生物技術(shù)制藥課件

1、 生物(shngw)技術(shù)制藥學(xué) 梁 涌 濤共二百三十四頁3 第一章 緒 論第一節(jié) 簡介一、前言 1、自我介紹： 2、課程要求(yoqi)： 3、參考書： 4、學(xué)時分配：二、專業(yè)介紹 1、吉林大學(xué)： 2、專業(yè)去向： 3、生物技術(shù)藥物行業(yè)狀況(學(xué)術(shù)外)：共二百三十四頁第二節(jié) 概論一、藥 1、藥物(yow) 2、藥品 3、生物制品二、生物技術(shù) 1、生物技術(shù) 2、生物技術(shù)發(fā)展的三階段 1 傳統(tǒng)階段 2 近代階段 3 現(xiàn)代階段共二百三十四頁3、生物技術(shù)在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用及成果4、基因工程制藥工業(yè)迅速發(fā)展的原因(yunyn)5、生物技術(shù)的新進(jìn)展 1 基礎(chǔ)研究深入 2 新產(chǎn)品出現(xiàn) 3 新試劑 4 新生物反應(yīng)

2、器 5 改造傳統(tǒng)工業(yè)共二百三十四頁三、生物藥物 1、生物藥物 2、分類(fn li) 3、按用途分類四、生物技術(shù)藥物 1、生物技術(shù)藥物 2、分類 3、主要品種類型共二百三十四頁4、生物技術(shù)藥物特性5、生物技術(shù)制藥特征6、生物技術(shù)制藥現(xiàn)狀 1 國外生物技術(shù)制藥現(xiàn)狀 2 我國生物技術(shù)制藥現(xiàn)狀7、我國生物技術(shù)藥物展望 1 自主知識產(chǎn)權(quán)藥物 2 藥物類別發(fā)展趨勢 3 從治療(zhlio)疾病方面看趨勢共二百三十四頁 第二章 生物(shngw)制藥（生物(shngw)藥物）共二百三十四頁 第一節(jié) 生物藥物概述 生物技術(shù)制藥： 上游技術(shù)：生物技術(shù) 下游技術(shù)：分離純化技術(shù)(生物制藥) 關(guān)于(guny)生物藥

3、物 藥品： 化學(xué)藥 中藥、天然藥物 生物制品（生物藥物 抗 生素除外） 共二百三十四頁一、生物藥物的歷史與現(xiàn)狀古老的藥物： 古代有史料記載 神農(nóng) 公元四世紀(jì)(shj)海藻泡酒 甲狀腺腫大 羊肝 維生素A缺乏癥 胎盤 強(qiáng)壯劑 羚羊角 中風(fēng) 雞內(nèi)金 消食健胃 秋石 類固醇激素年輕的新型藥物 第一代生物藥物 第二代生物藥物 第三代生物藥物共二百三十四頁二、生物藥物的性質(zhì)與分類1、性質(zhì)藥理學(xué)性質(zhì)：治療針對性強(qiáng) 活性高 毒副作用小、營養(yǎng)價值 高 生理副作用常有發(fā)生 具有更高的生化機(jī)制 合理性 受體效應(yīng) 多效性和網(wǎng)絡(luò)(wnglu)性效應(yīng)生產(chǎn)制備的性質(zhì)：材料中有效成分低 穩(wěn)定性差 易腐敗 注射 用藥有特殊要

4、求 儲存有特殊要求檢驗(yàn)特殊性：活性 同源性 一致性 安全性 共二百三十四頁2、分類按化學(xué)本質(zhì)和化學(xué)特性：氨基酸 蛋白質(zhì)和多肽 酶與輔酶 核酸及其 降解物和衍生物 多糖 脂類 細(xì)胞生長因子 生物制品按材料來源：人體組織 動物組織 植物組織 微生物 海洋生 物 按生理功能和用途(yngt)：治療 預(yù)防 診斷 其它生物醫(yī)藥用品 共二百三十四頁三、生物藥物的研究發(fā)展趨勢表現(xiàn)為：1、資源綜合利用與擴(kuò)大開發(fā) 臟器 血液(xuy) 人尿 擴(kuò)大開發(fā)資源 2、發(fā)現(xiàn)新生理活性物質(zhì)，重新認(rèn)識評價原有藥物 3、藥物新劑型日益增多 4、生物技術(shù)應(yīng)用于制藥行業(yè)共二百三十四頁第二節(jié) 生物藥物的制備一、生物材料與生物活性物質(zhì)

5、1、生物材料來源 動物臟器 血液 海洋生物 植物 微生物 新生物資源2、生物活性物質(zhì)存在方式 細(xì)胞外 細(xì)胞內(nèi)（游離、結(jié)合膜上、細(xì)胞器內(nèi)）3、生物活性物質(zhì)存在特點(diǎn) 復(fù)雜性 含量低 純化難 穩(wěn)定性差4、生物材料準(zhǔn)備 材料選取原則： 考慮成分含量 （物種、組織器官(qgun)、生長期） 雜質(zhì) 來源 采集與保存：（新鮮、低溫、防污染、腐敗變質(zhì)）共二百三十四頁組織細(xì)胞破碎： 物理(wl)法 化學(xué)法 生物法細(xì)胞器分離： 破碎細(xì)胞后離心二、生物活性物質(zhì)提取 提?。?1、物質(zhì)性質(zhì)與提取 物質(zhì)性質(zhì)與提取方法的選擇 可供選擇的性質(zhì)：溶解性 分子量 等電點(diǎn) 穩(wěn)定性 比重 粒度 粘度等共二百三十四頁 提取原則： 在保

6、持活性的前提下目的物最大溶出，雜質(zhì)最小溶出。 注意事項(xiàng)： 酶類：防止輔酶丟失、失活因素干擾 蛋白質(zhì)類：高級(goj)結(jié)構(gòu)破壞的變性作用 多肽、核酸類：防止酶降解，添加酶抑制劑 脂類：防止氧化，添加抗氧劑活性物質(zhì)的保護(hù)措施： 緩沖系統(tǒng) pH緩沖系統(tǒng) 添加保護(hù)劑 還原劑 金屬螯合劑 抑制水解酶 加EDTA 加熱 酶抑制劑 其它保護(hù)措施 避光、高溫、氧化、激烈攪拌共二百三十四頁2、提取條件(tiojin)選擇 溫度： 不耐熱 010 耐熱較好 2025 需酶解激活 3040 耐熱 5090 酸堿度：pH 4-9 鹽濃度： NaCl (0.1-0.15mol/L) PBS (0.02-0.05mol/

7、L) HAc (0.1-0.15mol/L) 檸檬酸 (0.02-0.05mol/L)共二百三十四頁3、提取方法酸、堿、鹽水溶液提?。?可提供離子強(qiáng)度、pH、緩沖能力表面活性劑提?。?陰離子型 陽離子型 中性 非離子型有機(jī)溶劑提取： 溶劑：甲醇 乙醇 丙酮(bn tn) 丁醇 乙醚 氯仿 苯等 好處：抑菌、抑制(yzh)酶活性、沉淀雜蛋白考慮溶劑去除共二百三十四頁三、生物活性物質(zhì)的濃縮與干燥1、濃縮： 鹽析 有機(jī)溶劑沉淀 葡聚糖凝膠 聚乙二醇反透析 超濾真空減壓 薄膜2、干燥： 減壓 噴霧 冷凍干燥：包括預(yù)凍結(jié) 升華 再干燥 優(yōu)點(diǎn)：四、生物活性物質(zhì)分離純化的基本原理和方法1、根據(jù)分子形狀和大小

