代謝調(diào)控理論在微生物發(fā)酵中的應(yīng)用

1、代謝調(diào)控理論在微生物發(fā)酵中的應(yīng)用參考文獻(xiàn)賈紅華,韋萍，何冰芳.L苯丙氨酸生產(chǎn)的代謝工程研究.生物加工過程.2004,2（2）：8-12目的使得更加理性的改造菌株成為可能，促進(jìn)發(fā)酵法的廣泛應(yīng)用方法目前至少已發(fā)現(xiàn)7種微生物的苯丙氨酸合成途徑，且均非常相似。由于野生菌不會(huì)直接大量產(chǎn)生L-苯丙氨酸，高效的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌株多采用誘變和基因工程手段相結(jié)合來改變野生菌的芳香族氨基酸生物合成的相關(guān)代謝流量而獲得。研究人員對(duì)L-苯丙氨酸生物合成途徑中相關(guān)基因及其酶進(jìn)行調(diào)控，并對(duì)中央代謝途徑進(jìn)行一定的改造，在芳香族氨基酸生物合成支路中也進(jìn)行特定的修飾。相關(guān)基因及其酶進(jìn)行調(diào)控PEP和E4P合成DAHP的反應(yīng)由3

2、個(gè)DAHP合成酶同工酶所催化。分別受L-色氨酸（由aroH表達(dá)）、L-苯丙氨酸（由aroG表達(dá)）和L-酪氨酸（由aroF）反饋抑制。作為關(guān)鍵反應(yīng)之一的分支酸轉(zhuǎn)化為預(yù)苯酸的反應(yīng)依賴于兩個(gè)不同的分支酸變位酶（分別由phoA，tyrA表達(dá)），并分別受L-苯丙氨酸和L-酪氨酸反饋抑制。而莽草酸脫氫酶則受其產(chǎn)物莽草酸抑制。中央代謝途徑改造中央代謝途徑是控制中間產(chǎn)物的代謝流量、產(chǎn)物的形成速率及產(chǎn)率的關(guān)鍵步驟。為高效生產(chǎn)目的產(chǎn)品，必須對(duì)中央代謝途徑的相關(guān)步驟進(jìn)行調(diào)節(jié)控制。芳香族氨基酸生物合成途徑的共同前體PEP和E4P均來自中央代謝途徑（如圖2所示）。糖酵解途徑會(huì)產(chǎn)生PEP，而E4P則由磷酸戊糖途徑供應(yīng)。通

3、過對(duì)E.coli的中央代謝途徑的計(jì)量分析顯示，當(dāng)該菌生長在以葡萄糖作為唯一碳源的限制性培養(yǎng)基上時(shí)，大約有30%的G6P會(huì)進(jìn)入磷酸戊糖途徑，但僅有3%的PEP用于芳香族氨基酸的生物合成。研究表明：僅有當(dāng)量PEP供應(yīng)時(shí)，L-苯丙氨酸的理論產(chǎn)率為30%，當(dāng)PEP的供應(yīng)量加倍時(shí)，其理論產(chǎn)率將增加到56%。為改善芳香族氨基酸的生產(chǎn)，研究人員采用分子生物學(xué)手段對(duì)該兩個(gè)生物合成途徑進(jìn)行基因構(gòu)建及改造，且取得了滿意的成績。phosphatepathwayrc*”*FkjUOHGlycolysiaaroGartFdahpE2|aiaBDHQE3|aroDDHSrE4I自roEsroKE5MIS3P+PEPE&*

4、aroAEPSPE7|anoCTrpANTHFEE磷酸堤弟弍丙劇賤匕E4E4磷醱赤佟殆門MHFX竝氧冬詡7磷酸康酮搪酸岸DiiQ疝脫氫奎寧陵廿佔(zhàn)亠悄莖莖草馥；汨1扎.莽草醸;毋P，手磷醸菇草酸:EPSP-芳磷酸燒醇式丙聚醱莽草弊CHA，分支酸：ITA-預(yù)蘋酸：PPY,苯丙酮酸;Hit-1,苯丙氫觀；Ell)4H卩合呢酶：E2f【HQ合.成酶fE3.DHQ脫忒酶;4.5HIK脫址酶電卜15闕IK激廊!/lhE6Y.PSP合或晦；忙門CHA臺(tái)成酶；爍CHA變位l/PPA脫水貉眇纂基轉(zhuǎn)移匪圖1L-苯丙氨酸的生物合成途徑及其相關(guān)調(diào)控在E.coli中，1_-苯丙氨酸的一般生物合成途徑如圖1所示：由4-磷

