接處的序列將變得“面目全非”，一般不能再被原來的酶識別。？5-G 3-CCTAG GATCT-3 A-5 BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5 BamH IBgl Sau 3AI在離它的不對稱識別位點(diǎn)一側(cè)的特定距離處切割DNA雙鏈。（6）s型限制性內(nèi)切酶移動(dòng)切割（shifted cleavage):GACGCNNNNN Hga ICTGCGNNNNNNNN

14、NN 5 3 3. III型限制性內(nèi)切酶 有專一的識別序列，但不是對稱的回文順序，在識別序列旁邊一定數(shù)目核苷酸對的位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對的切割位點(diǎn)不是特異的。切割產(chǎn)生的DNA片段具有各種單鏈末端在基因工程操作中用途不大。EcoPI: AGACCEcoP15: CAGCAG4. IV型限制性內(nèi)切酶 新鑒定出來的一類限制酶。只切割堿基已被甲基化、羥甲基化、葡糖羥甲基化的DNA序列。除EcoKMcrBC外，識別序列尚未確定，目前尚無應(yīng)用。核酸限制性內(nèi)切酶的類型及主要特性特性I型內(nèi)切酶II型內(nèi)切酶III型內(nèi)切酶內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP

15、、 Mg2+和SAMMg2+ ATP、 Mg2+和SAM寄主特異性位點(diǎn)識別序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC回文序列，旋轉(zhuǎn)對稱 （IIs型除外）EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG切割位點(diǎn)在距離識別位點(diǎn)至少1000 bp外隨機(jī)切開一條單鏈。位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近識別位點(diǎn)3端24-26bp處甲基化作用的位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)識別未甲基化的序列進(jìn)行切割能能能序列特異的切割不是是不是基因工程中的用途無用十分有用用處不大若載體DNA用M酶切開，則帶有N酶黏性末端的外源DNA片段中，能直接與載體拼接的是（ ） M N M

16、 NA、A/AGCTT T/TCGAA B、C/CATGG ACATG/GC、GAGCT/C G/AGCTC D、G/GATCC A/GATCT下列DNA 片段中含有回文結(jié)構(gòu)的是（ ） GAAACTGCTTTGAC GAAACTGGAAACTG GAAACTGGTCAAAG GAAACTGCAGTTTC DD1973年H.O Smith和D. Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下： 三、限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個(gè)字母（大寫，斜體）和種名的頭兩個(gè)字母（小寫，斜體）構(gòu)成酶的基本名稱，表示寄主菌的物種名。大腸桿菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemop

17、hilus influenzae）用Hin表示。4. 限制酶前面要帶上R（Restriction)， 修飾酶前面要帶上M（Modification）。（現(xiàn)已省略）。2. 用一個(gè)正體字母表示菌株或型。如EcoR、Hind）。3. 如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制-修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如Hind I， Hind II ，Hind III 。 DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖、苯酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、NaCl等都會影響酶的活性。 1. DNA的純度 四、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素p18一般采取 純化DNA 加大酶的用量 （510U酶/ g DNA ） 延長保溫時(shí)間 （34h） 擴(kuò)

18、大反應(yīng)體積，使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌♂專?20 l） 加入亞精胺提高消化作用，需要適當(dāng)?shù)臏囟?. DNA的甲基化程度 大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：dam甲基化酶（修飾GATC中的A）； dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）。基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株。不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37 ，少數(shù)例外。酶最適溫度酶最適溫度酶最適溫度Apa I Bcl I Mae II Taq I30 50 50 65Apy I BstE II Mae III30 60 55Ban I Mae I Sma I50 45 253. 溫度 酶切超螺旋DNA分子，所需酶量多于線性DN

19、A分子；最高可達(dá)20倍；4. DNA分子的構(gòu)型 對同一DNA分子上不同位置的識別序列，切割效率具有位點(diǎn)偏愛性；識別序列的側(cè)面序列影響酶切效率。 “保 護(hù) 堿 基”是影響限制酶活性的重要因素。5. 緩沖液(Buffer) 緩沖液的化學(xué)組成：10XbufferMgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和離子強(qiáng)度； Tris-HCl： 維持pH； 二硫蘇糖醇（DTT）：防止酶的氧化，保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白BSA等：提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度，防止酶失活 ；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。限制性內(nèi)切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性。 限

