菜花DNA的提取及二苯胺檢測

1、實驗 菜花DNA的提取及二苯胺檢測1一. 實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)DNA提取的原理及方法。掌握二苯胺方法檢測DNA 。2 二 .實驗原理 在濃NaCl（12M）溶液中，DNA溶解度大，RNA溶解度??； 在稀NaCl（0.14M）中，DNA溶解度小，RNA溶解度大， 因此可利用不同濃度的NaCl溶液將DNA和RNA從樣品中分開。 SDS可將核蛋白分離出來3二苯胺鑒定DNA的化學(xué)原理DNA中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成-羥基-酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈現(xiàn)藍(lán)色(溶液呈淺藍(lán)色)。鑒定時溶液藍(lán)色的深淺，與溶液中DNA含量的多少有關(guān)。 4 1核酸分離提取的原則 1）應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性 2）排除其他分子的

2、污染 A 核酸樣品中不應(yīng)存在對其有抑制作用的有機(jī)溶 劑和過高濃度的金屬離子 B其他生物大分子如：排除其他核酸分子的污染52. 核酸提取的步驟1）破碎細(xì)胞（材料不同，方法不同） 勻漿器，搗碎器，溶菌酶消化，堿裂解等。 2） 除雜質(zhì)，提DNA 雜質(zhì)：蛋白，多糖，脂類，DNase, RNA A. DNase的抑制：EDTA B. 除RNA 酶法：加RNase 6調(diào)節(jié)pH：RNA能在室溫條件下被稀堿水解成核甘酸而DNA對堿較穩(wěn)定，所以提DNA一般要在偏堿的環(huán)境中提取，提RNA要在偏酸的環(huán)境中穩(wěn)定。調(diào)節(jié)鹽濃度(鹽的分步沉淀)： C. 除蛋白加去垢劑或變性劑:SDS等用有機(jī)溶劑沉淀，除去蛋白：氯仿、異戊醇

3、，酚加蛋白水解酶：蛋白酶k7 D. 除糖，脂類 3.DNA提取注意事項減少物理因素對DNA的降解。動作輕柔緩慢，盡可能不要劇烈振蕩或攪拌.8三.實驗試劑1，5mol/L NaCl溶液; 2， 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA-Na溶液; 3，25% SDS 溶液； 4，24:1 氯仿異戊醇混合液；5，3mol/L 乙酸鈉0.001mol/L EDTA-Na溶液； 6，95%乙醇；7，二苯胺試劑：A液：1.5克二苯胺溶解于100ml冰乙酸中,在加入1.5ml濃硫酸 ； B液：.%的乙醛 實驗時，取12/6ml A液，滴入12/6滴B液，混勻使用9四. 實驗步驟（一）DN

4、A提取1，稱取 菜花5g,用水清洗后，加入半勺石英砂粘磨,再加入10ml 0.14M/LNACL-0.15MEDTA該溶液，繼續(xù)研磨至漿狀，2，上述研磨液加入1毫升，保溫，分鐘（間或攪拌）至溶液變粘稠。3，上述溶液加入的NaCL溶液5毫升，攪拌分鐘，再加入氯仿異戊醇5毫升，振搖分鐘(輕微），分裝4管，平衡后轉(zhuǎn)離心分鐘，取上清液。4，上清液加入2ml乙酸鈉-EDTA溶液，加入2倍體積的冰凍乙醇，用玻棒慢慢攪拌，可看見纏繞在玻棒上5.待DNA略干燥后，溶于1ml.NaOH溶液。10（二） 二苯胺法檢測DNA1.按照以下表格添加 沸水浴加熱10分鐘，冷卻后觀察顏色變化。試管1試管2DNA提取液1ml1ml NaOH溶液二苯胺試劑6ml