病理檢驗(yàn)技術(shù)(1)(共18頁)

1、熒光(ynggung)原位雜交 FISH用DNA探針與組織切片上互補(bǔ)(h b)的DNA雜交，通過觀察熒光信號(hào)在染色體上的位置和顏色來反映相應(yīng)基因的情況 。第一章 病理檢驗(yàn)(jinyn)技術(shù)概述病理學(xué)的作用： 1、研究疾病的病因、發(fā)病機(jī)制，認(rèn)識(shí) 疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律 2、為臨床診斷疾病、治療疾病、分析預(yù) 后提供依據(jù)等。病理檢驗(yàn)的定義： -在臨床醫(yī)療實(shí)踐中，通過對(duì)患者病變組織或細(xì)胞進(jìn)行檢查，以協(xié)助臨床診斷疾病的方法稱為病理檢驗(yàn)。一、病理檢驗(yàn)的主要任務(wù)（一）確定疾病的診斷（二）為臨床選擇治療方案提供依據(jù)（三）提供有關(guān)預(yù)后因素的信息。（最正確、最可靠、最后的診斷）（四）了解疾病的發(fā)展及分析療效（五）為科

2、學(xué)研究積累資料（六）為提高臨床診斷水平服務(wù)二、病理檢驗(yàn)分類（一）細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)（脫落細(xì)胞、細(xì)針穿刺吸取）（二）組織學(xué)檢驗(yàn)-最后的診斷 活體組織檢驗(yàn)、手術(shù)標(biāo)本檢驗(yàn)、手術(shù)中病理檢驗(yàn)（三）尸體剖驗(yàn)病理學(xué)技術(shù)： 在病理學(xué)臨床及科學(xué)研究工作中使用的各種技術(shù)方法統(tǒng)稱為病理學(xué)技術(shù)。病理檢驗(yàn)技術(shù)的質(zhì)量和水平是臨床病理診斷工作中至關(guān)重要的因素。“技術(shù)是病理學(xué)之母?！钡诙?jié)、病理檢驗(yàn)技術(shù)常規(guī)工作收發(fā)工作協(xié)助取材和尸體剖檢工作制作制作切片及細(xì)胞學(xué)涂片病理資料管理及檢索藥品、物資的管理及儀器維護(hù)大體標(biāo)本的收集和制作第六章 組織(zzh)制片技術(shù) P39常規(guī)石蠟(sh l)切片制作程序組織(zzh)固定取材固定脫水透明浸蠟

3、包埋切片染色封片觀察第一節(jié) 組織塊的處理（一）組織切片制作過程中的各種操作： 1、取材與固定：合理取材、及時(shí)固定； 2、洗滌、脫水、透明； 4、浸蠟、包埋； 5、切片、貼片（展片、撈片）和染色： 6、封片：長(zhǎng)期保存。 一、取材： -按照病理檢查的目的和要求，切取適當(dāng)大小和數(shù)量的組織塊，用于制作組織切片的過程。 注意事項(xiàng)： 部位、大小、形狀、方向二、固定和固定液 固定：將組織浸入某些化學(xué)試劑，使組織細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)盡量保持在生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置過程。（一）固定目的： （1）防止組織、細(xì)胞的自溶與腐?。?（2）凝固或沉淀細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)； （3）增加組織硬度，便于制片； （4）產(chǎn)生不同的折光率，有利于

4、染色后觀察辨認(rèn)。（二）固 定 方 法：1、浸泡固定法：病理外檢一般均用此法；2、注射、灌注法：體積過大或整個(gè)臟器或尸體的固定；3、微波固定法：應(yīng)用于臨床病理快速診斷，微波固定組織溫度至關(guān)重要。微波固定介質(zhì)可用 生理鹽水或10%甲醛。4、蒸汽固定法：為了固定組織中可溶性物質(zhì)、 血液、細(xì)胞涂片等；（三）固定液的特性：1、滲透力強(qiáng)，迅速滲入組織內(nèi)部2、不會(huì)使組織過度收縮或膨脹3、能硬化組織，保持細(xì)胞形態(tài)和位置4、使組織對(duì)染料產(chǎn)生親和力，產(chǎn)生折光率 （四）組織固定注意事項(xiàng)：1、及時(shí)固定2、固定容器宜大3、固定液應(yīng)足量：固定組織體積的10-20倍4、防止組織變形5、確定恰當(dāng)?shù)墓潭〞r(shí)間（五）組織固定液常用

5、固定液： 1、4%甲醛（福爾馬林）：配置為市售的40%甲醛1份加水9份混合即成； 2、酒精（乙醇）：高濃度組織硬化顯著，先用80%固定數(shù)小時(shí)，再用95%固定； 3、中性緩沖甲醛液：可提高免疫組化陽性率。 4、酒精(jijng)-甲醛液（A-F固定液）： 5、Zenker固定(gdng)液：1、4%甲醛(ji qun)（福爾馬林）：久置能產(chǎn)生白色沉淀（三聚甲醛），容易氧化變成甲酸，嚴(yán)重影響細(xì)胞核著色。 固定陳舊多血臟器如肝脾，易產(chǎn)生黑色色素，叫甲醛色素。2、酒精（乙醇）： 高濃度組織硬化顯著，先用80%固定數(shù)小時(shí)，再用95%固定； 50%以上濃度的乙醇可溶解脂肪和類脂質(zhì)，也可以溶解血色素和損害其