8、不同；2、根據(jù)分子電離(dinl)性質(zhì)不同；3、根據(jù)分子極性大小及溶解度不同；共二百三十四頁4、根據(jù)吸附(xf)性質(zhì)不同；5、根據(jù)特異性。分離純化設(shè)計：未知結(jié)構(gòu)組分 1、確定研究目的和分析鑒定方法 2、研究理化性質(zhì)及穩(wěn)定性預(yù)備試驗(yàn) 3、確定材料處理及抽提方法 4、分離純化方法摸索 5、產(chǎn)品均一性測定選擇(xunz)分離純化方法時要考慮幾個問題 1、提取時目的物最大,雜質(zhì)最小溶出 2、分離方法分辨率由低至高共二百三十四頁3、純化方法使用程序 各種方法交叉使用4、分離后要采取保護(hù)措施 分離方法評價 分辨能力 重現(xiàn)性 回收率（5-6步25%以上） 均一性鑒定: 方法：電泳 色譜 化學(xué)組成分析(fnx

9、)五、中試放大設(shè)計中試放大： 需具備的條件：1、收率穩(wěn)定，質(zhì)量可靠2、操作條件確定，產(chǎn)品、中間體及原料分析方法已經(jīng)確定3、生物材料資源已確定共二百三十四頁4、環(huán)境保護(hù)問題已經(jīng)解決5、中試規(guī)模、材料規(guī)格、數(shù)量已經(jīng)確定6、提出安全生產(chǎn)要求研究內(nèi)容(nirng)： 確定工藝路線與各步反應(yīng)方法 設(shè)備材質(zhì)與型號 反應(yīng)器規(guī)模及攪拌器類型 生產(chǎn)反應(yīng)條件 工藝流程與操作方法 安全生產(chǎn)與環(huán)保 原輔材料中間體理化性質(zhì)、化學(xué)常數(shù)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 成本核算 共二百三十四頁第三節(jié) 生物(shngw)藥劑劑型的發(fā)展一、緩釋型生物泵儲存(chcn)相滲透壓誘發(fā)物質(zhì)半透膜共二百三十四頁二、脂質(zhì)體優(yōu)點(diǎn) 1、促進(jìn)藥物運(yùn)輸 2、改善藥物

10、膜的選擇性，與特殊組織相互作用 3、控制藥物釋放 4、保護(hù)藥物 5、增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)脂質(zhì)體制法：三、靶向性制劑 通過藥物釋放速度或釋放部位的控制，使藥效持續(xù)化，毒性(d xn)最小。 有特異性靶向性療法 有同胰島素那樣根據(jù)如血糖濃度值的變化釋放藥物的制劑共二百三十四頁第四節(jié) 滅菌(mi jn)一、干熱空氣滅菌160-170 1小時或140 3小時 芽孢桿菌二、濕熱滅菌1、常壓 100 30-60min 不能殺芽孢2、熱壓滅菌 超過一個大氣壓 可殺芽孢115.5 1.7kg/ 平方厘米 30min121.5 2.0kg/平方厘米 20min126.5 2.4kg/平方厘米 15min共二百三十四

11、頁3、低溫間歇滅菌 80 滅菌1小時(xiosh) 20-25 放24小時(xiosh) 再80 加熱1小時 如此3次三、紫外線滅菌 1.5m以內(nèi) 6-15立方米一個紫外燈四、過濾除菌 膜孔徑0.2m五、化學(xué)滅菌 甲醛共二百三十四頁第五節(jié) 生物制品一、概念二、分類 根據(jù)(gnj)材料、制法 1、菌苗 2、噬菌體 3、疫苗 4、抗血清與抗毒素 5、類毒素 6、混合制劑 7、血液制品8、診斷用品 9、其他 根據(jù)用途 預(yù)防 治療 診斷三、生物制品質(zhì)量要求 安全和效力共二百三十四頁 安全性 1、毒性試驗(yàn) 2、防腐劑 3、熱原質(zhì) 4、安全試驗(yàn) 效力(xio l) 1、濃度 （含菌數(shù)、抗原量測定）2、活菌

12、率 或病毒含量 3、免疫抗體含量 4、穩(wěn)定性試驗(yàn) 熱原質(zhì)： 人工免疫： 自動免疫： 被動免疫：共二百三十四頁 第三章 基因工程制藥 第一節(jié) 概述(i sh)現(xiàn)代生物技術(shù)： 基因工程 細(xì)胞工程 發(fā)酵工程 酶工程 抗體工程等基因工程制藥(含義)：一、基因工程制藥發(fā)展概況1、基因工程制藥發(fā)展簡史2、基因工程制藥發(fā)展現(xiàn)狀 自1976年世界第一個DNA重組技術(shù)公司在美國成立，從1982年第一個人胰島素上市，現(xiàn)有400多生物技術(shù)藥物進(jìn)入市場或臨床試驗(yàn)。 發(fā)展比較快的有：美、英、德、日、法，法國肥胖研究領(lǐng)先，印度糖尿病研究領(lǐng)先。共二百三十四頁生物技術(shù)制藥產(chǎn)業(yè)與其它產(chǎn)業(yè)相比發(fā)展速度飛快，目前以25%的速度增長

13、。 上市的品種有： 年銷售額10億美元以上的有：EPO（47）、人生長激素（30）、集落刺激生長因子（12）、人胰島素（15）、干擾素（14） 研制階段的有：3、我國基因工程藥物的狀 起步晚但發(fā)展比較快，從銷售額來看：98年7億、99年12億、00年22億、05年50多億。 上市的藥物有20多種，其中1b干擾素、鏈激酶、表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子為一類新藥。世界范圍銷售額前十位的基因工程藥品我國已經(jīng)能生產(chǎn)(shngchn)8種。現(xiàn)在有40多種處于研究階段。我國生產(chǎn)的主要品種：共二百三十四頁人干擾素（1b、2a、2b、）白介素2、鏈激酶、胰島素、人生長素、乙肝疫苗、痢疾疫苗、表皮生長因

14、子（內(nèi)、外用）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（外用）、EPO、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激生長因子二、傳統(tǒng)生物制藥存在(cnzi)的問題： 1、無法大批量生產(chǎn) 2、造價高 3、供不應(yīng)求 4、抗原性 5、受病毒污染 共二百三十四頁三、基因工程制藥的特點(diǎn)： 1、大量生產(chǎn)藥用生理活性蛋白和多肽供臨床使用 2、提供多的生理活性物質(zhì)用于研究，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍 3、發(fā)掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì) 4、改造作為藥物的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)存在的不足 5、獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源 基因工程技術(shù)產(chǎn)品預(yù)防用的各種( zhn)疫苗、治療用藥物、診斷試劑主要是蛋白質(zhì)和多肽，以及核酸類藥物，有： 1、免疫性蛋白：抗原、單抗

15、。5、反義、基因治療藥物 2、細(xì)胞因子： 3、激素： 4、酶類：共二百三十四頁未來十幾年生物制藥發(fā)展(fzhn)的主要領(lǐng)域： 腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、器官移植、心血管、基因病等共二百三十四頁 原核細(xì)胞 真核細(xì)胞 DNA分離(fnl)純化 載體DNA 染色體DNA 限切酶 第二節(jié) 基因工程藥物(yow)生產(chǎn)的基本過程基因工程技術(shù)： （含義）基本過程：共二百三十四頁 退火、連接 轉(zhuǎn)化(zhunhu) 培養(yǎng) 重組轉(zhuǎn)化體共二百三十四頁基因工程藥物生產(chǎn)的一般(ybn)程序：獲得目的基因(jyn)、克隆獲得目的基因、克隆組建重組質(zhì)粒構(gòu)建工程菌或細(xì)胞培養(yǎng)工程菌產(chǎn)物分離純化除菌過濾半成品檢定成品檢定