20、制酶的星號活性當(dāng)條件改變時(shí)，許多酶的識別位點(diǎn)會改變，導(dǎo)致識別與切割序列的非特異性，稱為星號（*）活性。所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。 星號（*）活性EcoR I 和BamH I 等都有*活性。EcoR I *在低鹽、高pH（8）時(shí)可識別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoR I：使用的時(shí)候要特別注意！/biotech/free/2009/p820283067.html概括起來，誘發(fā)星活性的因素有如下幾種：（1）高甘油含量（5, vv）；（2） 限制性內(nèi)切核酸酶用量過高（100UugDNA）；（3）低離子濃度（25 mmolL）；（4）高pH（8.0以上）；（5）含

21、有機(jī)溶劑，如DMSO（二甲基亞砜 ），乙醇等；（6）有非Mg2+的二價(jià)陽離子存在（如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等）。但在實(shí)際應(yīng)用中，一般要用稍過量的酶（1g加25U酶）反應(yīng)較長的時(shí)間，才能達(dá)到完全酶解。但是不能過分加大酶的用量酶過量對酶切反應(yīng)的影響：1）酶過量（一般為100U/gDNA）會影響識別序列的正確性，如：BamHI 的正常識別序列: GGATTC ；酶過量識別序列 NGATCN2）酶制劑含甘油成分，酶過量，會因?yàn)楦视土看蠖绊懫渥R別的專一性，誘發(fā)星號活力。6. 酶對消化效率的影響1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下1h，完全水解1gDNA所需的酶量五、限制性內(nèi)切酶對D

22、NA的消化1. 內(nèi)切酶與識別序列的結(jié)合模式 1986年J.A. McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)II型限制性內(nèi)切酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。GAATTCCTTAAG兩種不同的限制酶切割同一種DNA分子-構(gòu)建載體。2. 雙酶切消化 對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用兩種酶均適用的緩沖液，同時(shí)酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切0.1倍體積的 5 M NaAc pH 5.42.5倍體積的冰冷乙醇冰浴 5 min、高速冷凍離心10min、干燥對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切。低溫酶先切，然后升溫，加入高溫酶再切內(nèi)切酶在DNA上

23、的所有識別位點(diǎn)都被切開。3. 完全酶切 12341234只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開。如構(gòu)建基因組文庫。（p20） 通過縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。4. 部分酶切 123414 6. 幾種常用限制酶識別位點(diǎn)37酶可用65溫育5min高溫酶 80溫育5min，或用乙醇沉淀DNA。5. 限制酶酶切反應(yīng)的終止 從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第二節(jié) DNA 連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)1967年，世界上幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化兩條DNA的末端之間形成磷酸二酯鍵的酶，“分子黏合劑”。 修復(fù)雙鏈DNA上

24、切口處的磷酸二酯鍵（分子間及分子內(nèi)）DNA連接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OHPOHP5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknick二、DNA連接酶的基本性質(zhì)與特點(diǎn)（一）DNA連接酶的基本性質(zhì)修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5OHPnick5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C

25、-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子（分子間及分子內(nèi)） ：5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA連接酶不能催化兩條游離的DNA單鏈連接（2）大腸桿菌連接酶1. 兩種DNA連接酶該酶由大腸桿菌基因組中的lig基因編碼能連接粘性末端，平末端連接效率低。（二）DNA ligase的特點(diǎn)（1）T4噬菌體的連接酶從T4噬菌體感染的大腸桿菌中分離的，由DNA3

26、0編碼的產(chǎn)物不但能連接粘性末端， 還能連接平末端（p21 表2-4）。（3）被連接的DNA鏈必須是雙螺旋的一部分。（1）DNA 3端有游離的-OH， 5端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。（2）需要能量、Mg2+2. DNA連接酶催化的連接反應(yīng)特點(diǎn)（4）只封閉雙螺旋DNA骨架上的nick。1. ATP（NAD+）提供激活的AMP。2. ATP與連接酶形成共價(jià)“連接酶-AMP”（ AMP與連接酶的賴氨酸-氨基相連）復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+H3NAMPATPPPi三、連接反應(yīng)的機(jī)理3. AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5端P上，形成“