6、他色素。中性甲醛液配置：40%甲醛150-200ml，蒸餾水800-850ml，磷酸二氫鈉4g，磷酸氫二鈉13g。 常用的固定液或標(biāo)本保存液，是免疫組化最常用的固定液。選擇性固定液：1、丙酮：廣泛用于組織化學(xué)中酶的固定；2、戊二醛固定液：廣泛用于電鏡標(biāo)本的固定，應(yīng)采用緩沖液配制固定液3、醋酸：不能保存糖，也不能固定脂肪及類脂，5%醋酸pH23可抑制細(xì)菌和酶的活性；4、苦味酸：強(qiáng)酸，易燃易爆，酒精溶液可固定糖類；5、氯化汞：只宜固定薄片組織，2mm3mm厚的組織需固定618小時(shí)；6、重鉻酸鉀：固定高爾基體、線粒體，對(duì)酸性染料著色良好；7、鋨酸：濃度為1%2%水溶液用于電鏡制片；骨組織脫鈣液： 在

7、脫鈣前，先將骨或鈣化組織鋸成4mm5mm厚的簿片，按常規(guī)充分固定，然后進(jìn)行脫鈣。組織脫鈣的方法及應(yīng)用：（一）酸性溶液脫鈣： 1、脫鈣液配制：（1）5%10%硝酸水溶液：濃硝酸5ml10ml，蒸餾水加至100ml；（2）硝酸甲醛液：濃硝酸10ml，10%福爾馬林90ml；（3）Schridde液：濃硝酸20ml，10%福爾馬林100ml。對(duì)組織無明顯損害，迅速、安全；（4）5%10%甲酸水溶液：甲酸5ml10ml，蒸餾水加至100ml（5）甲酸酒精液：脫鈣速度較硝酸慢，但破壞組織也輕。（6）Plank-Rychlo液：脫鈣比5%硝酸液快3倍。Jenkins混合酸脫鈣液、鹽酸氯化鈉液、枸櫞酸鈉、甲

8、酸脫鈣液等2、脫鈣方法：骨片懸于脫鈣液中，敞開瓶口，每日更換一次新液，最好早晚各一次。（二）螯合劑脫鈣：速度很慢，但對(duì)組織成分幾乎沒有損害。用于免疫組化染色較理想。1、脫鈣液配制：取乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）25g，溶解于200ml蒸餾水中，氫氧化鈉（NaOH）調(diào)整pH至7.0（大約加2.5g NaOH）。EDTA與鈣可形成一種可溶性非離子化的復(fù)合物。2、脫鈣法：將骨片浸入脫鈣液中，每周更換一次新液。一般致密骨脫鈣需要68周，含有少量(sholing)骨渣的組織約需一周。（三）電解脫(jitu)鈣法： 此法即在脫鈣液中通過電流(dinli)，電解加速脫鈣。1、電解脫鈣液配制： 25%鹽酸50

9、ml，25%甲酸200ml，蒸餾水750ml；2、脫鈣方法：直徑30cm電解槽內(nèi)盛大量電解液，將骨組織放在一個(gè)四周多孔的塑料小容器內(nèi)放入電解液內(nèi)，此容器通入白金絲或鎢絲作陽極，在電解液內(nèi)再放一白金絲或鎢絲作陰極，通入6V直流電，電流強(qiáng)度1A2A，調(diào)節(jié)兩電極的距離來控制。電解液溫度不超3045，一般26小時(shí)即可脫盡。脫鈣后的處理1、脫鈣后的組織經(jīng)流水沖洗412小時(shí)，除去殘留的脫鈣劑；2、修去鋸面的薄層組織，切成適當(dāng)大小的組織塊，進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟及包埋；3、用酸性液脫鈣后的組織，蘇木素染色時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)，在伊紅中的時(shí)間應(yīng)該縮短；4、脫鈣后組織切片在染色中較易脫落，充分烤片，染色前滴加2%5

10、%的火棉膠液，以使之粘貼牢固。三、 洗滌、脫水、透明（一）組織的洗滌1、洗滌的目的：防止組織中留有較多的固定液而影響脫水劑；2、洗滌的方法： （1）固定劑以水配制者：常用的固定劑是甲醛溶液（10%福爾馬林溶液），用流水沖洗。大組織沖洗24小時(shí)，小組織沖洗24小時(shí)。（2）固定劑含酒精者：一般不用沖洗，如需要沖洗必須用與固定劑中的酒精濃度相近或略低的酒精沖洗 。（二）組 織 脫 水1、脫水的目的及原則：用某些溶劑逐漸將組織內(nèi)吸收的水分置換出來，以利于透明劑和石蠟或火棉膠的滲入。2、脫水劑的種類及特征： 特征：能與水在任何比例下混合；能與透明劑在任何比例下混合； 單純脫水劑：脫水后再經(jīng)二甲苯透明才浸

11、蠟； 酒精：最常見的脫水劑。脫水能力強(qiáng)，但易使組織收縮、脆。 單純脫水劑：脫水后再經(jīng)二甲苯透明才浸蠟；丙酮：脫水強(qiáng)，組織收縮嚴(yán)重，價(jià)格高。異丙醇：可代替無水酒精使用。價(jià)格貴。脫水兼透明劑：脫水后即可直接浸蠟。正丁醇：為脫水劑兼有透明劑作用。用于植物標(biāo)本的處理效果較好。叔丁醇：脫水兼透明。電鏡標(biāo)本制作時(shí)常用作中間脫水劑。（三）組織(zzh)透明或媒浸 目的是使石蠟(sh l)能浸入組織塊便于包埋。1、二甲苯：最常用的透明劑，有毒、易揮發(fā)，透明力強(qiáng)，但組織(zzh)易收縮變脆，小塊組織以30分鐘。2、苯和甲苯：組織收縮小、不易變脆。3、氯仿：即三氯甲烷。易發(fā)揮，透明力比二甲苯差，時(shí)間長(zhǎng)，多用于大塊