16、包裝共二百三十四頁 第三節(jié) 目的基因的獲得一、直接分離法：（特殊基因） 非洲爪蛙rDNA和5sDNA基因，dA+dT含量與其它基因有顯著差異且較多重復(fù)序列，汞離子能與dA、dT特異性結(jié)合，可增大其密度，用離心法分離。 真核基因不能用以上方法，因?yàn)椋憾?、反轉(zhuǎn)錄法： 過程(guchng)：先分離純化目的基因的mRNA 反轉(zhuǎn)錄酶 DNA DNA聚合酶 反轉(zhuǎn)錄酶 共二百三十四頁 DNA聚合酶 cDNA cDNA S核酸酶1、mRNA的純化： 真核細(xì)胞(xbo)mRNA 3端有一多聚腺苷酸-polyA，用親和層析法（親和層析柱上有polyT）將mRNA從細(xì)胞(xbo)中分離出來。2、cDNA的第一鏈合成

17、： mRNA polyA 反轉(zhuǎn)錄酶 mRNA polyA DNA polyT 共二百三十四頁3、cDNA第二鏈合成： 用堿解或RNaseH酶解法除去cDNA-mRNA中的mRNA，再以 cDNA為摸板合成第二鏈，再用核酸酶S酶切除單鏈DNA。4、cDNA克?。?克隆載體有：質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA 載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞5、cDNA鑒定： 根據(jù)表型進(jìn)行篩選如抗性基因失活法、菌落顏色變化等6、目的(md)cDNA克隆的分離和鑒定： 分離方法：核酸探針雜交法： 根據(jù)目的基因蛋白質(zhì)純品aa序列分析，人工合成單鏈寡核苷酸 作為探針，從cDNA文庫中分離特異cDNA克隆。共二百三十四頁 免疫反應(yīng)鑒定法：

18、 用某種蛋白質(zhì)的抗體與文庫cDNA表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生免疫反應(yīng), 尋 找相應(yīng)的特異 cDNA克隆。三、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法四、化學(xué)合成法： 小的蛋白質(zhì)或多肽(du ti)的編碼基因可以用人工合成， 有要求：五、構(gòu)建基因文庫法：（常用于原核生物基因） 基因文庫： 步驟： 1、 2、 3、 六、新基因共二百三十四頁 第四節(jié) 目的基因載體(zit) 載體： 條件： 種類：一、質(zhì)粒 1、含義： 2、分類： 根據(jù)能否在細(xì)胞間傳遞分： 根據(jù)在細(xì)胞中拷貝數(shù)不同分：3、制備 離心收獲細(xì)菌，裂解細(xì)菌 裂解方法與質(zhì)粒有關(guān)：共二百三十四頁二、噬菌體 噬菌體: 溶源生長： 溶菌生長： DNA作為載體(zit)特點(diǎn)：三、科斯

19、質(zhì)粒 科斯質(zhì)粒： 特點(diǎn)：四、M13噬菌體共二百三十四頁 第五節(jié) 目的基因與載體的重組 體外重組：一、連接酶作用機(jī)制 DNA連接酶: 大腸桿菌(d chn n jn)DNA連接酶：二磷酸吡啶核苷酸為輔助因子 T4噬菌體DNA連接酶：ATP為輔助因子（多用） T4噬菌體DNA連接酶作用機(jī)制：二、連接反應(yīng)作用方式 1、粘性末端連接共二百三十四頁 ECoR切割(qig)的目的基因 G CTTAA5 AATTC G ECoR G CTTAAG CTTAAAATTC GAATTC G 連接酶 G CTTAAAATTC G 連接酶 共二百三十四頁 ECoR DNA 重組體 EcoR2、鈍端連接(linji)

20、1）加同聚尾連接 末端脫氧核 苷酸轉(zhuǎn)移酶 AAAA dATP AAAA共二百三十四頁 TTTT TTTT DNA連接酶 2）加人工(rngng)接頭連接 GAATTC CTTAAG T4連接酶 GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAAG共二百三十四頁 ECoR AATTC G G CTTAA三、連接時注意事項(xiàng)1、連接溫度： 37最適合，但粘性末端氫鍵不穩(wěn)定 12-15 過夜； 7-8 2-3天； 4 1周2、防止載體自身環(huán)化 1）載體與外源DNA的濃度和比例 載體：外源DNA=1：3 2）用堿性磷酸酶處理(chl)載體 可水解5-磷酸共二百三十四頁 3）定向克?。?第六節(jié) 目的基因

21、的轉(zhuǎn)化與感染常用宿主微生物有： 大腸桿菌 枯草桿菌 酵母菌應(yīng)具備(jbi)一定性能： 1）能夠接受外源DNA 2）具有缺陷型 3）不適合在非培養(yǎng)條件下生存一、轉(zhuǎn)化作用 轉(zhuǎn)化： 轉(zhuǎn)化機(jī)制：共二百三十四頁二、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(zuyng) 轉(zhuǎn)導(dǎo)： 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)： 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)： 限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)：三、脂質(zhì)體介導(dǎo)的融合作用 含義：共二百三十四頁第七節(jié) 目的基因重組克隆的鑒定與分析一、重組DNA的鑒定1、根據(jù)重組體表型進(jìn)行篩選鑒定：（1）抗性基因失活法：（2）半乳糖苷酶基因插入失活法：2、重組體結(jié)構(gòu)分析法：3、原位雜交法：（1）技術(shù)(jsh)含義：（2）過程：共二百三十四頁 含轉(zhuǎn)化體平板 硝酸纖維素膜 溶菌 堿變性(b

22、inxng) 酸中和 洗滌 雜交 洗滌 干燥 結(jié)合DNA膜 陽性菌落斑點(diǎn) 放射自顯影 挑出陽性菌落 共二百三十四頁4、免疫分析法：（1）含義： 有放射性抗體(kngt)和免疫沉淀測定法（2）放射性抗體測定法過程： 轉(zhuǎn)化混合物培養(yǎng) 制備影印板 氯仿蒸氣 結(jié)合抗體膜 第二抗體 放射自顯影 干燥 洗滌 共二百三十四頁二、重組DNA的分析：1、重組質(zhì)粒分離及再轉(zhuǎn)化：2、限制酶分析：（1）雙酶消化法： 含義： 用于構(gòu)建物理圖譜 例：由載體PBR322與海象染色體DNA片段構(gòu)成(guchng)PWAL1重組質(zhì)粒，已知海象染色體DNA片段與載體PBR322各自只有一個Sal、EcoR酶切位點(diǎn)，故采用Sal和

23、EcoR雙酶消化分析PWAL1重組質(zhì)粒，同時用載體PBR322雙酶消化分析對照，構(gòu)建物理圖譜。共二百三十四頁P(yáng)BR322載體： 酶 片段(pin dun) EcoR或 Sal 2.7EcoR+ Sal 2.3 0.4PWAL1重組質(zhì)粒： 酶 片段 EcoR 4.1 2.7 Sal 4.2 2.6EcoR+ Sal 2.3 2.2 1.9 0.4共二百三十四頁P(yáng)BR322載體(zit)： EcoR 酶切PWAL1重組質(zhì)粒： EcoR EcoR Sal 2.3 + 0.4 EcoRSal 酶切PWAL1重組質(zhì)粒： 4.1 + 2.7 Sal Sal 4.2+2.6 共二百三十四頁Sal+EcoR

24、酶切PWAL1重組質(zhì)粒： EcoR Sal Sal EcoR 2.3 2.2 1.9 0.4（2）部分(b fen)消化法： 含義：共二百三十四頁 0 2 5 10 15 20 6.5(Kb) 5.0 3.5 3.0 2.0 1.5 3.0 2.0 1.5 6.5 共二百三十四頁(3)印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)(jsh)： 限切酶 凝膠電泳 硝酸纖維素膜 凝膠 32 P-cDNA或 硝酸纖維素膜 32P-mRNA 硝酸纖維素膜 共二百三十四頁（4）再克隆技術(shù)：（5）轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)： 小細(xì)胞系統(tǒng)： 大細(xì)胞系統(tǒng)： 無細(xì)胞系統(tǒng)：第八節(jié) 基因表達(dá)(biod) 基因表達(dá)：基因表達(dá)的主要研究內(nèi)容： 基因表達(dá)的產(chǎn)量， 基

