醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白

1、醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白目的和要求掌握醋酸纖維薄膜電泳的原理及操作方法原理帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向著反向電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳，其移動(dòng)方向及速度取決于本身所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量、電場(chǎng)強(qiáng)度以及溶液pH等因素。蛋白質(zhì)分子在溶液中的電泳是因其分子具有一些游離的可解離基團(tuán)如-COOH、-NH2、-OH等，因而在某種pH值溶液中蛋白質(zhì)分子帶有一定的電荷?；旌系鞍讟悠分杏捎诟鞯鞍踪|(zhì)的等電點(diǎn)不同，在同一pH溶液中所帶的電荷性質(zhì)及電荷數(shù)目不同，因此在電場(chǎng)中各種蛋白質(zhì)泳動(dòng)的方向和速度也不同，從而使蛋白質(zhì)混合樣品得以分離。血清中含有白蛋白、-球蛋白、-球蛋白和-球蛋白等，其氨基酸組分、立體構(gòu)象、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)

2、及形狀等均有所不同。由下表可見(jiàn)，血清中5種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大多低于pH7.0，在pH8.6的緩沖液中都電離成負(fù)離子(羧基解離)，故在電場(chǎng)中均向陽(yáng)極移動(dòng)。蛋白質(zhì)種類等電點(diǎn)(pI)相對(duì)分子量(Mr)清/白蛋白1-球蛋白2-球蛋白-球蛋白-球蛋白4.885.065.065.126.857.5069 000200 000300 00090 000150 000156 000300 000在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的含量與結(jié)合的染料量成正比，故可將各蛋白質(zhì)區(qū)帶剪下，分別用0.4 mol/L NaOH溶液浸洗下來(lái)，通過(guò)比色法或?qū)⑷旧蟮谋∧ぶ苯佑霉饷芏扔?jì)掃描，以測(cè)定特定電泳區(qū)帶的蛋白質(zhì)相對(duì)含量。本實(shí)驗(yàn)采用的醋酸纖

3、維薄膜電泳法是以醋酸纖維薄膜為支持物。醋酸纖維素是將纖維素的羥基乙?；笮纬傻睦w維醋酸酯，將其溶于有機(jī)溶劑(如丙酮、氯仿、乙酸乙酯等)后于聚乙烯材料上涂成均勻的薄膜，待溶劑蒸發(fā)后即可。該膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，有強(qiáng)滲透性、其厚度約為120 m。醋酸纖維薄膜電泳具有微量、快速、簡(jiǎn)便、分辨力高、對(duì)樣品無(wú)拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于血清蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、脂蛋白、結(jié)合球蛋白和同工酶的分離及測(cè)定。操作步驟 準(zhǔn)備醋酸纖維薄膜的潤(rùn)濕和選擇：將薄膜裁成82cm狀，使其漂在緩沖液液面上(若迅速濕潤(rùn)，整條薄膜一致而無(wú)白點(diǎn)，則表明薄膜質(zhì)地均勻，可用于電泳實(shí)驗(yàn))，然后用竹夾/鑷子輕輕地將薄膜完全浸入緩

4、沖液中，待薄膜完全浸透后使用(約0.5h)。制作電橋：將電泳緩沖液倒入電泳槽兩邊并用虹吸管平衡兩邊液面。根據(jù)電泳槽的縱向尺寸，剪裁尺寸合適的濾紙條。取四層附著在電泳槽的支架上，使其一端與支架的前沿對(duì)齊，另一端則浸入電極槽的緩沖液內(nèi)。然后用緩沖液將濾紙全部潤(rùn)濕并驅(qū)除氣泡，使濾紙緊貼在支架上，即為“濾紙橋”。按照同樣的方法，在另一個(gè)電極槽的支架上制作相同的“濾紙橋”。它們的作用是聯(lián)系醋酸纖維薄膜和兩極緩沖液之間的中間“橋梁”。 點(diǎn)樣取出浸透的薄膜，夾在兩層濾紙之間吸去多余的緩沖液，然后平鋪在玻璃板上(無(wú)光澤面朝上)，用點(diǎn)樣器蘸取適量血清(約23 l)，再“印”在薄膜的點(diǎn)樣區(qū)(距薄膜一端1.5 cm

5、處)。血清應(yīng)均勻分布，形成具有一定寬度、粗細(xì)勻稱的直線。點(diǎn)樣切忌過(guò)量，可事先在濾紙上練習(xí)以掌握點(diǎn)樣技術(shù)，這是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)之一。 電泳將點(diǎn)好樣的薄膜(無(wú)光澤面朝下)兩端緊貼在支架的濾紙橋上(加血清端靠負(fù)極)，中部保持懸空平直。先平衡10 min，仔細(xì)檢查電泳裝置的線路是否正確，然后通電。打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電流為0.40.6 mA (薄膜每厘米寬)，電壓為每厘米長(zhǎng)1012V。在電泳過(guò)程中，應(yīng)注意控制電壓和電流強(qiáng)度，防止過(guò)高偏低。待電泳區(qū)帶展開(kāi)約35 cm時(shí)，關(guān)閉電源，一般通電時(shí)間為60 min左右。 染色電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色510 mi

6、n。然后用漂洗液漂洗至背景無(wú)色(約35次)。再浸于蒸餾水中或用濾紙吸干。 結(jié)果判斷一般經(jīng)染色漂洗后，薄膜上可呈現(xiàn)5條區(qū)帶，由正極端起，依次為清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白。 試劑和器材試劑1. 新鮮血清(制備時(shí)要無(wú)溶血現(xiàn)象)2. 巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6，0.075mol/L，離子強(qiáng)度0.06)：稱取巴比妥1.66g和巴比妥鈉12.76g，溶于少量蒸餾水后定容至1,000mL。3. 染色液：稱取氨基黑10B 0.5g，加入蒸餾水40 mL，甲醇50 mL和冰醋酸10 mL，混勻，貯存于試劑瓶中。4. 漂洗液：取95%乙醇45 mL，冰醋酸5 mL和蒸餾水50 mL，混勻。器材醋酸纖維薄膜：市售的電泳用醋酸纖維薄膜培養(yǎng)皿(直徑910 cm)