12、組織的透明。4、香柏油：為柏樹樹脂，收縮小，透明時(shí)間長(zhǎng)，常用于染色后切片的透明。四、組織浸蠟（透蠟） P48（一）浸蠟的目的和方法：除去組織中的透明劑而代之以石蠟，以便切片。（二）浸蠟劑的種類：1、石蠟：經(jīng)5658石蠟浸蠟的組織包埋，有利于組織切片的連續(xù)性，對(duì)蠟塊資料保存可靠，一般為3-4小時(shí)。2、火棉膠：目前使用火棉膠浸入組織較少，多用于染色前的覆蓋液。3、碳蠟；4、明膠。五、組 織 包 埋 P49（一）石蠟包埋法：為最常用的包埋法。1、常規(guī)石蠟包埋法:包埋過程、包埋面的選擇；2、體液標(biāo)本一般不做包埋和切片。（二）快速石蠟包埋法：1、操作過程：全程均加熱，2030分鐘完成。（1）取材、固定：

13、薄片1cm0.5cm0.3cm,在快速固定液（95%酒精、40%甲醛、冰醋酸）內(nèi)加熱煮沸12分鐘。（2）脫水：組織厚度不超1.5mm，加入丙酮5 8ml，煮沸56分鐘。（3）透明：加二甲苯加熱12分鐘。（4）包埋：石蠟包埋冰水冷卻硬化。3、碳蠟包埋法：即聚乙烯二醇。包埋熔點(diǎn)為38和52左右的分子量為1500和4000兩種。適用于脂肪及脂類組織的制片。4、明膠包埋法：5、石蠟半薄切片包埋法：常根據(jù)組織類型進(jìn)行脫水、透明和浸蠟。6、樹脂包埋法：適用于不脫鈣骨髓活檢組織、肝、腎穿刺活檢和淋巴結(jié)組織等。第二節(jié) 切片器具與切片一、切片機(jī)：制作組織切片的主要儀器設(shè)備。（一）切片機(jī)的種類及使用：1、石蠟切片

14、機(jī)：能將石蠟包埋的組織切出一定厚薄的切片。分為旋轉(zhuǎn)式、滑動(dòng)式、擺動(dòng)式等。最常用的為旋轉(zhuǎn)式。2、冷凍切片機(jī)：多為恒冷箱切片機(jī)用于組織化學(xué)、免疫組化及病理診斷。 3、火棉膠切片機(jī)：多用于眼球、內(nèi)耳、脊髓和腦的切片，切片厚度可達(dá)20m50。二、組織切片刀 P58（一）切片刀的種類： 其長(zhǎng)度一般有 4cm、8cm、14cm、18cm、20cm、24cm等。1、平凹型：一側(cè)為直線，另一側(cè)為凹度，大凹度刀適用于火棉膠切片，小凹度刀適于石蠟切片。2、雙平型：刀身兩側(cè)均無凹度(o d)，兩面是平面。適用于冷凍切片和輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)的石蠟切片。3、雙凹型：刀身兩側(cè)均有凹度，適用(shyng)于輪轉(zhuǎn)式石蠟切片。4、一

15、次性刀片：需配置(pizh)專用刀架。（二）刀背套與刀柄：刀背套供磨刀時(shí)用，刀背套有金屬和塑料兩種。刀柄有木制及塑料制兩種。（三）磨刀與被刀：1、手工磨刀法：磨刀前用軟布試凈磨刀石面塵垢；裝上刀背和刀柄，滴磨刀油于磨刀石上；右手緊握刀柄，左手緊按刀背另一端，刀刃向前，逐漸推動(dòng)刀片至磨刀的一端，從右到左全部磨完。2、被刀：用被刀皮革被刀，與磨刀的動(dòng)作相反；三、石蠟切片制作 P60（一）切片前的準(zhǔn)備： 修整蠟塊，然后置于冷水或冰箱中冷卻，以增加硬度； 準(zhǔn)備毛筆、眼科彎鑷子； 載玻片均勻涂上薄層蛋清甘油，占2/3； 接通攤片機(jī)電源，調(diào)節(jié)攤片（4248） 烤片（60-70左右）的溫度；（二）快速石蠟切

16、片 P63 快速石蠟切片時(shí)，組織取材應(yīng)薄，厚度一般不超過2mm，組織固定后要重新修正至1.5mm左右厚度，以利脫水，將組織塊埋入預(yù)制的蠟塊內(nèi)，冷卻硬化后方可切片（取材、脫水、透明浸蠟、包埋見）。 切片撈至載波片上，用酒精燈略加烘烤，再入二甲苯脫蠟，經(jīng)95%酒精后即刻入水水化，隨后即可進(jìn)行常規(guī)快速蘇木素伊紅染色。（三）冷凍切片制作 P64 組織經(jīng)過冷凍后，其內(nèi)的水分結(jié)冰，使組織變硬，有利于切成薄片。一、設(shè)備要求：（一）冷凍切片機(jī)：一般由轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)或推拉式切片機(jī)加上制冷裝置而成：1、二氧化碳制冷器；2、半導(dǎo)體制冷器；（二）恒冷箱冷凍卻片機(jī)：利用壓縮機(jī)通過制冷劑循環(huán)制冷。冰凍切片機(jī)二、制作過程（一

17、）取材、固定：選取有代表性的組織制片，厚度12mm。一般病理急診、組織化學(xué)顯示酶和免疫病理學(xué)進(jìn)行熒光抗體研究等，多數(shù)都用新鮮組織直接冷凍，切片后再進(jìn)行固定、染色或直接染色或孵化。采用二氧化碳冷凍設(shè)備制作須先固定。（二）冷凍(lngdng)切片方法：1、恒溫箱冷凍(lngdng)切片法（1）開機(jī)預(yù)冷：切片(qi pin)前23小時(shí)，所需溫度如下： 各種新鮮組織冷凍切片參考溫度（）腦、淋巴結(jié)、肝、腎、脾、睪丸 -12-16肌肉、腎上腺、甲狀腺、子宮、卵巢 -18-22乳腺、皮膚、前列腺 -22-28 （2）放入、速凍、修整組織，待恒冷箱內(nèi)溫度降至要求溫度后，將組織用OT包埋，再速凍12分鐘，裝于機(jī)

