在腫瘤學研究中試驗動物的應(yīng)用課件

1、腫瘤與實驗動物 博、碩士研究生 腫瘤學研究中實驗動物的作用 腫瘤（Tumor），惡性腫瘤（Cancer）是危害人類生命健康最嚴重疾病之一。WHO預測21世紀癌癥將成為人類第一殺手。近20年來，我國癌癥發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢，死亡率由83.65/10萬108.26/10萬；20042005年為135.88/10萬。每年新發(fā)病例達220萬人以上，平均每死亡5人中就有1人死于癌癥。死亡譜發(fā)生很大變化：宮頸癌下降；肺癌急劇上升，20年上升了147%；胃癌、肝癌仍居高不下；直結(jié)腸癌和乳腺癌呈上升趨勢。我國兼有發(fā)展中國家和發(fā)達國家高發(fā)癌并存現(xiàn)象。 從上世紀90年代至今，我國城市惡性腫瘤死亡率上升33

2、.41%，農(nóng)村上升20.5%。我國發(fā)病率與美國、英國、法國接近；高于日本、澳大利亞、印度、泰國等國。 WHO癌癥顧問委員會提出：1/3癌癥可預防；1/3若能早期診斷可治愈；1/3癌癥可減輕痛苦，延長壽命。 我國正在對常見八大腫瘤（食道癌、肺癌、乳腺癌、鼻煙癌、肝癌、胃癌、宮頸癌和腸癌），早期診斷和篩查技術(shù)、方法、對策與措施進行研究和制定統(tǒng)一標準和規(guī)范化方案。 山東每年癌癥發(fā)病者為150多萬人，死亡人數(shù)達15萬左右。上海成為全國癌癥高發(fā)地： 上海市CDC公布首份覆蓋全市戶籍居民登記表顯示：該市每10萬人口癌癥發(fā)病達312例，已成為全國癌癥高發(fā)地區(qū)之一，發(fā)病率與歐美國家接近。專家分析，上海市癌癥發(fā)

3、病率呈“四高”現(xiàn)象： 年長者高于年輕者：中心地區(qū)高于周邊，中心地區(qū)人口明顯老齡化是一大原因。 男性總體高于女性（肺癌2.13：1；胃癌2.5：1；肝癌4：1；）：周邊城區(qū)男性因吸煙率居高不下，患腫瘤危險較中心地區(qū)高2.84%；中心城區(qū)女性由于長期靜坐，吸煙,患腫瘤的危險較周邊城區(qū)高2.53%。 不良的生活方式直接導致癌癥高發(fā)：該市男性過量飲酒率18%，居民超重率19%，肥胖率6%。研究證實，1/3癌癥由生活方式因素引發(fā)。肺癌成為男女首位癌癥；乳腺癌30年內(nèi)發(fā)病率翻兩倍；男性前列腺癌、女性直腸癌、肺癌有明顯上升趨勢（裝修材料含氡，直接誘發(fā)）。是否患癌還決定行為方式。 研究腫瘤病因?qū)W、發(fā)病學、腫瘤

4、細胞生物學特性、腫瘤和宿主相互關(guān)系、腫瘤診斷預防和治療等有關(guān)腫瘤一切知識總稱為腫瘤學（Oncology）。 分為兩大領(lǐng)域：臨床腫瘤學和實驗?zāi)[瘤學。前者以人為主要對象, 預防和診治這一疾??；后者廣泛，實驗室探索與腫瘤有關(guān)各方面課題，各項成果為前者服務(wù)。實驗?zāi)[瘤學研究中，實驗動物是主要研究對象。實驗?zāi)[瘤學研究中，離不開實驗動物和實驗動物科學各項開發(fā)研究成果。 選用實驗動物進行動物實驗，創(chuàng)立了實驗?zāi)[瘤學，發(fā)現(xiàn)化學致癌物質(zhì)和致癌病毒，推動了腫瘤學研究，近交系動物應(yīng)用，對腫瘤病因?qū)W、發(fā)病學、實驗治療和新的抗癌藥篩選發(fā)揮了重要作用。 實驗動物腫瘤學特點 不同種屬動物 1、靈長類動物：從種系發(fā)生學上來看，非