25、因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性， 基因表達(dá)產(chǎn)物的活性，基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化共二百三十四頁一、宿主細(xì)胞的選擇：標(biāo)準(zhǔn)：分類：原核細(xì)胞：大腸桿菌(d chn n jn)、枯草桿菌、鏈霉菌等真核細(xì)胞：酵母、絲狀真菌、哺乳動物細(xì)胞等1、原核細(xì)胞：（1）大腸桿菌 優(yōu)點(diǎn)：研究深入；生長迅速 表達(dá)形式： 細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)；細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)；細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)；細(xì) 胞外表達(dá)。共二百三十四頁特點(diǎn)：（2）枯草桿菌：特點(diǎn)：其表達(dá)(biod)分泌能力強(qiáng)，表達(dá)(biod)蛋白分泌到培養(yǎng)液中（3）鏈霉菌：特點(diǎn)：2、真核細(xì)胞（1）酵母特點(diǎn)：基因組小；世代時間短；有單倍體和雙倍體；可以大規(guī)模培養(yǎng)；無毒性。共二百三十四頁（2）絲狀真菌特點(diǎn)：表達(dá)

26、分泌能力強(qiáng)；可翻譯后加工；安全無毒（3）哺乳動物細(xì)胞特點(diǎn)：產(chǎn)物易分離純化(chn hu)；產(chǎn)物糖基化，類似天然產(chǎn)物；缺點(diǎn)：生產(chǎn)慢；產(chǎn)率低；條件苛刻；費(fèi)用高二、基因表達(dá)基因表達(dá)有三種：1、大腸桿菌表達(dá)真核基因：啟動子：阻遏子：終止子：SD序列：共二百三十四頁基因表達(dá)分三步： 獲得真核目的基因 真核目的基因與載體重組 導(dǎo)入宿主細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)（1）載體應(yīng)具備：要有強(qiáng)啟動子、阻遏子、強(qiáng)終止子、產(chǎn)生的mRNA要有起始密碼子AUG和SD序列（2）影響基因表達(dá)的因素(yn s)外源基因的拷貝數(shù)：外源基因的表達(dá)效率： 影響基因表達(dá)效率的因素：表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：共二百三十四頁細(xì)胞的代謝負(fù)荷：工程菌的培養(yǎng)條件：（

27、3）真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式以融合蛋白的形式表達(dá)： 原核多肽-真核蛋白 優(yōu)點(diǎn) ：以非融合蛋白的形式表達(dá)： 優(yōu)點(diǎn)：分泌型表達(dá)蛋白質(zhì)： 特點(diǎn)(tdin)：2、酵母中的基因表達(dá)3、動物細(xì)胞中的基因表達(dá)共二百三十四頁第九節(jié) 基因工程(jyn gngchng)菌的穩(wěn)定性基因工程菌的不穩(wěn)定性 載體質(zhì)粒的不穩(wěn)定性質(zhì)粒的不穩(wěn)定性：分裂不穩(wěn)定性（常見）：結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：質(zhì)粒的不穩(wěn)定性的危害：質(zhì)粒發(fā)生變化的工程菌具有生長優(yōu)勢，培養(yǎng)時逐漸取代含有正常質(zhì)粒的工程菌，影響基因表達(dá)。一、影響質(zhì)粒穩(wěn)定性的因素（分裂不穩(wěn)定性）1、含有質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率 頻率越高越不穩(wěn)定共二百三十四頁2、含有質(zhì)粒和不含質(zhì)粒

28、的菌生長速率差異大小 不含質(zhì)粒的菌生長越快越不穩(wěn)定二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1、兩階段培養(yǎng)法：2、培養(yǎng)中加入選擇性因素：3、還有控制培養(yǎng)條件改變含質(zhì)粒和不含質(zhì)粒菌的生長速率差異第十節(jié) 工程菌生長代謝特點(diǎn) 以大腸桿菌為例，蛋白質(zhì)/菌體量比值基本恒定，菌體生長速度反映(fnyng)蛋白質(zhì)合成速度。共二百三十四頁一、菌體生長與能量的關(guān)系呼吸提供的能量決定了菌體的生長速率。供能副產(chǎn)物乙酸抑制菌體生長。二、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系前體供應(yīng)充足保證菌體生長速率提高。第十一節(jié) 基因工程菌的發(fā)酵基因工程菌的培養(yǎng)(piyng)：（1）搖床培養(yǎng)（2）培養(yǎng)罐發(fā)酵一、培養(yǎng)方式：1、補(bǔ)料分批培養(yǎng)：共二百三十四頁2、連續(xù)培

29、養(yǎng)：3、透析培養(yǎng)：4、固定化培養(yǎng)(piyng)：二、工程菌的發(fā)酵工藝與傳統(tǒng)微生物發(fā)酵工藝不同：（1）（2）（3）就培養(yǎng)過程來看影響基因表達(dá)的因素：1、培養(yǎng)基的影響（在基因水平對菌體生長、外基因表達(dá)進(jìn)行控（1） 制和誘導(dǎo)如啟動子的阻遏和誘導(dǎo)） （2）共二百三十四頁（3）培養(yǎng)基成分碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖(gutng)等氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水、 硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等無機(jī)鹽：微量元素：維生素：生物素：特殊營養(yǎng)物：2、接種量的影響（影響表達(dá)產(chǎn)量和周期） 種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例共二百三十四頁接種量小 不利于基因表達(dá)接種量大 菌生長過快，代謝產(chǎn)物積累抑

30、制菌生長3、溫度影響（表現(xiàn)在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及物質(zhì)合成(hchng)） 通過酶影響的4、溶解氧的影響（影響菌體生長和產(chǎn)物合成）5、誘導(dǎo)時機(jī)6、pH影響三、培養(yǎng)設(shè)備主要組成發(fā)酵罐體、攪拌器、溫度控制系統(tǒng)、滅菌系統(tǒng)、空氣過濾系統(tǒng)、殘留氣體處理系統(tǒng)、參數(shù)測量與控制系統(tǒng)、培養(yǎng)液配制及連續(xù)操作裝置共二百三十四頁第十二節(jié) 基因工程產(chǎn)物的分離(fnl)純化與產(chǎn)物的來源和特點(diǎn)有關(guān)基因工程產(chǎn)物多是活性肽和蛋白質(zhì)，特點(diǎn)：（1）含量低（2）組成復(fù)雜（3）穩(wěn)定性差（4）種類多（5）應(yīng)用特殊要求一、分離純化的基本過程 發(fā)酵液 共二百三十四頁 細(xì)胞分離 胞內(nèi)產(chǎn)物(chnw) 胞外產(chǎn)物(chnw) 細(xì)胞破碎 固液分離 包含

31、體 細(xì)胞碎片分離 變性共二百三十四頁復(fù)性 濃縮 初步(chb)分離 純化 制劑 產(chǎn)品共二百三十四頁二、分離純化技術(shù)基因工程藥物來自于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，產(chǎn)品純度要求高分離純化技術(shù)要求：1、溫和2、選擇性好3、收率高4、步驟要少5、快第十四節(jié) 包含(bohn)體的復(fù)性包含體:一、包含體的形成原因1、共二百三十四頁2、3、 包含體的優(yōu)點(diǎn)二、包含體的分離和溶解1、包含體的分離2、包含體的溶解三、包含體蛋白復(fù)性方法(fngf)包含體的復(fù)性：好的包含體蛋白復(fù)性方法具備：包含體蛋白復(fù)性方法：1、2、3、4、5、6、7、共二百三十四頁第十四節(jié) 基因工程藥物(yow)的質(zhì)量控制與傳統(tǒng)生物制藥相比，質(zhì)量控制更為嚴(yán)格（1）