18、樣本夾上，修平； （3）調(diào)節(jié)抗卷板，以與刀刃平行對(duì)齊；（4）切片：所需厚度為4m8m，用毛筆展平，貼于潔凈玻片上，晾干或吹干后染色；（5）切片后處理：清潔保養(yǎng)。2、半導(dǎo)體冷凍切片法3、二氧化碳冷凍切片法（三）冷凍切片粘片法1、蛋白甘油粘片法： 按石蠟切片的粘片法處理，但溫度不宜超過40?？靖珊蠹慈〕觯?0%酒精和自來水洗后即可染色。2、Lillie明膠粘片法：切片放入1%明膠水溶液數(shù)分鐘，撈到載玻片上，5%甲醛水溶液固定5分鐘，水洗10分鐘，即可染色。3、酒精明膠粘片法：切片浸入0.1%或0.75%明膠溶液（用40%酒精配制）數(shù)分鐘，用載玻片撈起后，室溫干燥，入氯仿1分鐘，經(jīng)95%和75%酒精

19、洗去氯仿，再經(jīng)蒸餾水洗后即可染色。三、注意事項(xiàng)1、冷凍切片的組織不用固定；2、組織盡可能新鮮，不能用濕的鹽水紗布包裹和放入10冰箱內(nèi)緩慢冷卻，否則組織內(nèi)水分可逐漸析出形成水晶，造成組織結(jié)構(gòu)破壞；3、冷凍包埋劑應(yīng)適量；4、組織太小，不能做冷凍切片；5、冷凍時(shí)間太久的組織不能馬上切片，以免損傷切片刀；6、一般來說骨組織和鈣化組織不能做冷凍切片。觀察第七章組織切片染色技術(shù)第一節(jié) 病理切片染色概述 P68一、概念：用染液對(duì)組織切片進(jìn)行處理，使組織中的不同成分被染上相應(yīng)的顏色，產(chǎn)生不同的折射率，以利于顯微鏡觀察和分析。三、染色的原理 染色就是染色劑和組織細(xì)胞相結(jié)合的過程。（一）染色的化學(xué)反應(yīng)：組織細(xì)胞的

20、酸性物質(zhì)與堿性染料的陽離子相結(jié)合，堿性物質(zhì)與酸性染料的陰離子相結(jié)合。具有(jyu)酸性的細(xì)胞核被堿性蘇木素液所染色，堿性的胞質(zhì)與酸性染料伊紅所染色。（二）染色(rns)的物理作用：1、滲透作用：染料進(jìn)入組織；2、吸附作用：把另一種物質(zhì)的分子、原子、離子集中在界面上的過程；3、吸收(xshu)作用（溶解作用）。三、常用染料概述：（一）染料的性質(zhì)：有色的無機(jī)物或有機(jī)化合物1、發(fā)色團(tuán)：能使染料分子產(chǎn)生顏色的基團(tuán)，叫發(fā)色團(tuán)；2、助色團(tuán)：能使染料分子顏色加深，并與被染物質(zhì)分子形成親和力的基團(tuán)。（二）染料的分類：1、據(jù)染料來源：天然、合成染料和無機(jī)化合物2、根據(jù)染料化學(xué)反應(yīng)：酸性、堿性和中性染料3、據(jù)染色

21、對(duì)象：（1）組織染料： 1）結(jié)締組織和肌纖維染料：有膠原纖維、網(wǎng)狀纖維、彈力纖維和肌原纖維等染料； 2）神經(jīng)組織的染料：尼氏體、神經(jīng)軸突、神經(jīng)髓鞘、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等染料；（2）細(xì)胞染料：細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)染料等 常用染色劑簡(jiǎn)介見附錄一。五、常用染色術(shù)語的概念一、普通染色：最常應(yīng)用的是蘇木素-伊紅染色法，簡(jiǎn)稱HE染色。二、特殊染色：特染是為了顯示特定的組織結(jié)構(gòu)或其他的特殊成分。三、單一染色：選用一種染料染色。四、復(fù)染色：用兩種不同性質(zhì)的染料染色方法。五、多種染色法：用兩種以上染料的染色法。第三節(jié) 染色前后的處理 P74一、染色前的處理：1、脫蠟至水：必須經(jīng)過二甲苯脫蠟、各級(jí)酒精（100%、95%、85

22、%、75%）至水洗的過程。2、脫汞鹽結(jié)晶：切片在脫蠟后用0.2%0.5%碘酒精處理515分鐘，使汞鹽沉淀物溶解。3、脫甲醛色素：在切片脫蠟至水后，用Verocay液（1%氫氧化鉀水溶液1ml，80%酒精100ml）處理10分鐘，然后流水沖洗5分鐘再常規(guī)染色。（二）染色后的處理：1、分化作用：必須用1%鹽酸酒精脫去所吸附的染料。2、藍(lán)化作用：分化后，用堿性水使細(xì)胞核變成藍(lán)色。3、染色后的脫水：低度到高度酒精逐步脫水。4、染色后的透明：透明劑用二甲苯。三、封固：1、封固劑：（1）甘油明膠封固劑 配制(pizh)方法：明膠10g，蒸餾水60ml，甘油70ml，石炭酸0.25g。（用前將甘油明膠置于溫