5、人靈長類動物與人的親緣關(guān)系最近。各種形態(tài)和生物性質(zhì)上與人腫瘤相似病變，腫瘤發(fā)病率與動物種屬、性別、年齡及捕養(yǎng)時間有關(guān)。實驗室條件下，獼猴自發(fā)性腫瘤發(fā)病率較高。動物園內(nèi)，獼猴腫瘤發(fā)生率約1%。惡性淋巴瘤常見，腦腫瘤少見。中子和質(zhì)子輻射可誘發(fā)顆粒細胞性白血病；對化學致癌物敏感性高于人類。 2、大型實驗動物：腫瘤發(fā)病率隨種屬而異，雌犬發(fā)生乳腺腫瘤，母牛則否。雌犬發(fā)生乳腺腫瘤與人類乳腺癌表現(xiàn)不同。雌犬為混合型，包括上皮成分，骨和軟骨組織。 3、嚙齒類動物：Slye1922年指出：小鼠腫瘤在組織發(fā)生，臨床過程都與人類腫瘤有相似之處。Little培育出近交系小鼠，實驗?zāi)[瘤學研究中廣泛應(yīng)用各種高癌和低癌品系

6、進行研究。大鼠也廣泛應(yīng)用于腫瘤研究的許多領(lǐng)域之中:它體積較大，供給組織多，便于進行手術(shù)、注射等實驗操作。大鼠自發(fā)性腫瘤發(fā)病率較小鼠低。大鼠自發(fā)性肝癌少見。大鼠肝臟對致癌劑作用卻很敏感，大鼠肝癌研究積累大量有關(guān)肝癌病因?qū)W、發(fā)病學和分子生物學方面資料。大鼠白血病發(fā)病率較小鼠低，發(fā)病是顆粒細胞型，小鼠以淋巴細胞型多見；金黃地鼠利用其頰囊移植腫瘤；豚鼠以前認為很少發(fā)生腫瘤，研究發(fā)現(xiàn)，它們也會自發(fā)多種腫瘤，支氣管乳頭狀腺瘤多見。三年齡以下豚鼠腫瘤易于轉(zhuǎn)移，但幼年豚鼠腫瘤發(fā)病率不高。 4、鳥類：其發(fā)生腫瘤以其病毒病因引人注目:造血系統(tǒng)和間葉組織腫瘤其病毒病因已明確。雞群中發(fā)生皰疹病毒引起Marek氏病，作

7、為一種模型，可與人類Burkitt氏淋巴瘤，猴淋巴瘤相類比。雞對于腫瘤病毒研究具有極高使用價值。日本大力開展雞SPF化，除去已知白血病病毒，研究它們對白血病病毒、肉瘤等毒株敏感性，搞清病毒感受性遺傳，研究解決內(nèi)源性病毒遺傳控制。 5、兩棲類動物：蛙發(fā)生Lucke氏腎腺癌研究較多，至少4種病毒引起。研究免疫抑制狀態(tài)在腫瘤發(fā)生中作用，用兩棲類動物進行。其無毛而光滑的皮膚為皮膚腫瘤發(fā)生、發(fā)展提供了與人情況更為接近模型。 6、 魚類：研究較多（產(chǎn)卵多，方便研究）。軟骨魚類自發(fā)腫瘤，其它種屬魚常見患瘤。對化學致癌物頗為敏感，黃曲霉素或二甲基亞硝胺引發(fā)魚（鱒魚）肝臟腫瘤和腎母細胞瘤。魚是測試環(huán)境致癌因素敏