27、DNA-腺苷酸”復(fù)合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP4. 3-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37。四、影響連接反應(yīng)的因素1. 反應(yīng)溫度37下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定，一般416 。平末端 1020 。2. 連接酶的濃度 在平末端DNA的連接反應(yīng)中，最適的反應(yīng)酶用量為12U，而黏性末端僅為0.1U便能達(dá)到連接的最佳效果。增加插入片段與載體的接觸機(jī)會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。4. 插入片段與載體的濃度比例 p24 外源DNA與載體DNA的摩爾比：10 : 1 或更高當(dāng)連接溫度在1216之間時(shí)，連接反應(yīng)時(shí)間在116h之間；如果溫度更低，則延長

28、反應(yīng)時(shí)間。3. 連接反應(yīng)的時(shí)間假設(shè)連接反應(yīng)要求載體:插入片段的摩爾比為1:12，如果連接反應(yīng)中有3kb 的載體有100ng，應(yīng)加入0.5kb 的插入片段多少ng？1/12 = 100ng 0.5kb / 3kb a插入片段200ng?由限制性內(nèi)切酶創(chuàng)造的黏性末端的連接屬于分子內(nèi)部連接，而平齊末端的連接則屬于分子之間的連接，因此后者反應(yīng)速度相對慢得多,如何提高其連接效率呢?1、加大連接酶用量（10倍于黏性末端的連接）2、加大平齊末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會3、加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用4、加入單價(jià)陽離子（Nacl )，最終濃度150200 mM5、將平齊末端變成黏性

29、末端第三節(jié) DNA聚合酶基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶） 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修飾過的T7 DNA聚合酶 6. Taq DNA聚合酶 7. 逆轉(zhuǎn)錄酶 DNA聚合酶：在引物和模板的存在下，把脫氧核糖單核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。1. 大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶） 5 3 聚合酶活性 3 5 外切酶活性：主要起校對作用 5 3 外切酶活性：從5端降解DNA分子-OH5 3 dNTPs主要用來制備帶放射性標(biāo)記的DNA探針。（1）大腸桿菌DNA聚合酶I

30、（DNA Pol I）的性質(zhì) 底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ 帶有3-OH游離端的引物 DNA模板（2）DNA聚合酶I（Pol I）的反應(yīng)條件-OH5 3 dNTPs標(biāo)記 核酸探針（probe） 能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標(biāo)記的特定的DNA片段。已知序列的核酸片斷顯示位置與互補(bǔ)的待測序列雜交（3）用DNA聚合酶I 制備探針標(biāo)記已知序列的核酸片斷 探針的標(biāo)記方式標(biāo)記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5 3 切口轉(zhuǎn)移法(nick translation )：DNA聚合酶I 同時(shí)具備53外切酶活性和53的聚合酶活性（以及35外切酶

31、活性）。 探針的標(biāo)記方式53外切酶活性從DNA切口的下一段DNA5端除去一個(gè)核苷酸后，聚合酶活性就會在切口的上一段DNA的3一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸。切口切口5 5 3 3 5 3 5 3 純化的DNA片斷DNase I 制造單鏈切口DNA Pol I 進(jìn)行切口轉(zhuǎn)移一種 32P-dNTP和dNTPs5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標(biāo)記2. Klenow fragment具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（1）Klenow fragment的性質(zhì)DNA Pol I Klenow fragment (76KD） 枯草芽孢桿

32、菌蛋白酶處理，失去了53外切酶活性 3端補(bǔ)平5 5 klenow補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3隱蔽端，修復(fù)帶裂口的DNA DNA 3末端標(biāo)記在3隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。klenow（2）主要用途3隱蔽末端的DNA片斷Klenow fragment補(bǔ)平根據(jù)末端的序列選擇一種 -32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA 限制性內(nèi)切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h c

33、DNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow5 3 3 5 5 3 引物（1） T4 DNA聚合酶的性質(zhì)3. T4 DNA聚合酶 從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由噬菌體基因43編碼。 有53聚合酶活性和35外切酶活性（降解單鏈更快）。 來源 酶活性 特點(diǎn)當(dāng)沒有dNTP時(shí)，T4 DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隱蔽端。如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP的位置。5 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶無dNTPsT4 DNA聚合酶有dNTPs5 5 （2） T4 DNA聚合酶的用途標(biāo)記末端（取代合成法） 用35外切酶活性作用于所有