23、箱內(nèi)融化后即可封片）。（2）中性樹膠（二甲苯樹膠液）：屬油性封固劑，組織切片需徹底脫水、透明。優(yōu)良(yuling)封固劑，可直接封片。 七、染色(rns)的注意事項(xiàng)（1）具備實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)備和染色準(zhǔn)備工作（2）正確完成固定、脫水、透明、脫蠟步驟；（3）染色過程中，既要按書本的方法進(jìn)行操作，又要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行靈活運(yùn)用。第八章 組織切片常規(guī)染色技術(shù)第一節(jié) 常規(guī)染色的概念一、染色原理（一）蘇木素染色原理：蘇木紅和鋁結(jié)合形成帶正電的 藍(lán)色色精，帶負(fù)電的細(xì)胞核與帶正電的藍(lán)色色精以離子鍵或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木素在堿性溶液中呈藍(lán)色，所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。（二）伊紅染色原理：伊紅Y是一種化學(xué)合成的酸性染料。

24、在伊紅Y染料液中加入醋酸，使胞質(zhì)中蛋白質(zhì)帶正電荷，可被帶負(fù)電的伊紅染料染色，從而使細(xì)胞質(zhì)及紅細(xì)胞等染成紅色或粉紅色，與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明的對(duì)比。二、染液的配制 P80（一）蘇木素液：從蘇木素的樹中提煉的天然染料。1、Harris蘇木素液：最常用。 蘇木素 1g 蒸餾水 200ml 無水酒精 10ml 氧化汞 0.5g 硫酸鋁鉀 20g配置方法見書81頁。染色34分鐘。保存時(shí)間為一年。（二）伊紅染液：0.5%伊紅酒精染液:醇溶伊紅Y0.5g，95%酒精100ml。染色時(shí)間13分鐘。水溶性伊紅酒精液：沉淀酸化伊紅Y酒精液： 2、Mayer蘇木素改良配法：（1）A液：蘇木素2g，無水酒精40ml加

25、熱溶解；（2）B液：硫酸鋁鉀100g，蒸餾水600ml，稍加熱使硫酸鋁鉀在水中溶解，再將A與B液混合2分鐘。用蒸餾水補(bǔ)足600ml，加入400mg碘酸鈉充分混勻，蘇木素染液呈紫紅色即可。染色時(shí)間為1020分鐘。 3、Ehrlich蘇木素液：蘇木素2g，無水酒精100ml，甘油100ml，硫酸鋁鉀15g，蒸餾水100ml，冰醋酸10ml。（染色時(shí)間為1020分鐘）。 4、Gill改良蘇木素液：蘇木素2g，無水酒精250ml，硫酸鋁鉀17.6g，蒸餾水750ml，碘酸鈉0.2g,冰醋酸20ml。染色時(shí)間為5分鐘。 （三）0.5%1%鹽酸(yn sun)酒精分化液：鹽酸 0.5ml1ml, 75%酒

26、精99ml。此液用一段時(shí)間后需要延長(zhǎng)時(shí)間或更換液體，新液體分化(fnhu)時(shí)間要短。（四）藍(lán)化液：“藍(lán)化”是指蘇木素液染細(xì)胞核后，通過鹽酸酒精分化，切片由酸性轉(zhuǎn)入(zhun r)弱堿性液體，使之變藍(lán)的過程。 1、50溫水2、稀氨水（1%氫氧化銨液）3 蒸餾水 100ml，氨水1ml。三、染色方法 P83（一）人工操作蘇木素-伊紅染色方法：1、脫蠟至水：（1）二甲苯脫蠟（脫蠟2-5分鐘）；（2）二甲苯（2-5分鐘）；（3）無水酒精（1-2分鐘）；（4）95%酒精1分鐘；（5）85%酒精1分鐘；（6）75%酒精1分鐘；（7）自來水洗2分鐘；2、蘇木素染色：蘇木素液染色5-10分鐘；自來水洗1分鐘；

27、3、分化返藍(lán)：0.5%1%鹽酸酒精分化數(shù)秒至30分鐘呈紫紅色；自來水1分鐘；用溫水(50)藍(lán)化515分鐘(或稀氨水藍(lán)化30秒，自來水洗510分鐘)；4、伊紅染色：水溶性伊紅可直接入伊紅液，1分鐘；自來水洗1分鐘；5、脫水、透明：（1）85%酒精（20秒）；（2）95%酒精（1分鐘）；（3）無水酒精（1分鐘）；（4）二甲苯（12分鐘）；（5）二甲苯（12分鐘）。6、封固：（1）用中性樹膠封片；（2）附貼標(biāo)簽可書寫病理編號(hào)。（二）冷凍切片HE染色： 冷凍切片貼片后，用95%酒精和冰醋酸5ml的混合液固定1分鐘，自來水洗30秒1分鐘，HE染色。（三）快速石蠟切片染色：脫蠟至水、HE染色第三節(jié) 染色中

28、常見問題及注意事項(xiàng) P85 HE染色結(jié)果： 細(xì)胞核被蘇木素染成明顯的藍(lán)色； 細(xì)胞質(zhì)被伊紅染成紅色。 組織切片特殊染色 P87為了顯示特定的組織結(jié)構(gòu)或組織細(xì)胞特殊成分，采用特定的染料(rnlio)和方法對(duì)組織切片進(jìn)行染色。第一節(jié) 結(jié)締組織(jid-zzh)染色 P88一、 膠原纖維染色(rns)Van Gieson染色法（簡(jiǎn)稱VG染色）（書上無）1、染料配制：（1）鐵蘇木素液：見Masson三色染色（2）Van Gieson苦味酸酸性品液： 甲液：1.22%苦味酸飽和水溶液90ml， 乙液 ： 1%酸性品紅水溶液10ml。 兩液提前配制，臨用前混合使用。2、染色步驟：（1）切片脫蠟至水 （2）蒸