8、感對象。魚類雜交F1代，能使腫瘤發(fā)病率提高或抑制腫瘤。 不同類型的實驗動物 Inbred strain animals：實驗動物對腫瘤方面遺傳性狀研究。不同近交系動物有不同遺傳性狀，自發(fā)瘤發(fā)生率有明顯不同，對同一致癌物敏感性不同。不同腫瘤研究需要，選用腫瘤學具有不同遺傳性狀特點近交系動物進行研究。近交系動物自發(fā)瘤發(fā)生率高低不等，有些高癌系小鼠，只要活到一定年齡，無需任何外加處理，幾乎可以100%自發(fā)白血病、肺癌和乳腺癌，從而證實癌癥是可以遺傳。遺傳學方法培育對致癌因子敏感性高或低品系，證實誘發(fā)腫瘤發(fā)生在相當程度是取決于動物遺傳組成。C3H小鼠:乳腺癌高發(fā)品系，體內(nèi)有一種乳腺癌病毒（乳汁因子），

9、通過授乳傳給子代。C3H雌性鼠在乳汁因子和激素作用下極易發(fā)生乳癌 。乳汁因子在體外不能生存，乳汁因子感染成年動物不能致癌。C57BL6J（黑）雌性X C3H-F1代， C57BL6J黑基因引入C3H小鼠F1中，使后者體內(nèi)原有乳汁因子趨于死亡。C3H小鼠：乳癌易感小鼠，病毒、射線和激素乳癌；Snell小鼠肺癌， C57BL6J小鼠心血管疾病，兩種小鼠長期吸入香煙，前者肺癌發(fā)生率高，出現(xiàn)快，后者肺小血管病變比對照組增多，未誘發(fā)肺癌。 外因作用下不同基因型小鼠產(chǎn)生完全不同結(jié)果。 不同近交系小鼠遺傳性狀各不相同，可選擇不同品系特點動物進行各項腫瘤研究。 （1）研究遺傳因素對某種癌癥作用，選高乳腺癌系小

10、鼠，與低乳腺癌系小鼠進行對比； （2）了解某種病毒誘發(fā)腫瘤，選對這一病毒具有敏感性近交系小鼠； （3）確定某種可疑致癌物作用，選中等腫瘤發(fā)病率近交系小鼠（ SWR ）； （4）某些快速鑒定情況下，選高癌發(fā)病率近交系小鼠（A系小鼠）； （5）實驗?zāi)[瘤學研究，實驗動物為對象，使用近交系或突變系動物為宜：便于實驗操作，動物實驗結(jié)果準確、均一，資料全面、經(jīng)濟，有可能重復再現(xiàn)。 腫瘤移植學，腫瘤免疫學、化學致癌研究，注意各實驗動物品系遺傳性狀方面的特征。 無菌與悉生動物： 老年醫(yī)學研究理想模型。無菌環(huán)境排除微生物感染干擾，研究生命終點成為現(xiàn)實。NIH estimates of funding for v

11、arious disease ,research areas Research/disease areas 2003 2004 2005(dollars in millions) actual actual actualAcute respiratory disease S77 S72 S75Aging 2211 2343 2403Alzheimers disease 658 633 647Anthrax 219 249 207Arthritis 380 374 383Basic behavioral and social science 938 1052 1076Cancer 5432 55

12、47 5643Cardiovascular 2286 2360 2409 研究證實：無菌大鼠心、肺、腎、腦等都沒有與年齡相關(guān)病變，普通級大鼠則有。普通大鼠壽命平均2年左右，無菌大鼠壽命3-4年，微生物與機體老化有關(guān)。心血管方面：許多心血管病與機體膽固醇代謝密切相關(guān)，腸道微生物直接影響膽固醇代謝。實驗證實，微生物在調(diào)節(jié)膽固醇水平方面及膽汁酸肝腸循環(huán)中起重要作用。 GF和GN與CV在結(jié)構(gòu)功能上有較大差異，獨具一些特點： （1）心、肝、肺較小，基礎(chǔ)代謝率、心輸量及組織血供量較低，免疫系統(tǒng)發(fā)育不良； （2）腸蠕動和小腸上皮細胞脫落較慢，結(jié)腸內(nèi)容物和糞便較??； （3）pollard發(fā)現(xiàn)，GF和GN大、小