32、藥物是工程菌表達(dá)的大分子、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)（2）藥物是激素類樣的物質(zhì)，極微量就可以產(chǎn)生顯著效果共二百三十四頁（3）人工構(gòu)建的外源基因在表達(dá)過程中易發(fā)生變化基因工程藥物質(zhì)量控制環(huán)節(jié)一、原材料外源DNA序列準(zhǔn)確；宿主細(xì)胞為單一克??；質(zhì)粒純且穩(wěn)定二、培養(yǎng)過程菌種儲存中；培養(yǎng)過程中；重復(fù)(chngf)生產(chǎn)中三、純化過程藥物一致性；雜質(zhì)在限量以下四、產(chǎn)品1、產(chǎn)品鑒別（1）肽圖分析（2）氨基酸成分分析共二百三十四頁（3）部分氨基酸分析（4）相對(xingdu)分子量測定（5）二硫鍵分析2、純度分析3、生物活性測定4、化學(xué)毒理學(xué)評價5、穩(wěn)定性分析6、一致性分析五、產(chǎn)品保存1、液態(tài)（1）低溫保存 -10-20

33、冰凍（2）在穩(wěn)定pH下 等電點(diǎn)附近共二百三十四頁（3）高濃度（4）加保護(hù)劑2、固態(tài)(gti)結(jié)晶或干粉與基因有關(guān)的藥物第十五節(jié) 反義技術(shù)和反義藥物正常轉(zhuǎn)錄中： 正義DNA (編碼鏈、正)雙鏈DNA 兩條單鏈 反義DNA（模板鏈、負(fù)） 蛋白質(zhì) mRNA 共二百三十四頁正義DNA RNA（反義RNA）（偶爾）在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)： 內(nèi)源性 反義RNA mRNA 蛋白質(zhì) 1978年根據(jù)病毒mRNA 序列人工設(shè)計、合成了互補(bǔ)于該mRNA 的13個堿基組成的寡聚脫氧核苷酸，研究發(fā)現(xiàn)它能抑制該病毒的復(fù)制，這種抑制作用是通過反義核酸機(jī)理實(shí)現(xiàn)的。 1981年第一次報道了天然反義RNA的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)在質(zhì)粒DNA復(fù)制

34、時，與引物RNA互補(bǔ)的RNA分子能抑制DNA復(fù)制。 1983年發(fā)現(xiàn)反義RNA 的調(diào)節(jié)作用，揭示了一種新的基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制。 1998年美國FDA批準(zhǔn)(p zhn)了第一個全球反義藥物福米韋森上市，用于治療愛滋病所致巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎。 反義藥物可特異地作用于靶基因或mRNA ，從基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯等各個環(huán)節(jié)上調(diào)控基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)疾病的治療。 共二百三十四頁一、含義(hny)： 反義技術(shù)： 反義核酸： 反義藥物（信息藥物）：二、反義核酸種類：1、反義DNA：2、反義RNA ： 合成：3、核酸酶： 合成：4、三鏈形成寡核苷酸（反基因策略）： 作用特點(diǎn)：5、多肽核酸： 其中反義RN

35、A效率最高：反義核酸作為藥物與常規(guī)藥物相比具有的優(yōu)點(diǎn)： 藥物的研究與開發(fā)取決于兩個參數(shù)：一個是確定疾病發(fā)展過程中的靶點(diǎn)，一個是發(fā)現(xiàn)能特異性識別并結(jié)合在靶點(diǎn)上的化合物，干預(yù)疾病的發(fā)展過程。過去常規(guī)藥物作用的靶點(diǎn)大多是蛋共二百三十四頁白質(zhì)、酶和激素。1、高度特異性：反義寡核苷酸與靶基因能通過堿基配對原理發(fā)生特異和有效 結(jié)合,從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。2、高效性：只需細(xì)胞內(nèi)很低濃度。3、最優(yōu)化的藥物設(shè)計：作用靶點(diǎn)是基因，有關(guān)(yugun)疾病的靶基因mRNA序列是已知的，設(shè)計簡單和 理性化。4、低毒、安全：與結(jié)合雙鏈的高度特異性有關(guān)。5、合成 特異性反義核酸比較 容易。缺點(diǎn)： 天然寡聚核苷酸難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)

36、；細(xì)胞內(nèi)容易被核酸酶水解；極短的血清半衰期；口服無活性。 很難直接用于治療，現(xiàn)多為修飾的寡聚核苷酸。三、反義作用的靶點(diǎn)和機(jī)制： 大多反義核酸主要通過抑制翻譯而發(fā)揮作用，但實(shí)際上反義核酸在細(xì)胞內(nèi)多層次發(fā)揮作用。具體作用靶點(diǎn)：共二百三十四頁1、抑制DNA復(fù)制 反義RNA與引物RNA前體互補(bǔ)結(jié)合抑制DNA復(fù)制。2、抑制轉(zhuǎn)錄 影響RNA聚合酶的作用；三鏈形成寡核苷酸可與基因DNA雙鏈形成DNA三螺旋結(jié)構(gòu)。3、抑制轉(zhuǎn)錄后過程 影響mRNA的成熟過程的步驟：剪接、成熟。4、抑制翻譯機(jī)制 反義核酸可以結(jié)合到mRNA的翻譯區(qū)，通過立體效應(yīng)阻礙核糖體和重要蛋白質(zhì)因子與mRNA結(jié)合或核糖體在mRNA上的移動，另外

37、與mRNA結(jié)合后可激活(j hu)內(nèi)源核酸酶或核酶，降解mRNA抑制翻譯過程。5、阻止成熟mRNA由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸。 翻譯水平上的調(diào)控是反義RNA的主要調(diào)控形式：在原核生物中反義RNA在翻譯水平上有三種作用：（1）與mRNA5端非翻譯區(qū)包括SD序列結(jié)合直接抑制翻譯；（2）與mRNA5編碼區(qū)主要起始密碼子AUG結(jié)合抑制翻譯起始。（3）與靶mRNA非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，使 mRNA構(gòu)象變化影響其與核糖體結(jié)合間接抑制mRNA翻譯。共二百三十四頁作用機(jī)制：1、2、四、反義藥物設(shè)計原理 mRNA 產(chǎn)生不適當(dāng)(shdng)或過量特殊蛋白質(zhì) 疾病 反義藥物（寡核苷酸） 激活 核酸酶H靶mRNA-反義藥物（寡

38、核苷酸） mRNA片段反義寡核苷酸藥物藥效 ： 透膜能力（由作用機(jī)制可見） 核酸酶耐受力 與RNA親和力 核酸酶H激活共二百三十四頁 遵循的原則：1、寡聚核苷酸-靶序列復(fù)合物穩(wěn)定2、此作用是專一的3、對抗核酸酶降解，半衰期要足夠長4、穿過膜力 未改造的寡聚核苷酸有專一性和親和性，激活核酸酶，使靶mRNA被降解，但不抗核酸酶降解和足夠的透膜性，要通過改造加以實(shí)現(xiàn)，改造包括：磷酸二酯骨架、雜環(huán)堿基和糖環(huán)，氫鍵骨架不能作大的改變。這些改造會影響專一性和親和性，因此，改造難以(nny)同時滿足上述要求。五、反義藥物設(shè)計制備1、人工合成：反義脫氧核糖寡核苷酸同時修飾骨架、磷酸、糖環(huán)及堿基等化學(xué)修飾增加核