29、餾水洗（3）Weigert鐵蘇木素液染510分鐘（4）自來水洗2分鐘（5）據(jù)情況可用0.5%鹽酸酒精分化（6）自來水洗至變藍(lán)再用蒸餾水洗（7）Van Gieson液染色35分鐘（8）去染液，用95%酒精分化脫水（9）無水酒精脫水 （10）二甲苯透明（11）中性樹膠封固。3、染色結(jié)果：膠原纖維紅色,肌纖維黃色,細(xì)胞核黑色.4、膠原纖維染色的應(yīng)用 P88（1）對(duì)梭形細(xì)胞腫瘤來源、性質(zhì)提供診斷和鑒別診斷的依據(jù)； （2）顯示各種組織、器官病變時(shí)的修復(fù)情況與纖維化程度，如肝穿組織中纖維組織的含量與分布的觀察； （3）鑒定心肌壞死后疤痕的形成； （4）鑒別心內(nèi)膜彈力纖維增生癥與心內(nèi)膜心肌纖維化。三、 網(wǎng)狀

30、纖維染色Gomori銀染法: P921、染液配制：銀氨溶液：甲液：硝酸銀10.2g,蒸餾水100ml；乙液:氫氧化納3.1g,蒸餾水100ml2、染色步驟：（1）切片脫蠟至水（2）高錳酸鉀氧化液（高錳酸鉀0.5g,蒸餾水95ml,再加3%硫酸5ml)5分鐘(3)水洗1分鐘(4)2%草酸漂白2分鐘,水洗2分鐘(5)2%硫酸鐵銨媒染2分鐘(6)蒸餾水充分洗(7)氨銀溶液染色1分鐘(8)蒸餾水洗3次(9)20%福爾馬林液還原5分鐘(10)蒸餾水洗2次(11)入0.2%氯化金液中調(diào)色2分鐘,蒸餾水洗2次(12)2%硫代硫酸鈉固定2分鐘,自來水、蒸餾水洗（13）必要時(shí)用VG或伊紅復(fù)染（14）無水酒精脫水

31、（15）二甲苯透明（16）中性樹脂封固。3、染色結(jié)果：網(wǎng)狀纖維呈黑色，膠原纖維呈紅色。4、網(wǎng)狀纖維染色(rns)的應(yīng)用（1）區(qū)分(qfn)上皮性與非上皮性腫瘤；（2）區(qū)分(qfn)血管內(nèi)皮瘤與血管外皮瘤；（3）判斷原位癌與早期浸潤(rùn)癌；（4）觀察肝臟病變處的網(wǎng)狀支架塌陷或增生的情況，判斷病變性質(zhì)、程度及發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。四、多色染色： P93（一）Masson三色染色法： P931、染液配制：（1）麗春紅酸性品紅液：麗春紅0.7g，酸性品紅0.3g，冰醋酸1ml，蒸餾水99ml（先配好醋酸溶液后，分別溶解麗春紅或酸性品紅）；亮綠液：亮綠1.0g，冰醋酸1ml，蒸餾水99ml。（2）苯胺藍(lán)液：苯胺藍(lán)2g

32、，冰醋酸2ml，蒸餾水加至100ml。（3）Weigert鐵蘇木素液：甲液：蘇木素1g，95%酒精或無水酒精100ml；乙液：29%三氯化鐵水溶液4ml，純鹽酸1ml，蒸餾水95ml（臨用前取甲、乙兩液混合即可，24小時(shí)內(nèi)使用有效。）2、Masson三色的染色步驟：（1）切片脫蠟至蒸餾水；（2）Weigert鐵蘇木素染色510分鐘；（3）流水稍洗；（4）鹽酸酒精分化；（5）流水沖洗數(shù)分鐘；（6）麗春紅酸性品紅液染色5分鐘；（7）蒸餾水稍沖洗；（8）1%磷鉬酸水溶液處理5分鐘，鏡下見肌肉纖維呈紅色，膠原纖維呈淡紅色即可；（9）不經(jīng)水而直接用苯胺藍(lán)液或亮綠液染5分鐘；（10）1%冰醋酸處理1分鐘；

33、（11）95%酒精、無水酒精脫水；（12）二甲苯透明；（13）中性樹膠封固。3、染色結(jié)果：膠原纖維呈藍(lán)色（用苯胺藍(lán)染）或綠色（用亮綠染），肌纖維、細(xì)胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色。（二）Mallory三色染色法 P941、染液配制：（1）0.5%酸性品紅水溶液；（2）苯胺藍(lán)橙黃G液：苯胺藍(lán)0.5g，橙黃G 2g，磷鎢酸1g，蒸餾水100ml。（先將1%的磷鎢酸溶液配好，一半用于溶解苯胺藍(lán)，另一半用于溶解橙黃G，加熱溶解，冷卻后分別過濾，可長(zhǎng)期保存。臨用前將兩液混合）。（3）重鉻酸鉀液；2、染色步驟：（1）切片脫蠟至水；（2）Zenker固定液固定1小時(shí)；（3）充分水洗；（4）0.5%碘酒精處理51

34、0分鐘；（5）0.5%硫代硫酸納處理25分鐘；（6）充分水洗，再用蒸餾水浸洗；（7）酸性(sun xn)品紅液染5分鐘；（8）水洗、蒸餾水洗；（9）苯胺藍(lán)橙黃(chnghung)-G液染2030分鐘；（10）直接95%酒精快速(kui s)分化；（11）無水酒精脫水；（12）二甲苯透明；（13）中性樹膠封固。3、染色結(jié)果：膠原纖維、網(wǎng)狀纖維呈藍(lán)色，心機(jī)纖維橘紅色，紅細(xì)胞呈淺黃色，細(xì)胞核呈黑色。結(jié)締組織復(fù)合染色的應(yīng)用（1）區(qū)分各種纖維成分；（2）判定各種組織、器官的病變程度和修復(fù)情況；（3）鑒別某些梭形細(xì)胞軟組織腫瘤的來源的判斷（4）用于腎小球腎炎的診斷。第二節(jié) 肌肉組織染色 P95（一）Mal