13、鼠，某些類型癌發(fā)病率下降； （4）CV大鼠極為罕見前列腺癌在GF大鼠中卻很常見，人類前列腺癌研究提供了一個有用模型；（5）GF大、小鼠所發(fā)生惡性腫瘤幾乎全部在內(nèi)分泌系統(tǒng)和激素作用組織。GF和CV在在內(nèi)分泌系統(tǒng)活動功能上有差別，存在環(huán)境致癌因子作用； （ 6 ）采用系統(tǒng)無菌技術(shù)可除去這些因子，形成一個防護屏障，使個體不受這些因子危害；（7）癌病毒病因?qū)W，可用GF進行研究和檢驗；（8）化學致癌中實驗動物體內(nèi)菌群能影響致癌過程：產(chǎn)生和破壞致癌物；干擾機體對致癌物解毒功能；改變致癌物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)；加快腸道排空速度，影響致癌物吸收。 人結(jié)腸癌與環(huán)境因素密切相關(guān)，腸道菌群與進入腸道的環(huán)境中物質(zhì)關(guān)系正在研究。

14、 無胸腺大、小鼠： 1966年，英國愛丁堡動物所Flanagan發(fā)現(xiàn)裸小鼠。表現(xiàn)為：全身無毛，先天性無胸腺，T淋巴細胞缺失，細胞免疫功能缺陷，對異體移植物無排斥反應(yīng)，可接受異體腫瘤移植。人類腫瘤異體移植此前基本不可能成活，在某些特殊條件下-動物經(jīng)放射線照射，可的松處理，胸腺摘除或給予抗淋巴細胞抗體等措施，偶然得以成活。發(fā)現(xiàn)裸鼠，建立可移植性人體腫瘤數(shù)百種，瘤株能防止由傳代而伴隨腫瘤組織形態(tài)學退化，保持原代細胞各種功能。裸鼠原種抵抗力差，生育力低，壽命短，不能用于實際，與純系BALB/C、NIH和C3H小鼠交配，不斷繁育，獲得幾種近交系無胸腺裸鼠新種。目前繁殖裸鼠不用nu/nu雌鼠，因其繁殖性能

15、低，一般采用雜合子交配方式或隱性純合子雄性與雜合子雌鼠交配。此交配方法，其后代將出現(xiàn)表現(xiàn)型正常的仔鼠和裸鼠，比例為1：1。 純合性雌裸鼠（nu/nu）受孕率低，乳腺發(fā)育不良，且有食崽習慣。一般采用純合性雄鼠與雜合性雌鼠（nu/+）交配，可獲的1/2純合性后代。裸小鼠年齡增長或一些因素影響（病毒感染等），裸鼠體內(nèi)正常T細胞增加，影響接種，一般選用4-8Wk。新型免疫缺陷動物： 皮下移植于裸鼠人類惡性腫瘤，外科手術(shù)標本或體外培養(yǎng)細胞，原宿主體內(nèi)是否轉(zhuǎn)移，僅表現(xiàn)成活，低轉(zhuǎn)移或不轉(zhuǎn)移，形成局限性腫瘤，不易擴散。 提高裸鼠體內(nèi)人類腫瘤轉(zhuǎn)移性，改變宿主狀態(tài)做大量工作：應(yīng)用三周內(nèi)幼鼠；附加各種射線照射；各種

16、免疫抑制劑；提高裸鼠飼養(yǎng)潔凈度減少Ag刺激，不滿意。 世界各國相繼培育出一系列免疫缺陷A：從單一T細胞功能缺陷到T、NK細胞（Beige-nu mice）缺陷，T、B細胞以及T、B 、NK細胞聯(lián)合缺陷動物，腫瘤轉(zhuǎn)移模型建立了新宿主A和研究工具。 T、NK細胞缺陷的Beige-nude Mice： 13號染色體缺陷。孫靖等將有T細胞缺陷無胸腺nude Mice Nu gene導入NK細胞缺陷 beige -Mice，育成T、NK細胞功能聯(lián)合免疫缺陷beige-Mice，其體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤顯著高于裸鼠組。 91年9月召開的第七屆國際免疫缺陷A研討會，引人注目一項發(fā)展是用人體淋巴細胞改建的Scid mic