39、酸酶抗性：共二百三十四頁 CH2 O 堿基 X=H(DNA) H H X=OH(RNA) H X H O AB O CH2 O 堿基 H H H X H OH堿基堿基共二百三十四頁 ： H O P O 原磷酸二酯 HS P O硫代磷酸酯 RO P O 烷基磷酸酯 R2N P O烷氨基磷酸酯 CH2 亞甲基第一代藥物：硫代磷酸寡聚核苷酸硫代磷酸鹽（已經(jīng)(y jing)上市的是該類）第二代藥物：混合骨架寡聚核苷酸，甲氧或乙氧取代2羥基第三代藥物：肽核酸，2-氨基乙基甘氨酸多聚體為骨架共二百三十四頁（1）磷酸(ln sun) 磷酸二酯鍵是核酸酶作用的關(guān)鍵化學(xué)鍵，而磷原子更是核酸酶攻擊中心，對該 原子

40、的輕微改變都會大大影響核酸酶的作用。 磷酸二酯骨架的改造可增強(qiáng)穩(wěn)定性、親和性和透過細(xì)胞膜能力。 磷原子被取代，甲基化 磷酸羥基被甲基、巰基、胺基和烷氧基取代，可改變離子特性，使其具有核酸酶抗性同時可以以被動轉(zhuǎn)運(yùn)的方式通過細(xì)胞膜。（2）骨架-多肽核酸 寡核苷酸鏈骨架是通過磷酸二酯鍵連接而成，其對核酸酶敏感，而反義寡核苷酸發(fā)揮其特異性抑制基因表達(dá)的關(guān)鍵在于其堿基排列順序，而與易降解的磷酸二酯鍵骨架無關(guān)，因此可以用肽骨架等替換磷酸二酯鍵骨架解決核酸酶抗性問題。（3）糖環(huán)有很多，如構(gòu)型，天然DNA的 型核苷鍵換成構(gòu)型，可以使核酸酶不能有效識別磷酸二酯鍵。共二百三十四頁（4）堿基 堿基是反義寡核苷酸與靶

41、基因通過氫鍵形成而直接接觸的部位，而氫鍵的形成又是反義寡核苷酸發(fā)揮作用的必要條件，所以此改變要慎重。 堿基修飾集團(tuán)有甲基、三氟甲基、炔丙基等。2、生物合成：反義RNA 利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建人工反義基因表達(dá)載體， 轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)錄(zhun l)出反義產(chǎn)物，再與靶基因mRNA互補(bǔ)， 調(diào)控特異基因的表達(dá)。六、最佳反義藥物的選擇1、2、3、4、七、反義藥物導(dǎo)入細(xì)胞的方法1、顯微注射 法2、載體導(dǎo)入法共二百三十四頁3、被動擴(kuò)散機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞法4、受體介導(dǎo)法5、脂質(zhì)體包埋后導(dǎo)入細(xì)胞6、口服給藥八、反義藥物作用特點(diǎn)1、特異性強(qiáng)，只阻斷靶基因的表達(dá)2、安全(nqun),反義RNA不改變基因結(jié)構(gòu)，最終會被RNA酶水

42、解，不 整合。3、易操作，反義RNA可大量合成。4、可作成復(fù)合反義RNA，同時作用于數(shù)個靶點(diǎn)。5、反義RNA臨床應(yīng)用存在問題，如副作用。6、反義RNA與mRNA互補(bǔ)親和力受其結(jié)構(gòu)影響7、核酸酶設(shè)計要求高，限制其發(fā)展。共二百三十四頁九、反義藥物的體外藥理研究1、病毒?。悍忾]病毒基因。如麻疹病毒、流行性出血熱病毒2、癌癥：腫瘤發(fā)生與癌基因突變有關(guān)；也與抑制細(xì)胞正常凋亡有關(guān)。反義藥物可封閉相關(guān)基因(jyn)。3、神經(jīng)系統(tǒng)衰老過程中，腦神經(jīng)元的凋亡與有關(guān)蛋白表達(dá)增加相關(guān)。4、成骨不全是一類與膠原蛋白基因突變有關(guān)的遺傳性功能紊亂。5、耐藥性多藥耐藥基因可引起敏感細(xì)胞的多藥耐藥。共二百三十四頁6、血管平滑

43、肌 平滑肌細(xì)胞的遷移和增生是內(nèi)膜增生的主要特征。與相關(guān)基因有關(guān)，反義藥物可以防止冠狀動脈再狹窄和血管成形術(shù)后的病人血管再狹窄。7、高血壓十、反義藥物待解決的問題(wnt)1、安全性問題如第一代反義藥物、大劑量給藥動物死亡；、動物白細(xì)胞總數(shù)暫時性下降，血壓、心率發(fā)生變化；、它與蛋白具有親和性，影響蛋白正常功能；、在動物肝、腎和骨髓中聚集、沉積，長期效應(yīng)不確切。2、專一性問題過量表達(dá)的失控基因只存在于特定組織器官中，在其他部位仍能正常表達(dá)，反義藥物要專一作用于失控基因。3、穩(wěn)定性問題在人體內(nèi)對核酸酶不穩(wěn)定4、反義藥物副作用原因 共二百三十四頁三螺旋(luxun)技術(shù)-抗基因核酸技術(shù) 15-17個核

44、苷酸長度的短寡脫氧核糖核苷酸特異結(jié)合到DNA雙螺旋的互補(bǔ)區(qū)域上，形成三螺旋結(jié)構(gòu),抑制DNA復(fù)制。三螺旋技術(shù)與反義技術(shù)的區(qū)別： 1、三螺旋DNA所需劑量較反義RNA小得多； 因?yàn)樗饔冒悬c(diǎn)在轉(zhuǎn)錄水平的DNA上，而反義RNA作用于轉(zhuǎn)錄后放大的mRNA水平。 2、三螺旋DNA特異性高； 3、半衰期短、穩(wěn)定性不夠。共二百三十四頁十一、寡核苷酸的非反義應(yīng)用1、誘餌核酸（正義技術(shù)）模擬DNA位點(diǎn)合成雙鏈寡核苷酸競爭結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子抑制(yzh)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與啟動子結(jié)合抑制(yzh)轉(zhuǎn)錄2、免疫調(diào)節(jié)劑CpG DNA3、適體技術(shù) 適體是結(jié)合到蛋白質(zhì)或其他小分子上的單鏈或雙鏈的寡核苷酸序列。 它能夠結(jié)合到蛋白質(zhì)

45、上如與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合可阻斷基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成。4、DNA疫苗定義：給藥方法： 共二百三十四頁1、裸DNA直接(zhji)注射于肌肉、皮下、黏膜或靜脈內(nèi)；2、脂質(zhì)體包埋注射；3、用基因槍注入組織內(nèi)；4、用無害細(xì)菌作載體帶入。DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)： DNA疫苗的缺點(diǎn)：1、 1、2、 2、3、 3、4、 4、5、6、7、8、 5、 第十六節(jié) 基因治療分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)等 遺傳疾病分子機(jī)理:基因缺失、重排、突變和基因的異常表達(dá) 遺傳疾病 遺傳疾病的分子機(jī)理模型共二百三十四頁變異的基因或異常表達(dá)基因 正?；蚧蛘１磉_(dá)基因 治愈遺傳疾病 作為一種療法，1973年代開始人體試驗(yàn)，2、7歲兩姐妹體內(nèi)缺少一種