5、酸赤蘚糖(E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)縮合形成2-酮-3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)開始，并把這七碳中間代謝物轉(zhuǎn)化為莽草酸(SHIK)，然后再轉(zhuǎn)化為分支酸(CHA)，由分支酸合成苯丙酮酸(PPY)，最后苯丙酮酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用生成1_-苯丙氨酸。!、.1【咋圧I”憐駐基轉(zhuǎn)榕系統(tǒng);C6F乩6環(huán)馥越瑩隊(duì)三氫葬；轉(zhuǎn)酮厚酶匸T轉(zhuǎn)醛醉酶；Pgb璘酸葡荀糯異枸酶；PjdPEP凄化酶;pyk丙舸磴澈酶斑.PEP鞭化獗鄭聖6PEP今成覘侃;已6-磷靈葡赫縮存(5氏岳磷讓果卷A3氏3濮叢甘油PEP-磷醸烯姜武丙鬧鼬仃扎L草跌乙望MP*山&譜團(tuán)葡昌柵鞍”出帆5綠囊核鬧酶陽沾汛乩朗觀孩弗也刃占

6、-燙酸本舸弘刖=圖2E.coli的中央代謝系統(tǒng)中央代謝途徑是控制中間產(chǎn)物的代謝流量、產(chǎn)物的形成速率及產(chǎn)率的關(guān)鍵步驟。為高效生產(chǎn)目的產(chǎn)品，必須對(duì)中央代謝途徑的相關(guān)步驟進(jìn)行調(diào)節(jié)控制。結(jié)果分析增加PEP的供應(yīng)量PEP是涉及幾個(gè)代謝過程的關(guān)鍵中間體。通過構(gòu)建一PEP羧化酶陰性E.coli突變株，切斷PEP到草酰乙酸的代謝通路，使L-苯丙氨酸的產(chǎn)量提高6倍。如果還同時(shí)高水平表達(dá)PEP合成酶還可增加芳香族氨基酸合成途徑中的碳流量，提高PEP的供應(yīng)量，從而超量產(chǎn)生DAHP，增加L-苯丙氨酸及其他多種L-型氨基酸的產(chǎn)量。增加E4P的供應(yīng)量轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶是磷酸戊糖途徑非氧化階段的兩個(gè)關(guān)鍵酶。E4P是由磷酸戊

7、糖之間經(jīng)轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移產(chǎn)生。超量表達(dá)轉(zhuǎn)酮醇酶基因(tktA)，可明顯提高E.coli中的轉(zhuǎn)酮醇酶活性和E4P的供應(yīng)量，同時(shí)增加DAHP的產(chǎn)量。通過大量產(chǎn)生一抗反饋抑制DAHP合成酶和轉(zhuǎn)酮醇酶導(dǎo)致進(jìn)入芳香族氨基酸生物合成途徑的碳流量增加了兩倍。采取擴(kuò)增E.coli中aroG和tktA基因,并使兩個(gè)丙酮酸激酶同工酶失活，可明顯增加DAHP的產(chǎn)量。如果同時(shí)表達(dá)tktA和aroF基因，則會(huì)使E.coli的DAHP的分泌量增加40倍。結(jié)論在L-苯丙氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，對(duì)其錯(cuò)綜復(fù)雜的代謝途徑的調(diào)控已經(jīng)取得了很大的成就。隨著。隨著MS和NMS等分析手段與同位素示蹤技術(shù)的高度發(fā)展與相互結(jié)合，將為解明細(xì)胞中的代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。隨著大量微生物的基因組全序列的逐漸被測定出來