17、e 研究人類免疫缺陷型病毒（HIV）感染模型。 T、B細胞聯(lián)合缺陷Scid mice（Serious Conjunctive immune deficiency）： （DNA-PKcs：DNA依賴性蛋白催化亞單位基因缺陷）-16號染色體影響淋巴細胞抗原受體催化亞單位基因突變，編碼結(jié)合點斷裂。接受人類腫瘤移植后，成活率高，易于發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，在白血病和淋巴瘤的研究中更為突出，其病理過程和與人白血病的臨床過程極為相似。 過去靠臨床觀察、體外實驗或無免疫缺陷動物研究人免疫系統(tǒng)。人免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復雜，功能繁多，影響面廣，體外實驗完全沒有體內(nèi)實驗的整體效果，實驗動物又與人存在著巨大種質(zhì)差異，敏感性不同。尋

18、找廉價、簡單適用人免疫研究動物模型是生物醫(yī)學者目標。Orthotopic xenotransplantation（原位異種移植）： 人癌移植到與腫瘤原位部位相對應(yīng)的裸鼠器官組織內(nèi)，使其獲得與人癌相似微環(huán)境。 Scid mice-腹腔注射胎肝活細胞人胎肝活細胞Scid小鼠模型。注射胸腺細胞-人胎肝活細胞Scid小鼠模型(1)。再注射胸腺細胞-人胎肝活細胞Scid小鼠模型（2）。（1）、（2）進行人肝癌細胞免疫初始免疫反應(yīng)。模型（1）、（2）抗體最高滴度出現(xiàn)時間無顯著差異；出現(xiàn)水平差異顯著（2）（1）。8只Scid 小鼠建模后4個月未出現(xiàn)瘦弱、貧血與死亡，無GVHR。 人肝癌移植在Scid 小鼠和

19、BALB/C裸小鼠皮下生長結(jié)果人癌細胞瘤 n 成瘤率 瘤體積/立方厘米 n 成瘤率 瘤體積 SCID BALB/C-nu/nuH128小細胞肺癌 51 90.2 16.5+8.1 26 57.7 6.3+2.9SGC-7901胃腺癌 14 100 13.7+4.2 12 100 4.7+1.6U251腦瘤 10 100 8.4+2.7 10 100 4.3+1.8 轉(zhuǎn)基因技術(shù)和Scid 小鼠制作轉(zhuǎn)基因免疫缺陷（癌基因插入Scid），不需移植腫瘤活組織或腫瘤細胞懸液，避免淋巴細胞潛在的感染，小鼠有高癌癥發(fā)生率、轉(zhuǎn)移率，研究免疫系統(tǒng)對腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移理想模型。 動物腫瘤模型的選擇 自發(fā)性腫瘤模型 特

20、點：與實驗方法誘發(fā)腫瘤相比，所患腫瘤與人更相似。有利將動物實驗結(jié)果推用到人，著重觀察遺傳因素在腫瘤發(fā)生方面作用。 缺點：腫瘤發(fā)生情況參差不齊，不可能在短時間內(nèi)獲得大量腫瘤學資料，觀察時間較長，實驗耗費較大，不易同時獲得大批病程相似自發(fā)瘤模型。用AKR小鼠進行化療研究，該鼠出生1年半內(nèi)有高于90%的發(fā)病率，已用于綜合化療研究-藥物誘導緩解和維持緩解最佳方案篩選。 AKR小鼠出生時即帶致癌RNA病毒，鼠齡6-13個月，每月自發(fā)瘤死亡率為15-20%，為化療提供了基礎(chǔ)知識。 誘發(fā)性腫瘤模型 化學致癌物、射線或病毒在各類動物中誘發(fā)不同類型腫瘤。強化學致癌物二甲基苯蒽（DMBA）可誘發(fā)乳癌；二乙基硝胺（