35、lory磷鎢酸蘇木素染色法（簡(jiǎn)稱PTAH）：1、染液配制（1）磷鎢酸蘇木素：蘇木素0.1g, 磷鎢酸2g, 蒸餾水100ml。 將蘇木素加入20ml蒸餾水中,加熱溶解，再將磷鎢酸溶于80ml蒸餾水中。蘇木素冷卻后將兩液混合放置33月后使用。此液可保存數(shù)年。急用時(shí)可加高錳酸鉀0.15g促成熟,1224小時(shí)即可用。（2）酸性高錳酸鉀液：5%高錳酸鉀水溶液50ml； 0.5 硫酸水溶液50ml。 2、染色步驟：（1）組織以Zenker液固定最佳；如用甲醛固定則先要用Zenker液處理（37溫箱內(nèi)）3小時(shí)；（2）切片脫蠟至水，用碘液除汞，用95%酒精脫碘；（3）充分水洗；（4）酸性高錳酸鉀液處理510

36、分鐘（5）自來水洗2分鐘；（6）1%草酸漂白1分鐘；（7）自來水洗，蒸餾水洗2次；（8）磷鎢酸蘇木素液浸染2448小時(shí)；（9）直接用95%酒精分化；（10）無水酒精脫水；（11）二甲苯透明；（12）中性樹膠封固。3、染色結(jié)果：橫紋肌纖維、細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，膠原纖維、網(wǎng)狀纖維呈玫瑰紅色。4、肌肉組織染色 常用于Mallory磷鎢酸-蘇木素染色法能顯示與區(qū)分：(1)橫紋肌纖維的正常與異常形態(tài)；(2)診斷心肌損傷早期病變及全身彌漫性血管內(nèi)凝血有一定參考價(jià)值；(3)用于橫紋肌肉瘤時(shí)顯示橫紋，(4)用于顯示(xinsh)神經(jīng)膠質(zhì)。第三節(jié) 脂肪(zhfng)染色 P96 蘇丹(sdn)染色法： (書上無)1

37、、染料配制：（1）蘇丹染液：蘇丹 0.15g,60%70%酒精100ml。（將蘇丹染料溶于60%70%酒精形成飽和液，作長(zhǎng)期備用液。臨時(shí)配制時(shí)需要過濾才可使用。備用液僅用上清液。密封容器存放備用液）。 （2）甘油明膠液：明膠 5g，甘油35ml， 蒸餾水 35ml。（先將明膠溶于蒸餾水中加熱溶解，再加甘油充分混合，加12粒石炭酸。冷卻后4保存，用時(shí)水浴加熱）。2、蘇丹染色步驟：（1）冷凍切片厚8m10m；（2）蒸餾水稍洗；（3）Harris蘇木素12分鐘；（4）自來水洗，鹽酸酒精分化、反藍(lán)；（5）水洗、蒸餾水洗；（6）70%酒精浸洗；（7）蘇丹染液3060分鐘（如置于56溫箱中可縮短時(shí)間）；（

38、8）70%酒精分化數(shù)秒；（9）蒸餾水洗；（10）在空氣中稍晾干；（11）甘油明膠液封固。3、注意事項(xiàng)：采用冰凍切片染色。蘇丹染液溫浸時(shí)應(yīng)加蓋，防止染液中的酒精或丙酮揮發(fā)。在封固前，甘油明膠液應(yīng)放置56溫箱中加溫，避免搖蕩，防止封固時(shí)出現(xiàn)氣泡。切片染色后不能長(zhǎng)期保存，應(yīng)盡快觀察或照相。4、染色結(jié)果：脂肪呈橘紅色，脂肪酸不作色，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色。5、脂肪染色的應(yīng)用 （1）鑒別細(xì)胞內(nèi)空泡的性質(zhì)（水樣變性、脂肪變性或糖原）； （2）顯示動(dòng)脈粥樣斑塊病灶內(nèi)的脂質(zhì)沉積、脂肪栓塞。 （3）神經(jīng)系統(tǒng)一些變性、脫髓鞘疾病的診斷有極為重要的作用。 （4）脂肪染色主要用于卵巢纖維瘤與卵泡膜細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤、皮脂腺癌

39、的診斷和鑒別診斷。第四節(jié) 糖原染色與粘液染色一、過碘酸雪夫染色法（PAS法）：P981、染色配制：（1）過碘酸氧化液：過碘酸0.5g，蒸餾水100g。（此溶液應(yīng)放4冰箱保存）。（2）Schiff液：堿性品紅 1g，1mol/L鹽酸 20ml，偏重亞硫酸鈉（鉀）1g，雙蒸餾水200ml。（先將雙蒸餾水200ml煮沸，加入1g堿性品紅，再煮沸2分鐘。冷卻至50加1mol/L的鹽酸20ml，待溫度降低至25時(shí)，加入偏重亞硫酸鈉（鉀）1g1.5g,溫室2小時(shí)后堿稍帶紅色，5小時(shí)后為無色液體，如有顏色應(yīng)加入活性炭1g1.5g,用雙層濾紙過濾,盛于棕色磨口瓶?jī)?nèi),放入4冰箱保存。2、染色步驟：（1）切片脫蠟

40、至水；（2）蒸餾水洗；（3）0.5%過碘酸氧化液1020分鐘；(4)充分蒸餾水洗；（5）進(jìn)入Schiff液染色10分鐘（如室溫低于15可稍加溫）；（6）自來水洗10分鐘；（7）用Mayer或 Harris明礬蘇木素染細(xì)胞核35分鐘；（8）鹽酸酒精(jijng)分化；（9）水洗；（10）無水酒精脫水；（11）二甲苯透明；（12）中性樹膠封固。3、染色結(jié)果：糖原及其它PAS反應(yīng)陽性(yngxng)物質(zhì)染成紅色(hngs)，細(xì)胞核染成藍(lán)色。4、糖原染色的應(yīng)用 （1）用于顯示糖原，對(duì)明確細(xì)胞空泡的性質(zhì)、糖原貯積病和糖尿病的診斷及某些透明細(xì)胞腫瘤的鑒別診斷方面具有重要作用。 （2）用于中性黏液物質(zhì)，對(duì)低