34、末端形式的3端（平端、3隱蔽端、5隱蔽端）制造出3隱蔽端。 再利用它的53聚合酶活性補(bǔ)平，并加入放射性標(biāo)記的32P-dNTP。標(biāo)記的dNTP逐漸取代被刪除掉的原有的核苷酸，因此叫做取代合成。 補(bǔ)平3隱蔽末端 將雙鏈DNA的3粘末端轉(zhuǎn)化為平末端 DNA 3末端標(biāo)記具EcoRI位點(diǎn)的DNA分子對DNA分子3端有控制的降解合成作用產(chǎn)生選擇性標(biāo)記T4DNA聚合酶的取代合成法標(biāo)記DNA片段4. T7 DNA聚合酶（1）來源 從T7噬菌體感染的大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的，由兩個(gè)亞基組成： T7基因5編碼的大亞基：有53聚合酶和35外切酶活性。 大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白。 增加大亞基對模板的親和性。（

35、2）T7 DNA聚合酶的特點(diǎn) 持續(xù)合成能力強(qiáng)一旦與模板結(jié)合就會不間斷地合成互補(bǔ)鏈，合成DNA長度大。 35外切酶活性很高為Klenow片段的1000倍 合成不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響其它DNA聚合酶受DNA二級結(jié)構(gòu)的阻礙 進(jìn)行末端標(biāo)記 催化大分子模板的DNA合成如M13 補(bǔ)平隱蔽末端（3）T7 DNA聚合酶的用途取代合成法標(biāo)記3末端。與T4 DNA聚合酶相同。合成補(bǔ)平3隱蔽末端； 水解修平3突出末端。5. 修飾后的T7 DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學(xué)修飾 去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7 DNA聚合酶的用途 雙脫氧法進(jìn)行長片段DNA測序的理想

36、用酶，“測序酶” 標(biāo)記DNA 3隱蔽末端 更有效地補(bǔ)平末端6. Taq DNA聚合酶最早來源于水生棲熱菌耐熱的、依賴DNA的DNA聚合酶。（1）來源（3）Taq DNA聚合酶的性質(zhì)無校正功能，高保真酶-Pfu DNA聚合酶b. PCR產(chǎn)物可以進(jìn)行T-A克隆（2）應(yīng)用PCR，最適反應(yīng)溫度75-80， 150bp / s7. 反轉(zhuǎn)錄酶最普遍使用的是來源于禽類成髓細(xì)胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）： 依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶）。（1）來源（2）AMV的性質(zhì)由和兩條多肽鏈組成。RNA腫瘤病毒。有反轉(zhuǎn)錄活性和 RNaseH活性。RNas

37、eH： 雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈反轉(zhuǎn)錄酶3 RNA5 DNA353 RNA5 DNA35反轉(zhuǎn)錄酶5 DNA3（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途 合成cDNA以oligo dT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補(bǔ)結(jié)合）AAAAATTTTT5 3 mRNA 5 cDNA 合成DNA探針用隨機(jī)引物（random primer）或oligo dT做引物。隨機(jī)引物：隨機(jī)順序形成的寡聚DNA片斷。（理論上它能與各種序列的模板結(jié)合） DNA序列分析DNA聚合酶3553聚合速率持續(xù)能力主要作用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow fragmentT4DNA聚合酶T7DNA聚合酶修飾的T7DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶

38、Taq 酶切口平移標(biāo)記DNA低有中低低低無中中低無高高無快高高快無無無無無有低快中高3端補(bǔ)平標(biāo)記DNA取代合成法標(biāo)記DNA同上，催化大分子DNA合成測序酶合成cDNAPCR用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸外切酶核酸修飾酶第二章 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)單鏈DNA內(nèi)切酶第四節(jié) DNA修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）1. TdT的基本特性 不需要模板！ 需要3-OH、二甲胂酸緩沖液。53DNA聚合酶活性（逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子3-OH末端） 隨機(jī)添加的dNTPs。 如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTPs

39、 底物可以是：單鏈DNA 3-OH突出的雙鏈DNA 平末端在Co2+代替Mg2+下也可以DNA 5 3 TTTdTTP ，末端轉(zhuǎn)移酶2. 末端轉(zhuǎn)移酶的用途（1）同聚物加尾克隆DNA片段 給外源DNA片斷和載體分子分別加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。外源DNA載體DNA5 3 5 3 CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端轉(zhuǎn)移酶（2）再生酶切位點(diǎn)便于回收克隆片斷。AAGCTT TTCGAA5 5 Hind酶切A TTCGAAGCTT AKlenow補(bǔ)平AAGCT TTCGAAGCTT TCGAAAAGCATTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA末端轉(zhuǎn)移酶AAAAAA外源D

40、NA（3）標(biāo)記DNA片斷的3端AAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAAAAAAAAHind位點(diǎn)Hind位點(diǎn)連接具有放射性同位素32P的dNTP、ddNTP為底物非放射性標(biāo)記物：生物素-11-dUTP等二、T4多核苷酸激酶1. 來源T4噬菌體的pseT基因編碼。 從T4感染大腸桿菌細(xì)胞中分離出來。多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。2. 功能 催化磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA、RNA的5-OH端。使已脫磷酸化的5末端重新磷酸化。3. 多核苷酸激酶的用途催化5-OH末端磷酸化，便于DNA分子連接； 標(biāo)記DNA或RNA的5端 5 3 HO-OH5 3 HO-OH3 32P-OH5

41、3 HO-32P5 (-32P)ATP多核苷酸激酶3 P-OH5 3 HO-P5 堿性磷酸酶（1）正向反應(yīng)（forward reaction）（2）交換反應(yīng)（exchange reaction）反應(yīng)混合物中具有超量ADP和(-32P)ATP時(shí)，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P與DNA5端的磷酸交換。3 P-OH5 3 HO-P5 3 32P-OH5 3 HO-32P5 (-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶效率低于正向反應(yīng)，反應(yīng)效果不理想 三、堿性磷酸酶1. 堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離，具有抗熱性Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）細(xì)菌性

42、堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP從小牛腸中純化，比活性比BAP高1020倍加熱70，10min可完全失活2. 堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5端的磷酸基團(tuán)。3 P-OH5 3 HO-P5 5 3 HO-OH5 3 HO-OH堿性磷酸酶3. 堿性磷酸酶的功能（1）去除DNA或RNA分子的5末端磷酸基團(tuán)，防止線性化的載體分子自我連接單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTT TTCGAAHind酶切A-OH TTCGA-PP-AGCTT HO-A堿性磷酸酶5 5 5 A-OH TTCGA-OHHO

43、-AGCTT HO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。酶切后的外源DNA的5端有P，能與脫磷酸的載體OH連接3 P-AGCTTA-OH5 3 HO-ATTCGA-P5 外源DNAA TTCGA AGCTT AAGCTTA ATTCGA 連接酶-OH與-OH連不住其中每條鏈上都有一個(gè)nick，但轉(zhuǎn)入細(xì)菌后會被修復(fù)3 P-AGCTTA-OH5 3 HO-ATTCGA-P5 外源DNA5 3 HO-OH5 3 HO-OH3 32P-OH5 3 HO-32P5 (-32P)ATP多核苷酸激酶3 P-OH5 3 HO-P5 堿性磷酸酶（2）與多核苷酸激酶共同作用，標(biāo)記DNA5末端用于核酸

44、操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸外切酶核酸修飾酶第二章 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)單鏈DNA內(nèi)切酶第五節(jié) 核酸外切酶（ Exonucleases）從多核苷酸鏈的末端開始逐個(gè)降解核苷酸一、單鏈DNA外切酶1. 大腸桿菌核酸外切酶I（exo I）53外切識別5-OH2. 大腸桿菌核酸外切酶（exo ）53、35外切產(chǎn)生短的225bp的寡核苷酸片段識別3-OH、5-P二、雙鏈DNA外切酶1. 核酸外切酶（exo ）35外切識別3-OH主要用途：在DNA雙鏈的末端產(chǎn)生出單鏈區(qū)域。5 5 5 5 exo 與Klenow配合進(jìn)行3端標(biāo)記-OHHO-2. 核酸外切酶（ exo）53外切。主要用途：使DNA雙鏈變成單鏈5 P-P 5 5 5 exo 成為測序模板。識別5-P（但不能降解5-OH）3. T7基因