21、DEN）0.005%摻入飲水中口服8個月可誘發(fā)大鼠肝癌（在誘發(fā)期，腫瘤形成之前觀察藥物抗致癌。與人腫瘤細胞動力學特征有相似之處，綜合化療或腫瘤預防方面研究。 特點：致癌性強，小劑量一次給藥即可致癌；多種癌（包括猴、豚鼠等不易誘發(fā)腫瘤動物）致癌，通過胎盤致癌 -給懷孕大鼠二乙基亞硝胺，較快引起崽鼠發(fā)生神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤；黃曲霉素最小致癌劑量比亞硝胺小數(shù)十倍，已知化學致癌劑中作用最強：滴入氣管引起肺林制鱗狀細胞癌；注如入皮下可引起局部腫瘤。 移植性腫瘤模型 接種瘤細胞或無細胞濾液（病毒性腫瘤），腫瘤化療應(yīng)用大多數(shù)藥物，過去經(jīng)動物移植性腫瘤試驗被發(fā)現(xiàn)，篩選抗腫瘤新藥中最常用模型。 特點 ：接種一定量瘤細

22、胞或無細胞濾液，使一群動物帶有同樣腫瘤：生長速率較一致、個體差異小，接種存活率近100%。對宿主影響類似，易于客觀判斷療效，在同種或同品系動物中連續(xù)移植，長期保存供實驗之用。實驗周期一般較短，各種實驗?zāi)[瘤、腹水瘤及白血病等均廣泛采用。 缺點：腫瘤生長速度快，增殖比率高，體積倍增時間短，與人顯著不同，與人實體瘤有 差異。世界近500多種移植瘤，常篩選40種，多數(shù)為小鼠腫瘤。 人體腫瘤異種移植性模型 將人體腫瘤移植于免疫缺陷動物，保持其生物學特征，研究人體腫瘤對藥物敏感性有很大幫助，受到多方面重視。 裸鼠直接作為人體腫瘤異種移植接受體，不需進行“附加因子”作用（切胸腺900Rad大劑量輻射2h抗淋

23、巴細胞血清，難成功） 。 用免疫缺陷動物，人體腫瘤移植生長良好：腫瘤細胞形態(tài)、染色體含量、同功酶的水平與人體腫瘤一樣未發(fā)生細胞選擇和細胞雜交現(xiàn)象，細胞動力學和生化特征也未變，實驗治療方面研究報道明顯增多。 裸鼠生殖生理及生長特點知識積累，提高供應(yīng)問題制定出一整套飼養(yǎng)、繁殖和具體管理辦法?；钅[瘤對化療藥物敏感性與臨床所見十分相似。胸腺嘧啶核苷444-888mg/Kg給腫瘤裸鼠連續(xù)灌注90-140小時，明顯抑制人體黑色素瘤及畸胎瘤生長，導致腫瘤消退，對宿主無明顯毒性，引起臨床重視。將人癌組織植入裸鼠腎囊膜內(nèi)，觀察腫瘤生長大小，顯微鏡下測量腫瘤直徑OMU，比較給藥組與對照組差異，11天即可得到藥物療效結(jié)果。 癌癥轉(zhuǎn)移比預想的早癌癥轉(zhuǎn)移是最終引起大多數(shù)癌癥患者死亡的疾病進程。學術(shù)界一直認為“轉(zhuǎn)移是癌癥進展中的一個晚期事件”，即在原發(fā)腫瘤細胞積累一系列基因變更之后才啟動癌癥基因。動物實驗結(jié)果提示：腫瘤轉(zhuǎn)移肇端于疾病早期。它們在器官轉(zhuǎn)移處保持休眠狀態(tài)癌癥基因被啟動時變?yōu)榘┘毎?。試驗步驟：小鼠注射正常乳腺癌細胞注射后不同時間激活某些癌癥基因。發(fā)現(xiàn)：乳腺癌細胞基因激活前即通過血液循環(huán)行進到肺部存活16周，不表達任何腫瘤基因。癌細胞在腫瘤基因激活前在肺中不會活躍生長。研究目的：今后對癌癥轉(zhuǎn)移過程每一步驟進行調(diào)查，找