46、酶，精神癡呆。把攜帶酶基因的病毒注入體內(nèi)，試圖使酶分泌恢復(fù)正常，但沒有結(jié)果。 80年美國醫(yī)生對兩名地中海貧血患者進(jìn)行基因治療，結(jié)果也未成功。 80年代初，安德森闡明了基因治療的前景和發(fā)展(fzhn)方向，之后，大批科學(xué)家進(jìn)行了大量的動物實(shí)驗(yàn)，為基因治療的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。 90年用反轉(zhuǎn)錄病毒載體將基因?qū)肽[瘤浸潤淋巴細(xì)胞，并把它輸回體內(nèi)進(jìn)行追蹤，發(fā)現(xiàn)此細(xì)胞集中于腫瘤部位，并在半年后基因仍表達(dá)。90年9月14日FDA批準(zhǔn)臨床實(shí)驗(yàn)：患者缺失一個基因?qū)е氯狈ο佘账崦摪泵福嗣甘敲庖呦到y(tǒng)必須的。把此酶基因轉(zhuǎn)入患者淋巴細(xì)胞后，經(jīng)培養(yǎng)篩選出產(chǎn)生腺苷酸脫氨酶的淋巴細(xì)胞，再把的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)，結(jié)果

47、患者癥狀明顯緩解 91年對黑色素瘤晚期患者進(jìn)行基因治療，把腫瘤壞死因子基因轉(zhuǎn)入淋巴細(xì)共二百三十四頁胞，結(jié)果(ji gu)淋巴細(xì)胞集中在腫瘤部位并殺死腫瘤細(xì)胞，治療取得一定效果。 此后，對各種疾病都進(jìn)行了基因治療的臨床實(shí)驗(yàn)，但有的成功，有的失敗。一、定義： 缺點(diǎn)：二、分類：根據(jù)基因治療靶細(xì)胞：1、2、三、治療方式：1、矯正性基因治療123 42、調(diào)控性基因治療共二百三十四頁1反義技術(shù)A、B、C、2基因(jyn)代償基因治療的其它方式1、2、3、共二百三十四頁四、基因治療途徑1、體外基因治療靶細(xì)胞滿足條件：12342、體內(nèi)基因治療兩種方法(fngf)比較：共二百三十四頁五、基因治療中基因轉(zhuǎn)移載體1

48、、病毒載體1反轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒 反轉(zhuǎn)錄病毒基因組 反轉(zhuǎn)錄病毒生活周期 反轉(zhuǎn)錄病毒作為(zuwi)載體的優(yōu)點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄病毒載體 反轉(zhuǎn)錄病毒載體具備的條件 反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞共二百三十四頁2腺病毒載體 優(yōu)點(diǎn)：腺病毒載體系統(tǒng)(xtng)使用原理： 缺點(diǎn)：還有：腺病毒相關(guān)病毒、痘苗病毒、單純皰疹病毒、人工染色體2、非病毒載體 轉(zhuǎn)移效率低，但無毒。非病毒轉(zhuǎn)移法顆粒轟擊、裸DNA直接注射、顯微注射、電穿孔、磷酸鈣共沉淀、陽離子脂質(zhì)體。共二百三十四頁病毒增強(qiáng)轉(zhuǎn)移法仙臺病毒增強(qiáng)法六、基因治療的靶向問題1、目的基因表達(dá)空間的定位 靶向載體(zit) 受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 靶向反轉(zhuǎn)錄病毒載體 a、b、c、 靶向轉(zhuǎn)

49、錄2、目的基因表達(dá)時序的調(diào)控 3、目的基因表達(dá)水平的調(diào)控共二百三十四頁七、基因治療的步驟 1、分離出目的(md)基因 選擇原則： 2、選擇載體和受體細(xì)胞 3、基因?qū)?4、外源基因表達(dá)八、基因治療臨床應(yīng)用 1、遺傳病： 2、腫瘤病作用方式：（1）免疫基因治療 1 2共二百三十四頁（2）自殺基因治療（3）反義基因治療 （4）多藥抗性基因治療（5）抑癌基因治療 3、病毒?。?）（2） 1 2 3九、前景和存在的問題存在的問題：基因轉(zhuǎn)移效率低，導(dǎo)入基因的表達(dá)(biod)難以調(diào)控，載體本身有缺陷。共二百三十四頁要作好基礎(chǔ)研究：1、疾病發(fā)病機(jī)制；2、完善基因轉(zhuǎn)移載體；3、研究基因的表達(dá)及其調(diào)控；4、建立

50、良好的實(shí)驗(yàn)動物模型第十七節(jié) 人類基因組與藥學(xué) 新藥發(fā)現(xiàn)的基因組策略 人類基因組序列人類基因組計劃： 確定基因序列 （結(jié)構(gòu)基因組學(xué)）功能(gngnng)基因組學(xué) ： 功能(gngnng)基因組學(xué) 鑒定某疾病相關(guān)的基因功能蛋白質(zhì)組學(xué)： 共二百三十四頁生物信息學(xué) ： 蛋白質(zhì)組學(xué)/生物信息學(xué) 鑒定與某疾病有關(guān)(yugun)的基因產(chǎn)物 蛋白質(zhì)生產(chǎn) 生產(chǎn)某疾病可能的靶蛋白 配體發(fā)現(xiàn) 鑒定在某疾病中與特定靶蛋白結(jié)合的分子 確認(rèn)靶標(biāo) 配體生物分析 配體最優(yōu)化 證實(shí)在某疾病中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)靶標(biāo) , 證實(shí)配體結(jié)合對蛋白質(zhì)靶標(biāo)的最佳影響， 共二百三十四頁 對配體結(jié)構(gòu)的適當(dāng)修飾以達(dá)到最佳治療(zhlio)效果 具

51、有新的作用機(jī)制的藥物 共二百三十四頁 第四章 微生物工程制藥微生物工程：微生物藥物：現(xiàn)在微生物藥物研究的特點(diǎn)：（1）（2）（3）（4）第一節(jié) 微生物藥物產(chǎn)生菌培養(yǎng)概述一、微生物藥物的產(chǎn)生菌1、細(xì)菌 球菌(qijn) 螺旋菌 桿菌（常用）共二百三十四頁2、放線菌 來自放線菌的藥物有： 抗菌藥物及產(chǎn)生菌 （1）-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生菌 如硫霉素 （2）氨基(nj)糖苷類 如鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素 （3）四環(huán)素類 如金霉素、土霉素、四環(huán)素 （4）大環(huán)內(nèi)脂類 如紅霉素、螺旋霉素、麥迪霉素 （5）糖肽類 如萬古霉素 （6）多烯類 如黃曲霉素 （7）紫霉素 （8）其他抗生素類 具體如：鏈霉素-灰色鏈霉菌

52、 土霉素-龜裂鏈霉菌 金霉素-金黃色鏈霉菌 氯霉素-委內(nèi)瑞拉鏈霉菌 紅霉素-紅霉素鏈霉菌 共二百三十四頁 慶大霉素-紅色小單孢菌 卡那霉素-卡那霉素鏈霉菌 抗腫瘤藥物： 蒽環(huán)類 糖肽類 烯二炔類和絲裂烷類 色霉素類放線菌是生產(chǎn)抗生素主要菌之一。3、酵母菌 代謝產(chǎn)物： 菌體內(nèi)(t ni)成分：4、真菌青霉素頭孢菌素灰黃霉素 環(huán)孢菌素共二百三十四頁二、微生物藥物產(chǎn)生菌的篩選、保存及改良1、篩選（1）篩選的一般要求(yoqi)110（2）篩選途徑 1菌種機(jī)構(gòu) 2自然界 3從生產(chǎn)過程共二百三十四頁2、微生物菌種保藏 保藏目的： 保藏原理： 方法：（1）（2）（3）（4）（5）3、微生物藥物(yow)產(chǎn)