41、分化腺癌的診斷也有一定價(jià)值。 （3）清楚地顯示基底膜（腎炎的診斷）、網(wǎng)狀纖維、真菌菌絲、寄生蟲及腺泡狀軟組織肉瘤中胞質(zhì)內(nèi)結(jié)晶體。 （4）觀察缺血缺氧早期心肌壞死或梗死區(qū)的糖原減少情況。 粘液染色二、奧辛藍(lán)染色法（簡(jiǎn)稱AB染色）：P991、染液配制：（1）AB液：（pH 2.5) 奧辛藍(lán)8GS 1g，蒸餾水97ml，冰醋酸3ml，麝香草酚2粒（防腐）。（先配好3%冰醋酸，然后溶解奧辛藍(lán)。過濾后使用。pH值2.53.0之間.(2)0.5%中性紅水溶液: 中性紅 0.5g,蒸餾水加至 100ml。2、奧辛藍(lán)染色步驟： (1）石蠟切片脫蠟至水；(2)AB液染色2030分鐘；（3）快速蒸餾水洗；（4）0

42、.5%中性紅染12分鐘；（5）快速只能流水洗；（6）95%酒精、無水酒精脫水；（7）二甲苯透明；（8）中性樹膠封固。3、染色結(jié)果：酸性粘液物質(zhì)（及真菌菌絲、隱球菌的夾膜）呈藍(lán)色，中性粘液呈紅色，混合粘液呈紫紅色，細(xì)胞核呈紅色。4、粘液染色的應(yīng)用（1）黏液性腫瘤的診斷和鑒別診斷，如黏液瘤、黏液肉瘤、脂肪瘤、胃腸道低分化腺癌、軟骨黏液樣纖維瘤；（2）用于結(jié)締組織疾病及慢性胃炎腸上皮化生等的診斷。 第五節(jié) 病原微生物染色 P100石炭酸品紅抗酸桿菌染色法：P1011、染色(rns)配制： 石炭酸品紅(pnhng)液：堿性品紅 1g， 無水酒精(jijng) 10ml， 石炭酸（5%）水溶液100ml

43、。 （首先將堿性品紅溶于無水酒精，然后與石炭酸水溶液混合，臨使用前過濾）。2、抗酸桿菌染色步驟：（1）石蠟切片脫蠟至水；（2）將石炭酸品紅液滴切片上，文火熱至蒸氣出現(xiàn)，離火染1520分鐘；（3）蒸餾水洗；（4）1%鹽酸酒精液分化，至無紅色染料流下止；（5）蒸餾水洗；（6）1%美藍(lán)液復(fù)染2分鐘；（7）95%酒精分化，美藍(lán)脫色，以示清楚；（8）無水酒精脫水；（9）二甲苯透明；（10）中性樹膠封固。3、染色結(jié)果：抗酸桿菌(如結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌等）呈紅色，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色。4、病原微生物染色的應(yīng)用用于結(jié)核病的干酪樣壞死灶及麻風(fēng)病中泡沫狀細(xì)胞（瘤型麻風(fēng)）內(nèi)的抗酸桿菌，其形態(tài)特點(diǎn)是：結(jié)核分支桿菌彎曲細(xì)長(zhǎng)，長(zhǎng)

44、短粗細(xì)不一；而麻風(fēng)桿菌短粗成堆，數(shù)量較多（稱為麻風(fēng)團(tuán)）。淀粉樣物質(zhì)的染色（書上無）Bennhola剛果紅染色法：1、染色配制：（1）1%剛果紅水溶液： 剛果紅 1g， 蒸餾水100ml。（2）碳酸鋰飽和水溶液：碳酸鋰 1.25g， 蒸餾水100ml。2、染色結(jié)果： 淀粉樣物質(zhì)呈紅色，其它組織呈淺紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。3、Bennhola剛果紅染色步驟：（1）石蠟切片脫蠟至水；（2）明礬蘇木素染液淡染細(xì)胞核35分鐘；（3）1%鹽酸酒精液稍分化。水洗12分鐘；（4）充分水洗返藍(lán)；（5）蒸餾水稍洗；（6）1%剛果紅溶液染色1030分鐘或更長(zhǎng)；（7）經(jīng)碳酸鋰飽和溶液處理12分鐘；（8）80%酒精液急速分

45、化至無紅色染液流下為止；（9）水洗12分鐘；（10）95%酒精脫水及無水酒精脫水；（11）二甲苯透明；（12）中性樹膠封固。4、淀粉樣物質(zhì)的染色的應(yīng)用（1）淀粉樣物質(zhì)染色能顯示變性程度:如全身淀粉樣變性；（2）用于全身(qun shn)消耗性疾病的觀察:如結(jié)核病、甲狀腺髓樣癌等；（3）用于腫瘤的診斷和鑒別診斷:如內(nèi)分泌腫瘤的間質(zhì)常出現(xiàn)淀粉樣物質(zhì)沉著，又如甲狀腺髓樣癌、胰島細(xì)胞瘤、肺小細(xì)胞癌等，淀粉樣物質(zhì)染色陽性(yngxng)可作為診斷重要依據(jù)；（4）為某些疾病(jbng)的診斷與鑒別診斷提供依據(jù):鈣化上皮瘤、聲帶息肉等常出現(xiàn)淀粉樣變性，可為診斷依據(jù)。黑色素染色Masson-Fontana染色法：1、染液配制：（1）Masson-Fontana染：10%硝酸銀 15ml， 蒸餾水 15ml。（將濃氨水逐滴加入10%硝酸銀液中直至微乳白色，并加入蒸餾水15ml，過濾后靜