53、生菌的改良理論基礎(chǔ)、研究對象、研究目的、研究內(nèi)容改良的意義共二百三十四頁方法：（1）自然選育：（2）誘變育種物理(wl)誘變劑 紫外線、激光、-、 -、 X-射線、微波化學(xué)誘變劑 烷化劑（芥子氣）、嵌合劑（溴化乙啶）、堿基類似物 亞硝酸、抗生素生物誘變劑 噬菌體 轉(zhuǎn)座子：能夠轉(zhuǎn)移位置的遺傳因子。（3）雜交育種共二百三十四頁 原生質(zhì)體融合：概念：原生質(zhì)體融合技術(shù) 1、基本過程2、融合親本的選擇(xunz)3、促融因素 4、融合子的檢出常用于菌種的改良。優(yōu)點(diǎn)： 1 234 共二百三十四頁接合: 準(zhǔn)性生殖：指真菌中不通過有性生殖的基因重組過程。（4）基因工程技術(shù)改良菌種三、菌種的退化與復(fù)壯菌種的退化

54、：菌種經(jīng)過多次傳代或長期保藏之后，由于自然突 變等原因，使細(xì)胞的遺傳性狀發(fā)生改變，造成(zo chn)菌 種不純，生產(chǎn)能力下降的現(xiàn)象。菌種的退化的原因（1） 自發(fā)突變與回復(fù)突變 基因突變是菌種的退化的主要原因，傳代次數(shù)越多突變率越高。共二百三十四頁（2）遺傳不穩(wěn)定性 DNA重建（3）細(xì)胞自身調(diào)節(jié)和修復(fù) 體內(nèi)多條DNA修復(fù)途徑（4）環(huán)境條件(tiojin)的影響防止菌種退化的措施（復(fù)壯）（1）單孢子的分離（2）減少傳代次數(shù)（3）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)環(huán)境（4）增加遺傳穩(wěn)定性 添加抗誘變劑（5）采取有效的菌種保藏方法共二百三十四頁四、微生物的培養(yǎng)及培養(yǎng)基1、微生物的營養(yǎng)要求培養(yǎng)基營養(yǎng)成分有： 碳源： 氮源

55、： 無機(jī)鹽和微量元素： 生長因子：培養(yǎng)基有： 根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)有： 液體(yt)培養(yǎng)基：工業(yè)常用 固體培養(yǎng)基： 半固體培養(yǎng)基：共二百三十四頁根據(jù)培養(yǎng)基組成物質(zhì)的純度有： 合成培養(yǎng)基： 天然培養(yǎng)基：根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途有： 鑒別培養(yǎng)基 選擇性培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基 加富培養(yǎng)基根據(jù)生產(chǎn)中的用途有： 孢子(boz)培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基共二百三十四頁2、培養(yǎng)基組成及配制(pizh)原則（1）工業(yè)用培養(yǎng)基的一般要求 1 2 3 4（2）配制原則 1 2 3 4 5共二百三十四頁第二節(jié) 微生物(shngw)藥物的生物(shngw)合成一、微生物的代謝 1、微生物的初級代謝和次級代謝 初級代謝：

56、次級代謝： 2、初級代謝和次級代謝的關(guān)系二、微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成的基本特征（1）（2）（3）（4）（5）共二百三十四頁三、微生物藥物生物合成的基本途徑1、次級代謝產(chǎn)物(chnw)的生源生源：（1）聚酮體（2）糖類（3）不常見氨基酸（4）非核酸的嘌呤和嘧啶堿（5）莽草酸（6）甲羥戊酸2、微生物藥物生物合成的基本途徑（1）前體聚合 （2）修飾共二百三十四頁（3）不同組分裝配四、微生物藥物生物合成的調(diào)節(jié)(tioji)機(jī)制 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、共二百三十四頁第三節(jié) 微生物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵(f jio)特點(diǎn)： （1） （2） （3） （4） （5） （6

57、）一、微生物細(xì)胞培養(yǎng)方法根據(jù)培養(yǎng)基分為1、固體培養(yǎng)法2、液體培養(yǎng)法 液體培養(yǎng)法根據(jù)通氣方式不同有：共二百三十四頁（1）液體表面培養(yǎng)法（2）液體深層培養(yǎng)法 1 2 3二、微生物培養(yǎng)一般(ybn)工藝流程 斜面 搖瓶 種子罐 發(fā)酵罐 共二百三十四頁 培養(yǎng)基滅菌 培養(yǎng)基配制 培養(yǎng)基原料成品包裝 精制 提取(tq) 無細(xì)胞澄清液 細(xì)胞分離 培養(yǎng)液 廢棄 菌體共二百三十四頁三、種子(zhng zi)培養(yǎng) 1 、含義 2 、種子應(yīng)具備的條件及質(zhì)量判斷方法 3 、種子制備 4 、接種齡與接種量四、培養(yǎng)條件及工藝條件控制共二百三十四頁1、溫度(wnd)影響及控制2、pH影響及控制3、溶解氧的影響及控制4、菌種

58、與培養(yǎng)基的混合程度共二百三十四頁 第四節(jié) 生物反應(yīng)器及檢測和控制系統(tǒng)一、概述1、定義(dngy)：2、分類：（1）（2） 1 2二、微生物生物反應(yīng)器共二百三十四頁1、微生物生物反應(yīng)器在制造上的基本(jbn)要求1234567892、類型（1）機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐共二百三十四頁 組成： 1罐體 2 攪拌系統(tǒng) 3 加溫(ji wn)和冷卻系統(tǒng) 4 進(jìn)出氣系統(tǒng) 5 進(jìn)出液系統(tǒng) 6 檢測和控制系統(tǒng) 7 管線和接頭（2）自吸式發(fā)酵罐（3）鼓泡式發(fā)酵罐（4）氣升式發(fā)酵罐：如圖共二百三十四頁（5）基因工程發(fā)酵罐三、其它反應(yīng)器四、檢測和控制系統(tǒng)1、培養(yǎng)中需檢測的參數(shù) 溫度 攪拌速度 進(jìn)出液流量 溶解氧 pH 罐壓

59、 液位 裝液量 物料密度 物料濁度 物料黏度 氧化電位2、檢測和控制(kngzh)方法（1）溫度（2） pH （3） 溶解氧 （4）攪拌速度 （5）進(jìn)出液流量共二百三十四頁第五節(jié) 微生物工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用一、微生物工程產(chǎn)品類型1、菌體2、初級代謝產(chǎn)物3、次級代謝產(chǎn)物4、生物活性大分子二、在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用可生產(chǎn)如下物質(zhì)作為(zuwi)藥物1、抗生素類（1）抗細(xì)菌（2）抗真菌（3）抗腫瘤共二百三十四頁（4）半合成2、氨基酸類3、核苷酸類4、維生素類5、甾體類6、治療(zhlio)酶及酶抑制劑抗腫瘤抗生素1、蒽環(huán)類天然類阿霉素 道諾霉素 洋紅霉素 阿克拉霉素2、絲裂烷類絲裂霉素ABC-M共二百

60、三十四頁它們都具有丫啶吡咯并吲哚醌主核。 絲裂霉素A、B具有抗腫瘤作用，但毒性(d xn)大。絲裂霉素C活性最強(qiáng)。3、博來霉素-腐草霉素類4、色霉素-橄欖霉素類5、放線菌素類6、烯炔類7、吡喃并蒽醌類8、吡咯1，4苯并二氮雜 卓類酶抑制劑1、蛋白質(zhì)代謝相關(guān)酶抑制劑微生物來源的蛋白質(zhì)酶抑制劑多為低分子化合物。共二百三十四頁與凝血、溶栓、免疫應(yīng)答疾病相關(guān)蛋白質(zhì)酶有： 纖維蛋白酶亮肽素 胰蛋白酶抗痛素 糜蛋白酶糜蛋白酶抑素 彈性蛋白酶彈性蛋白酶抑素與消化潰瘍、血壓疾病相關(guān)蛋白質(zhì)酶有： 胃蛋白酶(wi dn bi mi)胃蛋白酶(wi dn bi mi)抑素A 腎素金屬蛋白酶有 膠原酶放線酰胺素 共二